Summary
Descrevemos as medidas diversas para implante de silicone crônica sondas e gravar lugar células em ratos que são cabeça running-fixo em um aparelho de esteira cue-enriquecido.
Abstract
Um requisito importante para a compreensão do funcionamento do cérebro é a identificação do comportamento e atividade das células correlaciona. Sondas de silicone são avançadas eletrodos para gravação eletrofisiológico em larga escala da atividade neuronal, mas os procedimentos para sua implantação crônica são ainda subdesenvolvidos. A atividade das células do hipocampo lugar chama-se correlacionar com a posição do animal no ambiente, mas os mecanismos subjacentes não são ainda claras. Para investigar o lugar células, aqui descrevemos um conjunto de técnicas que vão desde a fabricação de dispositivos para sonda de silicone crônica de implantes para o monitoramento da atividade de campo lugar em um aparelho de esteira cue-enriquecido. Uma unidade de microe um chapéu são construídos por encaixe e fixação juntos as peças de plástico 3D-impresso. Uma sonda de silicone é montada na unidade micro, limpos e revestida com corante. Uma primeira cirurgia é realizada para corrigir o chapéu no crânio de um rato. Pequenos pontos de referência são fabricados e anexados ao cinto de uma escada rolante. O mouse é treinado para executar cabeça-fixo na esteira. Uma segunda cirurgia é realizada para implantar a sonda de silicone no hipocampo, que banda larga sinais eletrofisiológicos são registrados a seguir. Finalmente, a sonda de silicone é recuperada e limpo para reutilização. A análise da atividade das células lugar na esteira revela uma diversidade de mecanismos de campo, o benefício da abordagem de estrutura de tópicos.
Introduction
Sondas de silicone apresentam diversas vantagens para gravações eletrofisiológicas, incluindo o fato de que eles são projetados com perfis afiadas, minimizando danos nos tecidos e que apresentam um layout preciso de densamente gravação sites1, 2,3,4. Eles são usados para estudar vários sistemas em diferentes espécies, incluindo5,seres humanos3,6, com diversas abordagens1,7. Ainda, seu uso recorrente é ainda relativamente limitado por causa de seu custo, fragilidade e o fato de que métodos convenientes para experimentos crônicos faltam8. Recentes avanços na tecnologia de impressão 3D tornaram possível o projeto personalizado de dispositivos como unidades de micro e cabeça-placas para permitir uma manipulação mais fácil desses eletrodos delicados. Em uma primeira etapa, descreveremos como construir e usar um conjunto de ferramentas que desenvolvemos para a implantação de silicone crônica sondas14.
Enquanto lugar de células são tipicamente estudadas usando animais movimentando-se livremente, correr em labirintos, recentemente eles foram também investigados em ambientes virtuais15 e na esteira apparatii9 (figura 1A). Estes métodos experimentais oferecem a vantagem de que os animais podem ser cabeça-imobilizados, fazendo o uso de microscópio 2-fóton15, remendo-braçadeira16e optrode9,10,11 técnicas mais fácil, além de proporcionar maior controle sobre comportamento animal e pistas ambientais12. Em uma segunda etapa, apresentaremos os procedimentos para a formação de ratos e atividade de célula de lugar de gravação em um aparelho de esteira.
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Protocol
todos os métodos descritos foram aprovados pelo Comitê de uso do Instituto de Coreia da ciência e tecnologia e cuidado Animal.
1. preparando a unidade de Micro e eletrodo
- montar o micro drive.
- Imprimir as peças do micro-drive (controle deslizante, corpo e shell) 14 usando uma impressora 3D de alta resolução. Certifique-se as peças sem defeitos.
- Consertar o controle deslizante para o corpo de micro-drive com um parafuso (tamanho 000-120 x 1/4).
- Soldar uma porca (tamanho 000-120 120 000/64 Hex) para a ponta do parafuso.
- Gire o parafuso no sentido horário para mover o controle deslizante até ou anti-horário para movê-lo para baixo.
