Denne metode er at indføre en transgen i endotelet af kanin carotis arterierne. Indførelsen af transgenet tillader vurdering af transgenet produktet enten i normal arterier eller sygdomsmodeller biologiske rolle. Metoden er også nyttige til måling af aktiviteten af regulerende DNA-sekvenser.
Målet med denne metode er at indføre en transgen i endotelet isolerede segmenter af begge kanin fælles carotis arterierne. Metoden opnår fokale endotel-selektiv transgenese, hvorved en efterforsker til at bestemme de biologiske roller i endothelial udtrykt transgener og kvantificere in vivo transcriptional aktiviteten af DNA-sekvenser i store arterie endotelceller. Metoden bruger kirurgisk isolation af kanin fælles halspulsårer og en arteriotomy til at levere en transgen-udtrykker viral vektor i arteriel lumen. En kort inkubationstid af vektor i lumen, med efterfølgende aspiration indholdsfortegnelsen lumen er tilstrækkelig til at opnå effektive og holdbare udtryk af transgenet i endothelium, med ingen påviselige transduktion eller udtryk uden for de isolerede arteriel segment. Metoden tillader vurdering af transgene produkter biologiske aktiviteter både i normal arterier og modeller af menneskelige karsygdom, samtidig undgå systemiske virkninger, som kunne være forårsaget enten ved at målrette gen levering til andre sites (fx. leveren) eller af den alternative metode levere genetiske konstruktioner til endotelet af Kim linje transgenese. Anvendelsen af metoden er begrænset af behovet for en dygtig kirurg og anæstesi, en veludstyret operationsstuen, udgifter til indkøb og boliger kaniner, og behovet for ekspertise inden for overførsel af gener vektor konstruktion og brug. Resultater, der opnås med denne metode omfatter: transgen-relaterede ændringer i det arterielle struktur, celleforandringer, ekstracellulære matrix eller vasomotoriske funktion; tillæg og fradrag i arteriel betændelse; ændringer i vaskulære celle apoptose; og progression, retardering eller regression af sygdomme som intima hyperplasi eller åreforkalkning. Metoden giver også mulighed for måling af indfødte og syntetiske DNA regulerende sekvenser evne til at ændre transgen udtryk i endothelial celler, giver resultater, der omfatter: niveauer af transgenet mRNA, niveauer af transgenet protein og niveauer af transgenet enzymatisk aktivitet.
Målet med denne metode er at indføre en transgen i endotelet af kanin fælles halspulsårer. Indførelsen af transgenet tillader vurdering af produktets transgen biologiske rolle både i normal arterier og kanin modeller af arteriel sygdom hos mennesker. Overekspression af transgenet i sygdomsmodeller kan afsløre, om transgenet (og dens protein produkt) viser lovende som terapeutiske agenter1,2,3,4. Optagelse af cis-handler regulerende elementer i transgene udtryk kassette muliggør vurdering af aktiviteten af disse elementer i arteriel endotel i vivo5,6. Viden om aktiviteten af specifikke cis virkende regulerende elementer kan bruges til at designe mere-aktive udtryk kassetter og at sonde mekanismer af RIBOREGULATION i store arterie endotelet in vivo7.
Kaniner er en værdifuld model for forskellige aspekter af menneskets vaskulære fysiologi og sygdom. Kaniner deler mange vaskulære funktioner med mennesker. For eksempel, er baseline hematological værdier, hæmostatisk regulering og vaskulære langsgående spændinger ens mellem kaniner og mennesker8. Kanin modeller af Vaskulære sygdomme replikere Nøglefunktioner af mange menneskelige sygdomme herunder: aneurismer (lignende geometriske og flydeegenskaber)9, vasospasme (lignende reaktion på endovaskulære behandling)10,11, og åreforkalkning (intima plaques med lignende funktioner, herunder en kerne rige i lipid, makrofager og glat muskel celler i et fibrøst cap)12,13. I overensstemmelse hermed, kanin modeller er blevet udviklet for mange kar-sygdomme såsom trombose, vasospasme, aneurisme, diabetes, vaskulære graft stenose og åreforkalkning8,13,14, 15,16.
For forskere at vælge blandt dyremodeller vaskulære fysiologi og sygdom, har kaninen flere fordele. De større fartøjer af kaniner i forhold til gnavere, giver mulighed for lettere kirurgisk manipulation, brug af Intravaskulært udstyr og en større mængde af væv til kvantitative målinger. Kaniner er meget tættere Fylogenetisk på primater end er gnavere17, og den større genetiske mangfoldighed af outbred kaniner bedre tilnærmer den genetiske variation af mennesker. Genetiske mangfoldighed er særlig vigtig for de prækliniske undersøgelser, som-af deres natur-mål om at udvikle behandlingsformer, der kan anvendes på den genetisk forskellige menneskelige befolkning. Som med mange, hvis ikke alle andre model arter, kanin gener er let klonet eller syntetiseret fordi kanin genom er blevet sekventeret med høj dækning (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Sammenlignet med andre store dyremodeller (som hunde, svin eller får), kaniner er relativt billige at købe og hus og de er nemmere at opdrætte og håndtere. Bestemt vaskulære sygdomsmodeller i kaniner hver har deres egne fordele og mangler som modeller for sygdom hos mennesker, der er uden for rammerne af dette manuskript8,12,18. En investigator skal gennemgå disse fordele og mangler at afgøre, om kaninen er den bedste model for at besvare en specifik eksperimentel spørgsmål.
