Transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET)
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Overview
Förster (FRET) est un phénomène utilisé pour étudier les interactions biochimiques de courte portée. Dans la frette, une molécule de photoluminescent donneur peut transférer non-radiativement énergie à une molécule d’accepteur si leurs spectres d’émission et d’absorption respectifs se chevauchent. La quantité d’énergie transférée — et par conséquent l’ensemble des émissions d’échantillon — dépend de la proximité d’une paire de donneur-accepteur de molécules photoluminescentes. Analyse de la frette est combiné avec d’autres techniques de biochimie pour obtenir des informations détaillées des structures biomoléculaires et les interactions de ce “ souverain spectroscopiques. ”
cette vidéo couvre les principes et les concepts d’analyse de la frette. La procédure se concentre sur la préparation des échantillons pour le FRET et les moyens présenter et interpréter les données. Enfin, les applications incluent la surveillance des procédés conformationnelles et cellulaires par marquage des pièces d’une cellule ou de la protéine, les réactions enzymatiques qui altèrent les structures de protéine, de surveillance et à l’aide de FRET pour surveiller l’agrégation des monomères exprimé par les cellules.
Förster Resonance Energy transfert ou frette, est un non radiatif transfert d’énergie entre molécules émettrices de lumière et est souvent utilisée pour étudier les interactions biochimiques de courte portée. FRETTE se produit uniquement lorsque les molécules fluorescentes sont espacés de moins de 10 nm de l’autre. Analyse de la frette est cumulable avec d’autres techniques pour obtenir des informations structurelles détaillées. Cette vidéo va introduire les principes sous-jacents de la frette, résumer une présentation de données et de protocole et discuter certaines applications biochimiques.
molécule de photoluminescent A par exemple un fluorophore est excitée en absorbant le rayonnement électromagnétique à une longueur d’onde dans le spectre d’absorption. Comme il se détend, il émet de la lumière à une longueur d’onde au sein de son spectre d’émission. Pour plus d’informations sur la fluorescence, consultez JoVE ' s-vidéo sur la microscopie de fluorescence. Fluorophores différents absorbent et émettent de la lumière à différentes longueurs d’onde, qui souvent se chevauchent. Si le spectre d’émission d’un fluorophore chevauche considérablement le spectre d’absorption d’une autre molécule, la “ donneur ” publiera un photon virtuel, qui est absorbé par la “ accepteur ”. Quand un donneur excité est moins de 10 nm d’un accepteur, l’énergie est transférée du donneur à accepteur par interactions dipôle-dipôle. La libération d’énergie par émission de lumière par le donateur diminue proportionnellement. Pendant ce temps, l’accepteur excité émet de la lumière à sa longueur d’onde d’émission. La réponse de la frette est évaluée en termes d’efficacité, ou le pourcentage d’énergie libérée du donneur par FRET, plutôt que par fluorescence ou autres processus radiatifs. L’efficacité dépend fortement de la distance entre le donneur et l’accepteur, qui permet la frette d’agir comme un ' moléculaire ' ou ' spectroscopiques ' souverain.
En biochimie, frette sert souvent qualitativement à observer des changements conformationnels dans les molécules en surveillant les fluorophores comme ils se déplacent dans et hors de la gamme FRET de l’autre. De même, les fonctions cellulaires peuvent être étudiées avec des molécules contenant une paire de frette. Si la molécule marquée est clivée par l’activité enzymatique, frette s’arrête et les changements de longueur d’onde de fluorescence observés.
Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent la frette, laissez ' s regarder un aperçu d’un protocole et plusieurs façons de présenter et interpréter les données.
avant l’expérience, les biomolécules d’intérêt, généralement des ADN ou des protéines, sont conçus avec des étiquettes fluorescentes, à l’aide de techniques de biologie moléculaire. façons courantes d’introduire la mis à jour le matériel génétique dans les cellules incluent la transfection et l’électroporation.
Puis, les cellules sont préparés pour la visualisation de la frette sur un microscope de fluorescence. par exemple, les molécules peuvent être immobilisées sur une diapositive pour frette de la molécule unique ou les échantillons sont chargés dans le puits pour le criblage à haut débit.
Puis, les lasers à excitation, le microscope et le matériel connexe sont préparés. (A) expériences de la frette impliquent souvent des lasers puissants ; (B) si approprié PPE et procédures de sécurité devaient être appliquées. l’échantillon est ensuite placé dans l’appareil et illuminé avec le laser excitation.
pour les expériences de comportement de la cellule de surveillance, couleur des images montrant des différences ou des changements dans l’intensité des émissions sont utilisés. Donneur et accepteur des intensités d’émission sont tracées ensemble pour suivre les réponse frette au fil du temps.
Frette données peuvent également être montées sur diverses fonctions pour des analyses plus complexes. Selon l’expérience, les données pourraient être présentées de multiples façons pour mieux représenter les résultats, faisant vous inquiétez pas un outil expérimental souple.
maintenant que vous avez ' re familier avec les bases de course et d’analyser une expérience de la frette, laissez ' s coup d’oeil à certaines applications de frette en recherche biochimie.
Frette peut être utilisé pour étudier les changements de conformation ou de processus cellulaires par marquage des parties de la protéine ou cellule prévues à se déplacer au sein de 10 nm de l’autre avec une paire de frette. Par exemple, capteurs de protéine sont préparés par marquage des récepteurs avec une paire de fluorophores. La réponse de la frette est surveillée direct par microscopie confocale. Variation de longueur d’onde d’émission et l’intensité indiquent des changements conformationnels.