- Corrigir o shell para o corpo com um parafuso (tamanho 000-120 x 1/4).
- a sonda de montagem na unidade micro.
- Reparar o micromovimentação na posição horizontal, sob um microscópio binocular.
- Use um agrafo plana com enchimento de borracha para pegar o cabo flex da sonda silício, enquanto desanexando cuidadosamente a sonda do gabinete da expedição com fórceps. Fixar o grampo de jacaré para um manipulador.
- Usando o manipulador, colocar a sonda de silicone no controle deslizante micro drive, paralelamente à direção do movimento.
- Aplicar uma gota de cimento dental (temperatura de cura acrílica dental reparar material) para fixar a sonda para o controle deslizante. Corrija a posição da sonda se mudou. Cola não é recomendada, pois ele cura muito rápido e torna difícil reajustar a posição do eletrodo.
- Consertar o conector da sonda para o C-suporte (suporte conector) com cimento dental.
- Limpeza e colocar corante na sonda.
- Fix a sonda/Microdrive assemblage no dispositivo de limpeza de sonda. O dispositivo é equipado com 2 pequeno giro esponjas de espuma (amostras não-estéril). Ajustar a lacuna por manipulator.
- Embeber as esponjas com detergente.
- Mova lentamente a sonda em cima e para baixo entre as esponjas, que permite um toque suave. Monitorar o processo de limpeza sob um microscópio.
- Lavar a sonda com água destilada. Mergulhe a sonda em álcool para esterilização.
- Aplicar Dil (corante lipofílico fluorescente) na parte de trás dos desvios da sonda, usando um cotonete de espuma. Isto permitirá a visualização dos locais de haste no cérebro em uma fase posterior.
- Montagem do chapéu
- imprimir as peças do chapéu (cabeça-placa, titular de conector e tampa) 14 usando uma impressora 3D. As 3 partes se encaixam para formar um gabinete selado.
- Inserir porcas (tamanho M2 e 00-90 90 00/4) nas ranhuras da cabeça-placa e fixar com cola e cimento dental.
- Inserir uma anilha na ranhura da tampa e fixe com cimento dental.
2. Cirurgia para fixação do chapéu no crânio
todas as ferramentas utilizadas para a cirurgia são esterilizadas previamente em autoclave. É utilizado um dispositivo de grânulos de calor seco forto esterilizar ferramentas que tornam-se contaminadas e precisam ser esterilizados durante a cirurgia.
- Definir o nível de isoflurano para 4% para o início da anestesia. Coloque o mouse na câmara de anestesia 5 min.
- Instalar o mouse em um aparelho estereotáxica.
- Reduzir o nível de isoflurano 1,5-2%. Ajustar o nível durante a cirurgia de acordo com o estado animal, taxa de respiração e corpo temperatura 20.
- Aplicar a pomada sobre os olhos.
- Raspar o couro cabeludo e limpar a cabeça do animal com anti-séptico (iodopovidone). Manter condições assépticas durante todas as etapas da cirurgia.
- Inject bupivacaína (1 mg/kg), sob o couro cabeludo. Cortar e remover parte da pele da cabeça do mouse usando a tesoura bem para expor o crânio em suas bordas parietal. Usar soro fisiológico e uma esponja hemostática de limpar e controlar o sangramento durante a cirurgia.
- Remover o periósteo usando uma ferramenta de raspador.
- Encontrar os pontos de referência sobre o crânio 21: bregma, lambda, coronal e sagital sutura. Ajustar a cabeça ' s ângulo ao longo do eixo sagital, tal que o Bregma e o lambda pontos estão à mesma altura.
- Dois furos (~0.5 mm de diâmetro) no crânio para os eletrodos de referência e o chão. Os furos devem ser de aproximadamente 1 mm caudal e lateral de 1 mm do Lambda.
- Os eléctrodos do chão e referência (tamanho miniatura 000-120 000-120/16 aço inoxidável parafusos fio acoplados aos conectores de pino).
