En protokoll for strukturell analyse av polysakkarider av gel geleelektroforese (TEMPO), bruke mannan som et eksempel, er beskrevet.
Anlegget cellen vegg polysakkarider er notorisk vanskelig å analysere de fleste metodene krever dyrt utstyr, dyktige operatører og store mengder renset materiale. Her beskriver vi en enkel metode for å få detaljert polysakkarid strukturelle informasjon, inkludert oppløsning av strukturelle isomerene. For polysakkarid analyse av gel geleelektroforese (TEMPO) hydrolyzed cellevegg plantemateriale med glycosyl hydrolases gjelder for polysakkarid av interesse (f.eks mannanases for mannan). Stort format polyakrylamid gels brukes deretter til å skille de lanserte oligosaccharides, som er fluorescently merket. Gels kan visualiseres med en modifisert gel tenkelig system (se Tabell for materiale). Resulterende oligosaccharide fingeravtrykket kan enten sammenlignes kvalitativt eller, med replikering kvantitativt. Sammenhengen og forgrening informasjon kan etableres ved hjelp av flere glycosyl hydrolases (f.eks mannosidases og galactosidases). Mens denne protokollen beskriver en metode for å analysere glucomannan struktur, kan det brukes på alle polysakkarid som preget glycosyl hydrolases finnes. Alternativt kan det brukes til å karakterisere romanen glycosyl hydrolases bruker definerte polysakkarid underlag.
Polysakkarid analyse av gel geleelektroforese (TEMPO) er en metode for detaljert karakterisering av polysakkarider1,2,3. Anlegget cellen vegg polysakkarider er notorisk vanskelig å analysere de fleste metodene krever dyrt utstyr, dyktige operatører og store mengder renset materiale. Her beskriver vi en enkel metode for å få detaljert polysakkarid strukturelle informasjon, inkludert oppløsning av strukturelle isomerene.
Forståelse anlegget cellen vegg polysakkarid struktur er nødvendig for disse forskerne å utforske anlegget cellen vegg biosyntesen eller rollen anlegget cellen vegg i anlegget utvikling. Nylig imidlertid har anlegget cellen vegg sammensetning blitt interessant å en bredere gruppe forskere på grunn av fokuset på bruke anlegget biomasse (i hovedsak cellen vegg) som råstoff til å produsere biodrivstoff og biokjemikalier4. Som et eksempel krever effektiv enzymatisk saccharification av dette materialet en detaljert forståelse av polysakkarid strukturer, slik at optimalisert enzymatisk cocktailer kan valgte5.
PACE har flere fordeler over alternativ metoder som gjør det ideelt for rask analyse av komplekse glycan strukturer. Først, den ikke krever rensing av polysakkarid i spørsmålet, er nødvendig for løsning staten kjernefysiske magnetisk resonans (NRM)6. Dernest TEMPO kan løse strukturelle isomerene, i motsetning til massespektrometri (MS, f.eks matrix-assistert desorpsjon/ionisering (MALDI) og electrospray ionization (ESI)), som kan også være utfordrende for å utføre av flytende kromatografi (Langbane) 7. det tredje TEMPO er veldig følsom, med lav-picomole oppløsning, i motsetning til tynne lag kromatografi (TLC) eller papir kromatografi. Til slutt, den ikke krever dyrt utstyr eller spesialist kunnskap, som er tilfellet for MS, NMR og LC.
Metoden TEMPO er avhengig av spesifisitet av glycosyl hydrolase (GH) enzymer som målrette bestemte glycosidic sammenhengene i en blanding av polysakkarider. Når GH enzymet fungerer på polysakkarid kjeden, avslører det en redusert slutten som kan deretter bli kjemisk derivatized, i dette tilfellet med et fluorescerende plateselskap. Den unhydrolyzed delen av prøven gjengis derfor undetectable av denne metoden. De merket oligosaccharides skilles deretter i et stort format akrylamid gel med geleelektroforese. Dette gir utmerket oppløsning på veldig like molekyler, for eksempel trisaccharides Glc-mann-mann og Glc-mann-Glc har en annen Rf.
PACE har vært brukt mye å karakterisere ulike xylan strukturer over plante arter8, for å identifisere glycosyltransferase mutanter i Arabidopsis6,9,10,11 , utføre glycosyltransferase analyser9og å karakterisere romanen GH aktiviteter12,13. Vi har også nylig brukte det som kjennetegner gjær cellevegg mannan (Mahboubi og Mortimer, forberedelse). Her beskriver vi en metode for å karakterisere anlegget cellen vegg glucomannan struktur, basert på tidligere rapporter11,14.
TEMPO er en enkel metode for å karakterisere polysakkarid struktur. Det kan brukes til alle polysakkarid som det er kjent GHs preget aktivitet, kan du se mange eksempler i litteratur1,6,9,11. TT er også brukt på karakterisering av romanen GHs12,13,18 og glycosyltransferases9, ved å bruke definerte polysakkarid underlag og acceptors.