Frette peut également être utilisé en préparant des molécules avec une paire de frette active et en détectant les variations de la réponse. Lorsque le substrat est clivé, frette est perturbé, provoquant une augmentation des émissions donneur et une diminution dans l’émission de l’accepteur. Les émissions sont analysées afin de déterminer les contributions par donneur et accepteur frette. Une fois que les facteurs d’émissions directes sont calculés pour les protéines fluorescentes cyan et jaunes, la concentration et les paramètres cinétiques du substrat peuvent être déterminées.
Cellules conçues pour exprimer les monomères contenant soit d’une fonction paire de frette comme ' capteurs ' pour les interactions entre les monomères. Si l’agrégation de ces monomères est induite, une réponse de la frette est observée. Ceci peut être utilisé pour étudier l’agrégation des protéines déclenchée par ' ensemencement ' de protéines mal repliées. Ici, les cellules ont été transduites avec des agrégats de la protéine d’intérêt, incubés et analysées avec écoulement cytometry.
vous ' ve juste regardé JoVE ' s-vidéo sur Förster Resonance Energy Transfer ou frette. Cette vidéo contenue les principes sous-jacents de la frette, préparation et analyse d’une expérience de la frette et quelques applications biochimiques.
Merci pour regarder !
Procedure
Disclosures
Transcript
Förster Resonance Energy Transfer, or FRET, is a non-radiative transfer of energy between light-emitting molecules, and is often used to investigate close-range biochemical interactions. FRET only occurs when fluorescent molecules are spaced within 10 nm of each other. FRET analysis can be combined with other techniques to obtain detailed structural information. This video will introduce the underlying principles of FRET, summarize a protocol and data presentation, and discuss some biochemical applications.
A photoluminescent molecule such as a fluorophore is excited by absorbing electromagnetic radiation at a wavelength in its absorption spectrum. As it relaxes, it emits light at a wavelength within its emission spectrum. For more information about fluorescence, see JoVE’s video on fluorescence microscopy. Different fluorophores absorb and emit light at different wavelengths, which frequently overlap. If the emission spectrum of a fluorophore overlaps significantly with the absorption spectrum of another fluorophore, the “donor” will release a virtual photon, which is absorbed by the “acceptor”. When an excited donor is within 10 nm of an acceptor, energy is transferred from donor to acceptor by dipole-dipole interactions. The release of energy by emission of light from the donor correspondingly decreases. Meanwhile, the excited acceptor emits light at its emission wavelength. The FRET response is evaluated in terms of efficiency, or the percentage of energy released from the donor by FRET rather than by fluorescence or other radiative processes. The efficiency depends strongly on the distance between the donor and acceptor, which allows FRET to act as a ‘molecular’ or ‘spectroscopic’ ruler.
In biochemistry, FRET is often used qualitatively to observe conformational changes in molecules by monitoring fluorophores as they move in and out of FRET range of each other. Similarly, cellular functions can be studied with molecules containing a FRET pair. If the labeled molecule is cleaved by enzyme activity, FRET stops and the observed fluorescence wavelength changes.
Now that you understand the principles behind FRET, let’s look at an overview of a protocol and a few ways to present and interpret the data.
Prior to the experiment, the biomolecules of interest, typically DNA or proteins, are engineered with fluorescent tags, using molecular biology techniques. Common ways to introduce the modified genetic material into the cells include transfection and electroporation.
Then, the cells are prepared for FRET visualization on a fluorescence microscope. For instance, the molecules may be immobilized on a slide for single-molecule FRET, or samples are loaded into wells for high-throughput screening.
Then, the excitation lasers, microscope, and associated equipment are prepared. (A) FRET experiments often involve powerful lasers; (B) so appropriate PPE and safety procedures should be used. The sample is then placed in the instrument and illuminated with the excitation laser.
For experiments monitoring cell behavior, color images showing differences or changes in emission intensity are used. Donor and acceptor emission intensities are plotted together to track FRET response over time.
FRET data can also be fitted to various functions for more complex analyses. Depending on the experiment, data may be presented in multiple ways to best represent the results, making FRET a flexible experimental tool.
Now that you’re familiar with the basics of running and analyzing a FRET experiment, let’s look at some applications of FRET in biochemistry research.
FRET can be used to study conformational changes or cellular processes by labeling parts of the protein or cell predicted to move within 10 nm of each other with a FRET pair. For example, protein sensors are prepared by labeling receptors with a pair of fluorophores. The FRET response is monitored live by confocal microscopy. Variation of emission wavelength and intensity indicate conformational changes.
FRET can also be used by preparing molecules with an active FRET pair and observing changes in the response. When the substrate is cleaved, FRET is disrupted, causing an increase in donor emission and a decrease in acceptor emission. The emissions are analyzed to determine contributions by donor, acceptor, and FRET. Once the direct emission factors are calculated for the cyan and yellow fluorescent proteins, the concentration and kinetic parameters of the substrate can be determined.
Cells designed to express monomers containing either of a FRET pair function as ‘sensors’ for interactions between those monomers. If aggregation of those monomers is induced, a FRET response is observed. This can be used to investigate protein aggregation triggered by ‘seeding’ of misfolded proteins. Here, cells were transduced with aggregates of the protein of interest, incubated, and analyzed with flow cytometry.
You’ve just watched JoVE’s video on Förster Resonance Energy Transfer, or FRET. This video contained the underlying principles of FRET, preparation and analysis of a FRET experiment, and a few biochemical applications.
Thanks for watching!