- Aplicar raios ultravioleta (UV) ativador de dentina no crânio de ligação e em seguida, aplicar a luz UV para s. 45-60
- Aplique uma camada de cimento dental nas bordas do crânio. Evitar a propagação de cimento sobre a pele e os cabelos dos ratos.
- Fixe a chapa de cabeça para um manipulador estereotáxica e posicione-o acima do crânio. Lentamente Abaixe a cabeça-placa até toca ligeiramente o crânio e aplique o cimento dental na junção com o crânio. Deixe-a cura do cimento dental durante 15 min.
- Remover a anestesia. Consertar um conector-titular e um boné na cabeça-placa. Coloque o mouse em sua jaula depois de dar uma injeção sub-cutâneo de ketaprofen 5 mg/kg
- Dar injeções sub-cutâneo de ketaprofen 5 mg/kg para os dois próximos dias e monitor cuidadosamente por qualquer sinal de dor. Os ratos normalmente acordam da anestesia dentro de 20-40 min. O implante de chapéu é relativamente luz (3,34 g), tal que os ratos não têm problemas para levantar sua cabeça, correr em labirintos e subir nas bordas de sua gaiola em casa.
3. Treinamento comportamental
- após um período de recuperação pós-operatório de 7 dias, iniciar a restrição de água a 1 mL por dia.
- Para fazer o cinto de esteira, corte um pedaço de tecido de veludo (5 cm por 1-2 m) e consertar pequenos objetos nele usando cola quente. Anexar objetos erigidos nas bordas da correia para não interferir com o movimento do mouse.
- Fixar o cinto nas rodas da esteira de sutura juntos nas duas extremidades.
- Instalar o mouse de cabeça-fixo na esteira inserindo e apertar os dois parafusos da placa de cabeça nas ranhuras da placa de fixação de cabeça.
- Iniciar o mouse para correr de cabeça-contido na esteira para a recompensa de água de formação. Entrega a recompensa de água através de uma porta de lamber. Inicialmente, coloque o mouse sobre a esteira por períodos de 10 minutos, 3 vezes por dia.
- Conforme o mouse se acostuma com a cabeça-fixação e começa a se mover a cintura (normalmente depois de ~ 3 dias), aumentar o treino duração de 30 min. Após 2-3 semanas, alguns ratos executar mais de 100 ensaios em 30 min (uma prova ser uma rotação completa do cinto).
- Escolher os ratos apresentando as melhores performances comportamentais para os experimentos de gravação.
4. Implantação da sonda silício
- colocar o rato sob anestesia.
- Instalar o mouse no aparato estereotáxica, fixando a placa-de-cabeça. Limpe a superfície do crânio com solução salina.
- Encontrar marcadores estereotáxicos: bregma, lambda, coronal e sagital sutura. Medir a distância até o ponto de inserção e marcá-lo
- Perfurar o osso cuidadosamente até que se torne fina e transparente. Umedecer e limpe com soro fisiológico durante a perfuração.
- Remover cuidadosamente o osso diluído e a dura-máter usando força de precisãoPS. Mantenha a superfície do cérebro molhado com soro fisiológico, o tempo todo.
- Corrigir a montagem de sonda Microdrive/silício para um manipulador estereotáxica. Traga a sonda de silicone acima a craniotomia. Dane-se o titular de conector de sonda de silicone na cabeça-placa.
- Ligar os eléctrodos de terra/referência e amplificador de gravação. Escudo do mouse com folha de alumínio para proteger de ruído eletromagnético. Iniciar o sistema de gravação para monitorar a atividade elétrica do cérebro.
- , Lentamente, introduzir a sonda de silicone no cérebro usando o micromanipulador. Verificar continuamente os sinais elétricos, a distância de manipulador viajado e os desvios da sonda (certifique-se que penetram no cérebro). Actividade da unidade é visível no córtex enquanto matéria branca por baixo é relativamente silenciosa. Actividade da unidade reaparece quando as canelas de tocar a camada piramidal do hipocampo. A partir deste ponto, retrair o silício sonda 200 µm (usar o micro-drive no dia seguinte para trazer a haste de volta para a camada piramidal).