Reproduserbare, interpretable resultater er avhengig av tre viktige trinn. Først bør GHs brukes være fri fra forurensende aktiviteter. Dette er best oppnås ved bare å bruke heterologously uttrykt, affinitet renset enzymer. Andre, for de fleste eksperimenter er det viktig at enzymatisk hydrolyse av substrater ved fullføring. Dette sikrer at samme biomasse hydrolyzed med den samme GH gir samme fingeravtrykket i hvert eksperiment. Til slutt, bør det være et overskudd av fluorophore i derivatization reaksjonen. Dette sikrer at tilgjengelig redusere endene er merket på nær 100%. Dette vil resultere i høy reproduserbarhet resultater, i tillegg til kvantitative data.
Gel og reagens kvalitet er avgjørende for å sikre reproduserbar data. Dårlig kvalitet buffere, spesielt av feil pH, luftbobler i gel, og eksempler med en salt kan alle påvirker oppløsningen og oppbevaring faktor av oligosaccharides. Inkludering av anbefalte kontrollene beskrevet under protokollen og resultatene vil imidlertid aktivere feilsøking.
TEMPO er begrenset av dens evne til å identifisere oligosaccharides. For noen eksperimenter er et enkelt fingeravtrykk alt som er nødvendig. Men for å virkelig quantitate mengden av glucomannan i en prøve av luft, for eksempel identiteten til alle utgitt oligosaccharides er nødvendig, som er en tidkrevende prosess. Dette er enklere for mindre komplekse polysakkarider som xylan3. Siden det er få oligosaccharide standarder kommersielt tilgjengelig, kan det ikke alltid være mulig eller ønskelig å identifisere alle feltene. I dette tilfellet kan TEMPO gi helt gratis data massespektrometri (dvs. MALDI-CID9 eller ESI-MS7og NMR6). For disse metodene er det ofte nyttig å gjøre en storstilt forberedelse, Skill med størrelse-utestenging Ture, og deretter analysere hver fraksjon av både TEMPO før MS eller NMR. Mens det har blitt rapportert at band kan forbrukeravgift og identifisert av MALDI-CID, i praksis har vi funnet at dette har en lav rate suksess (muligens på grunn av interaksjoner av merket oligosaccharides med akrylamid gel utsettes for UV lys).
Den andre store begrensningen av TEMPO er gjennomstrømning. For å ha god kvalitet, interpretable gels med riktige kontroller, hver gel vil bare ha ~ 10 eksperimentelle prøver, og en forsker kan forvente å kjøre ~ 4 TEMPO gels per dag. En versjon av TEMPO ved hjelp kapillært geleelektroforese (CE) har nylig vært utviklet19, hvilke innrømmer forberedelse av prøver i 96-brønnen plater. Det har blitt brukt med hell å karakterisere glycosyltransferase enzym aktiviteter og polysakkarid strukturer6,19, selv om det krever tilgang til en CE maskin som kan være dyrt å kjøpe og vedlikeholde.
The authors have nothing to disclose.
TEMPO metoden ble utviklet og optimalisert av ulike medlemmer av gruppen Dupree (University of Cambridge, UK) gjennom årene, og vi setter pris på alle sine bidrag. Dette arbeidet ble finansiert som en del av DOE felles bioenergi Institute (http://www.jbei.org) støttet av US Department of Energy, Office of Science, Office av biologiske og miljøforskning, gjennom kontrakten DE-AC02-05CH11231 mellom Lawrence Berkeley National Laboratory og US Department of Energy. Vi takker også Thea plukke og Vy Ngo for hjelp med å forberede csla9 prøvene.
Oligosaccaharide Standards | |||
Mannose | Sigma-Aldrich | CAS 3458-28-4 | |
Mannobiose | Megazyme | CAS: 14417-51-7 | |
Mannotriose | Megazyme | CAS: 28173-52-6 | |
Mannotetraose | Megazyme | CAS: 51327-76-5 | |
Mannopentaose | Megazyme | CAS: 70281-35-5 | |
Mannhexaose | Megazyme | CAS: 70281-36-6 | |
Glucomannan (Konjac; Low Viscosity) | Megazyme | P-GLCML | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Other specialty chemicals | |||
8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid | (Molecular probes) Thermo | A350 | |
2-picoline borane | TCI | B3018 | |
40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis) | Bio-rad | 1610146 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Specialty Equipment | |||
Gel casting kit | Hoefer | SE660 kit | 18×24 cm glass plates, 0.75 mm spacers |
Cooling recirculating water bath | Hoefer | RCB20-plus 115v | Needs to be able to maintain temperature at ~10 C |
G:Box Chemi XRQ Imaging System | Syngene | 05-GBOX-CHEMI-XRQ | Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs |
High Voltage Power Pack | Thermo | EC1000XL | 1000V |
Vacuum centrifuge(Speedvac) | Savant | SPD131 | |
Vertical Gel electrophoresis system | Hoefer | SE660 | |
Glycosyl hydrolases | |||
These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group. | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lab supplies | |||
15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-918 | |
50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) | VWR | 21008-951 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Gel imaging software ( Genesys) | Syngene |