タンパク質の結晶化
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Overview
タンパク結晶、生体分子の固体格子を取得はタンパク質の構造を解明し、タンパク質の機能の研究ができます。結晶化は、pH、温度、イオン強度、および蛋白質の集中を含む多くの要因の組み合わせで浄化された蛋白質を乾燥を伴います。結晶を取得すると、蛋白質の構造、x 線回折法と電子密度モデルの計算によって解明されうる。
このビデオは、タンパク質の結晶化を紹介し、一般的な手順を示しています。タンパク質の発現と精製、結晶化、x 線回折の手順で覆われています。タンパク質の結晶化のアプリケーションには、膜タンパク質の構造解析、サイト裁決、インシリコ創が含まれます。
タンパク質の結晶化、蛋白質の格子状固体のフォームを取得するプロセスです。これらの結晶は、構造生物学、タンパク質機能の研究を支援する特に貴重です。量産仕様や SDS ページなどの他の技術だけ蛋白質の一次元構造の情報を提供できます。組換え蛋白質の表現の x 線回折法によるタンパク質の結晶化、補完されます。このビデオは、生化学の分野でタンパク質の結晶化、一般的な研究室プロシージャ、およびそのアプリケーションのいくつかの原則が表示されます。
プロセスに必要な最初のステップは、通常組換え蛋白質の表現を使用して、非常に純粋な蛋白質のミリグラム量を得るすることです。興味の蛋白質に対応する遺伝子は、発現ベクターにクローン化し、発現タンパク質親和性クロマトグラフィーによる浄化を支援するポリ ヒスチジンなどの親和性タグに融合。詳細については、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーのこのコレクションのビデオを参照してください。
結晶に浄化された蛋白質の形成、pH、イオン強度、鉛塩法の濃度とタンパク質、温度、および平衡の率を含む多くの要因の組み合わせによって決まります。使用される最も一般的なメソッドは蒸気拡散、2 つのカテゴリがあります: ドロップと座っているドロップをぶら下がっています。純粋な蛋白質、バッファー、および鉛塩法は、イオンを含む液滴固体をバインド水の分子、蛋白質のための水の利用を削減し、同じバッファーと鉛塩法のより高濃度混合物貯留層で囲まれたマイクロウェルは、高蛋白質の集中を模倣しました。初めに、蛋白質および鉛塩法の濃度は、結晶化を引き起こすが低すぎます。実験の過程で、水液滴から気化で収集し、貯留層;液滴の水の量の減少により過飽和になるシステムと核形成、結晶化、続いてに発生することができます。液滴から水の純移動は平衡で、システムは、プロセスが完了するまで保持されます。
3 D 構造の視覚化、x 線回折を使用します。結晶からの x 線データを取得するには、ことがすべての角度でビームにさらされている単色 x 線ビームに置かれます。各露光量は、各スポットの回折結晶から出てくるし、検出器によって登録されているが、イメージを提供します。データは、結晶内の原子の配置のモデルを生成する結合されます。結果として得られる結晶構造 2 オングストロームの一般的な解像度と、原子の三次元配置を示しています。
タンパク質の結晶化の原理について説明しましたが、一般的なプロトコルを見てみましょう。
手順を開始するには、興味の遺伝子を含む表現のベクトルはセルに変換されます。細胞を培養し、中間ログ段階で式が IPTG 遺伝子の mRNA の転写をトリガーするなど、インデューサを追加することによって開始されます。タンパク質発現後粗材は換散バッファー中に浮遊し、遠心分離によって明らかに。
明らかにしライセートがニッケル列に読み込まれます、polyhistidine タグ付きタンパク質が他のすべての生体分子が洗い流される中列にバインドします。
純粋な蛋白質の数ミリグラムを取得すると、気相拡散による結晶化の準備が整いました。24 ウェル ハング/シッティング ドロップ トレイは、さまざまな濃度の塩化ナトリウムとナトリウム酢酸緩衝液でいっぱいです。座ってのドロップ、タンパク質と貯留層のソリューションの平等なボリューム、各井戸の上の棚の上に戻し、トレイは透明テープで覆われています。インキュベーション室に格納されます、トレイと井戸が次の日、その後、数日ごとの成長のため監視されます。
受けたことを適切な結晶 x 線回折分析の準備は完了です。結晶は、選択した方向に結晶を配置するゴニオ メーターにマウントされます。あらゆる角度で x 線回折パターンを作り出すの単色ビーム クリスタルが点灯します。ソフトウェアでは、結晶内の原子の位置を決定することで結晶内の電子密度の三次元モデルに、さまざまな方向で撮影した 2次元の画像に変換します。
今では手順を見直している、タンパク質の結晶化と別の結晶化の技術のいくつかの有用なアプリケーションを確認してみましょう。
タンパク質の結晶化は、インシリコ創薬に使えます。インフルエンザ ウイルスのポリメラーゼ基本的なタンパク質 2、哺乳類のウイルス感染症にリンクされている、三次元構造は、結晶化と x 線回折法によって決定しました。潜在的な結合部位蛋白質は、可視化、および三次元分子ドッキング プログラムを使って設計されたが、蛋白質の裂け目に挿入します。
タンパク質・ DNA 錯体の共結晶も役に立つテクニックです。DNA 結合タンパク質はさまざまな転写、DNA 重合、DNA 修復など生体機能を調節します。これらの複合体の結晶構造がタンパク質の機能、メカニズム、および特定の相互作用の性質に洞察力を提供できます。大腸菌タンパク質複製、DNA 複製の負の調節因子は hemimethylated DNA の結晶化されました。
不可欠な膜タンパク質など G 蛋白質によってつながれる受容器、または GCPRs、極表面領域融合によるタンパク質結晶の開発につながっている連絡先、結晶格子を形成するための彼らの限られた量のため結晶化が困難です。リゾチーム、GCPR、β 2 アドレナリン受容体をコードする遺伝子は、発現ベクターに挿入されました。Β2AR リゾチームの融合蛋白質の結晶化は、リゾチーム、結晶格子中のパッキング相互作用をかたちづくるために必要によって提供される、当然のことながら疎水性 β2AR 上増加細胞外親水性表面のため実現しました。
タンパク質の結晶化にゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオはその原則、一般化されたプロトコル、およびいくつかを説明したバイオメディカル分野で使用。見てくれてありがとう!