- Cobrir a superfície do cérebro com uma mistura de cera para osso e óleo mineral.
- Consertar o micro-drive para a placa de cabeça usando cimento dental. Deixe a cura do cimento dental por 15 min. Então desanexar o microcarro do manipulador estereotáxica e ponha a chapéu boina.
- Colocar o mouse de volta à sua jaula e dar uma injeção sub-cutâneo de ketaprofen 5 mg/kg. Verifique se há qualquer sinal de dor. Esta cirurgia é muito menos invasiva do que a primeira e ratos são normalmente ativos dentro de 45 min, depois eles acordar da anestesia. No entanto, deixe o mouse recuperar um dia inteiro, como a sonda de silicone precisa estabilizar no cérebro.
5. Gravação de
- instalar o mouse cabeça fixa na esteira. Remova o boné chapéu
- Ligar o amplificador de gravação e iniciar a gravação.
- No primeiro dia, usar o micro-drive para mover a sonda de silicone para a camada piramidal do hipocampo. Cada volta anti-horário do parafuso move o shanks 200 µm mais profundo. Ajustar a posição da haste lentamente (~ 20-50 µm de cada vez) até que apareçam ripple oscilações 13 e unidade atividade.
- Nos próximos dias, ajustar a posição da haste e esperar ~ 1 h antes da gravação da atividade hippocampal enquanto o mouse é executado no cinto. Para manter a qualidade de sinal boa gravação por vários dias, remover objectos duros e baixo teto do mouse ' gaiola s para minimizar a possibilidade do chapéu solavancos em superfícies duras.
6. Recuperando a sonda
- colocar o rato sob anestesia.
- Instalar o mouse no aparato estereotáxica, fixando a placa-de-cabeça. Remova o boné chapéu
- Trazer manipulator estereotáxica logo acima do micro-drive. Conserte o micro-drive para o manipulador. Desaperte o porta-conector da placa de cabeça. Remova o parafuso conectando a concha e o corpo do micro-drive.
- Sob a supervisão do microscópio binocular, lentamente levante a montagem de microunidade / silicon sonda com o manipulador estereotáxica, deixando a parte casca.
- Limpe a sonda de silicone com o dispositivo de limpeza.
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Representative Results
Um rato primeiro foi treinado para ser executado em uma correia longa de dois metros desprovido de tacos (Figura 1). Pós-implante de eletrodo, uma nova correia do mesmo comprimento, mas apresentando 3 pares de sugestões foi instalado na esteira, a fim de gerar representações espaciais de allocentric12,14. Sinais de banda larga foram registrados a uma taxa de amostragem de 30.000 Hz, usando um sistema de 250 canais de gravação (placa de amplificador com placa de interface USB e interface de Labview Custom-Made) e duas sondas de silicone (figura 1A, 4 patas, 8 sites por shanks) implantadas em CA1 e CA3 (figura 1B). As unidades foram detectadas utilizando uma função de limiar, os sinais de filtrado passa-alta (0,8-5 kHz). Isolamento de célula foi realizado usando um pico semi-automática classificação método15,16,17. O movimento para diante/para trás da esteira foi monitorizado usando LED e foto-sensor casais e gravada por canais de entrada Digitas do sistema de gravação.
Uma média de células 148±35 (mean±s.e.m) pode ser isolada em cada sessão, entre os quais 38.4±3.5% apresentaram atividade de campo claro lugar (Figura 2). Os campos do lugar eram relativamente estáveis em muitos ensaios, em qualquer o dia inicial da gravação (Figura 2A) ou após vários dias de exposição ao cinto marcado (Figura 2B e Figura 2). Diferentes tipos de representação espacial podem ser discernidos. Algumas células mostraram repetidas lugar campos correlacionados com a identidade do sinais (Figura 2A), enquanto outras células mostraram um lugar único de campo (Figura 2)12. Daí, podemos gravar células hippocampal lugar durante vários dias e identificar uma diversidade de mecanismos de campo, dois requisitos importantes para estudar os mecanismos e dinâmicas associadas a memória, aprendizagem e navegação espacial.
Figura 1: aparelho de sonda e esteira de silicone. (A) layout de Shank e site da sonda de silicone. (B) local de implantação. (C) aparelhos de esteira e layout das indicações sobre o cinto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: gravação crônica das células local. (A) cor codificada representação dos campos de lugar (em cima), spike auto-correlogram (inferior esquerdo) e spike formas de onda (canto inferior direito) para um exemplo de célula gravada no dia 1. (B-C) Mesmo que (A) para exemplos de células gravado no dia 3 (B) e 5 (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Gravação crônica da atividade neuronal é fundamental para a compreensão de processos neurais como lugar hippocampal campos. Nossa abordagem para executar implantantation de sonda de silicone crônica se distingue de outros métodos7,18,19,20 pelo fato de que é relativamente simples recuperar o pacote do eletrodo em o final do experimento. Enquanto lugar de células são tipicamente estudadas em movimentando-se livremente as condições, o aparelho de esteira não apenas significativamente simplifica delineamento experimental e análise de dados, também permite que os pesquisadores escrutinar campo mecanismos em contextos mínimos durante muitas repetições de trajetórias estereotipadas de animais12. Também é muito mais simples de construir do que os sistemas de realidade virtual, pois só requer rodas 3D-impresso, sensores de movimento unidimensional e um microcontrolador.
Atividade de campo local estável pode ser gravada ao longo de muitos dias, um requisito importante para investigar a dinâmica de rede a longo prazo associada com a aprendizagem. Neste contexto, algumas questões devem ser consideradas. Em primeiro lugar, os processos de tecido cerebral degeneração e cicatriz formação ao redor as sondas de silicone podem se gerar variações a longo prazo nos padrões de atividade. Portanto, é importante para todos os procedimentos cirúrgicos ser feito cuidadosamente para causar o mínimo de danos para os tecidos do cérebro e vasos sanguíneos. Em segundo lugar, é relativamente difícil acompanhar células individuais ao longo de dias consecutivos, por causa de desvios de eletrodos no cérebro14. A este respeito, técnicas de imagem, tais como a microscopia de dois fotões e microendoscopia podem ser melhores adequado, como célula identidade pode ser traçada a partir da morfologia e configuração espacial das células21,22,23 . Elas também permitem um maior rendimento em termos de número de células gravadas e fornecer informações directas sobre célula gene expressões24. No entanto, técnicas de imagem são bastante invasivas quando regiões profundas do cérebro estão preocupadas e não é possível resolver potenciais de ação única, como dependem principalmente sinais de cálcio. Portanto, uma solução ideal para estudos longitudinais seria combinar abordagens tanto ópticas e eletrofisiológicas.
Finalmente, é interessante notar que o conjunto de técnicas que descrevemos pode ser facilmente adaptável para outros tipos de eletrodo, incluindo Neuropixels (https://www.janelia.org/lab/harris-lab-apig) e optrodes11,25 , 26e pode ser usado em uma variedade de modelos experimentais diferentes células do hipocampo do lugar. Com o rápido progresso na tecnologia de impressão 3D, a melhoria e a personalização de dispositivos de gravação e comportamentais mais devem tornar-se mais simples e acessível para os laboratórios.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Coreia da ciência e tecnologia programa institucional (n º de projetos 2E26190 e 2E26170) e o programa de ciência de fronteira humana (RGY0089/2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Probe | Neuronexus | Buzsabi32 | Recording electrode |
| Recording system | Intantech | RHD2132/RHD2000 | |
| 3D printer | Asiga | Pico Plus 27 | High resolution printer for micro-drive |
| 3D printer | Stratasys | Mojo | Lower resolution printer for hat components |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Model 963 | |
| Binocular microscope | Leica | M60 | |
| Treadmill apparatus | We build them |
References
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