Procedure
Disclosures
Transcript
Protein crystallization is the process of obtaining a latticed solid form of a protein. These crystals are especially valuable to structural biologists, assisting in the study of protein function. Other techniques, such as mass spec or SDS-PAGE, can only provide information on the one-dimensional structure of proteins. Protein crystallization is complemented by the techniques of recombinant protein expression and x-ray diffraction. This video will show the principles of protein crystallization, a general laboratory procedure, and several of its applications in the biochemical field.
The first step required in the process is to obtain milligram quantities of very pure protein, typically using recombinant protein expression. The gene corresponding to the protein of interest is cloned into an expression vector, and the expressed protein is fused to an affinity tag, such as poly-histidine, to assist in the purification by affinity chromatography. To learn more, see this collection’s video on affinity chromatography.
Formation of the purified protein into crystals is dependent on the proper combination of many factors, including pH, ionic strength, concentrations of precipitant and protein, temperature, and rate of equilibration. The most common method used is vapor diffusion, of which there are two categories: hanging drop and sitting drop. A droplet containing pure protein, buffer, and precipitant, which is an ionic solid that binds water molecules, reducing water availability for the protein and mimicking higher protein concentration, is in an enclosed microwell with a reservoir with a more highly concentrated mixture of the same buffer and precipitant. At the beginning, the concentrations of protein and precipitant are too low to cause crystallization. During the course of the experiment, water vaporizes from the droplet and collects in the reservoir; a decrease in the amount of water in the droplet causes the system to become supersaturated, and nucleation, followed by crystallization, can occur. The net transfer of water from the droplet is in equilibrium, and the system is maintained until the process is complete.
To visualize the 3D structure, x-ray diffraction is used. To obtain x-ray data from a crystal, it is placed in a monochromatic x-ray beam, where it is exposed to the beam at all angles. Each exposure provides an image, where each spot is a diffracted x-ray, which emerges from the crystal and is registered by a detector. The data are combined to produce a model of the arrangement of atoms within the crystal. The resulting crystal structure demonstrates the 3-dimensional placement of the atoms, with a typical resolution of 2 angstroms.
Now that we have covered the principles of protein crystallization, let us look at a generalized protocol.
To begin the procedure an expression vector containing the gene of interest is transformed into cells. The cells are incubated and at mid-log phase, expression is initiated by adding an inducer, such as IPTG, which triggers transcription of the gene’s mRNA. After protein expression, the crude material is suspended in lysis buffer, and then clarified by centrifugation.
The clarified lysate is then loaded onto a nickel column, and the polyhistidine-tagged protein binds to the column while all other biomolecules are washed away.
Once several milligrams of pure protein have been obtained, it is ready for crystallization by vapor diffusion. A 24-well hanging/sitting drop tray is filled with varying concentrations of sodium chloride and sodium acetate buffer solutions. For the sitting drop method, equal volumes of protein and reservoir solution are pipetted onto the shelf above each well, and then the tray is covered with transparent tape. The tray is then placed in an incubation chamber, and the wells are monitored for growth the following day, then every few days.
Once a proper crystal has been obtained it is ready for x-ray diffraction analysis. The crystal is mounted on a goniometer to position the crystal at selected orientations. The crystal is illuminated with a monochromatic beam of x-rays at all angles, producing a diffraction pattern. The software converts the two-dimensional images, taken at different orientations, to a three-dimensional model of the density of electrons within the crystal by determining the positions of the atoms in the crystal.
Now that we have reviewed a procedure, let’s review some useful applications of protein crystallization, and another crystallization technique.
Protein crystallization may be used for in silico drug design. The three-dimensional structure of Influenza virus’s polymerase basic protein 2, which has been linked to viral infection in mammals, was determined by crystallization and x-ray diffraction. Potential binding sites in the protein are visualized, and with the use of a docking program, a three-dimensional molecule was designed that would insert into a cleft in the protein.
Co-crystallization of protein-DNA complexes is also a useful technique. DNA-binding proteins modulate a wide variety of biological functions such as transcription and DNA polymerization and DNA repair; and crystal structures of these complexes can provide insight into protein function, mechanism, and the nature of the specific interaction. The E. coli protein SeqA, a negative regulator of DNA replication, was co-crystallized with hemimethylated DNA.
Integral membrane proteins such as G-protein coupled receptors, or GCPRs, are difficult to crystallize due to their limited amount of polar surface area available for forming crystal lattice contacts, which has led to the development of fusion-protein-assisted protein crystallization. Genes encoding β2 adrenergic receptor, a GCPR, and a lysozyme were inserted into an expression vector. The crystallization of the β2AR- lysozyme fusion protein was achieved due to the increased extracellular hydrophilic surface over the naturally hydrophobic β2AR, provided by the lysozyme, necessary for forming packing interactions in the crystal lattice.
You’ve just watched JoVE’s video on protein crystallization. This video described its principles, a generalized protocol, and some its uses in the biomedical field. Thanks for watching!