Indførelsen af deoxyribonukleinsyre (DNA) regulerende sekvenser i endothelial celler i vivo giver mulighed for undersøgelse af disse sekvenser i et komplekst fysiologisk miljø aktivitet. In vitro undersøgelser i endothelial celler, transfekteret kan være nyttigt for den indledende vurdering af DNA regulerende sekvenser; dog er udtrykket niveauer i vævskultur modeller undertiden ikke gengivet når undersøgelserne er gentagne i vivo5,19,20. In vitro- systemer kan også være nyttig for at udforske grundlæggende veje af protein signalering og endotel fysiologi samt kommunikation mellem kulturperler vaskulære celler; dog studeret mere komplekse veje eller regulerende net, der er påvirket af komplekse populationer af vaskulære naboceller eller immunsystemet bedst i en i vivo system6,20. Den metode beskrevet heri giver en platform for at udforske regulering af transgenet udtryk i endotelet inden for rammerne af en intakt fartøj, med eller uden sygdom. In vivo -system også tillader undersøgelse af fysiologiske og patologiske cellulære krydstale og identifikation af bidrag af immunsystemet til regulering af gen expression6.
Kønsceller transgenese (især i mus) er en alternativ tilgang for at lede transgen udtryk i endothelial celler. Denne tilgang kan give livslang transgen udtryk, endotel målretning medieret af specifikke promotor eller regulerende regioner21,22. Men generation af Transgene mus er tidskrævende og dyrt, flere transgene linjer skal afprøves ofte for at sikre målretning af transgenet ønskede celletype og opnåelse af tilstrækkelig transgen udtryk niveauer, og eksperimenterende resultater i murine systemer kan være stamme-afhængige. Murine transgene modeller med endotel-målrettet transgener har mange fordele: der er ingen grund til at udføre kirurgi på hver eksperimentelle dyr for at opnå transgenese, eksperimentelle mus kan være opdrættet med talrige andre tilgængelige Transgene mus i for at teste genetiske og fænotypiske interaktioner, og der er et bredt udvalg af antistoffer, der reagerer med murine proteiner, lette karakterisering af fænotyper. Men målretning af transgener til endotelet via germinallinjen typisk resulterer i transgene udtryk i hele Vaskulaturen,22 gør det vanskeligt at bestemme det sted hvor transgen produkt handler. Dette er især tilfældet, når produktets transgen udskilles, fordi en transgen produkt udskilles af endothelceller hele Vaskulaturen kunne have biologisk aktivitet på et vilkårligt antal steder inden for et dyr. Selv om metoden i dette manuskript kræver teknisk ekspertise og specialiserede faciliteter, kan det være mindre tidskrævende og billigere end udvikle en endotel-specifikke Transgene mus linje. Det giver mulighed for vurdering af funktionen af en protein selektivt i endothelial celler af et segment af store arterie, og den tillader brug af de kontralaterale fælles carotis som parret kontrol (fjerne systemiske faktorer, der kan variere mellem eksperimentelle dyr-eksempelvis blodtrykket eller kolesteroltallet-som ukontrolleret variabler).
Genterapi er en lovende metode til behandling af Vaskulære sygdomme, specielt kroniske sygdomme, fordi en enkelt ansøgning kan give vedvarende eller eventuelt livslang udtryk for en terapeutisk gen23. Den terapeutiske løfte om genterapi er blevet undersøgt i dyremodeller for overførsel af somatiske gener, ofte rettet mod de lever24,25, hvilket er en forholdsvis let mål, fordi mange blodbårne virale vektorer er hepatotropic. Dog for at have en effekt på kar-sygdomme, skal genterapi målrettet til leveren opnå systemisk overekspression af proteiner. Dette kræver typisk store doser af vektor, som kan være giftige eller endog dødelig26. Desuden øget systemiske niveau af et protein raise risikoen for bivirkninger, off-mål, som kunne komplicere eller endda skjule fortolkning af eksperimentelle resultater. Lokale genterapi målretning vaskulære endotel som beskrevet i dette manuskript kunne undgå systemiske bivirkninger, fordi infunderes vektoren ikke formidlet bredt ud over den transduced arteriel segment, og lokale vaskulære effekter kan opnås uden ændringer i systemisk plasmaniveauer af protein. 27 desuden et langt lavere antal vektor for at transduce en arteriel segment end er nødvendig for at opnå robuste hepatisk transduktion. Transgenets udtryk fra leveren er blevet rapporteret at falde over tid, sandsynligvis på grund af cellefornyelsen, der kræver gentagen dosering hvis højtstående transgen udtryk skal opretholdes. 28 derimod en lav omsætningshastighed af endotelet giver stabil udtryk for mindst 48 uger i chow-fed kaniner og mindst 24 uger i aterosklerotiske læsioner af kolesterol-fed kaniner. 1 , 27
For at afgøre, om denne metode til genoverførsel til kanin fælles carotis endotelet er passende, bør fordele og ulemper (tabel 1) overvejes i forbindelse med de specifikke forskningsmål. Fordele ved denne metode omfatter: outbred kaniner er bedre repræsentant af menneskers genetiske diversitet end er indavlede mus (vigtigt for prækliniske arbejde); kaniner giver større fartøjer til lettere manipulation og mere væv til analyse. metoden kan opnå endotel-målrettet transgen udtryk langt hurtigere end gør kønsceller endotel målretning i Transgene mus; vektor dosis kan justeres nemt til model variable niveauer af transgenet udtryk; processer, der er specifikke for store-arterie endotelet kan undersøges; og lokale vaskulære transgenese tillader den modsatte carotis i det samme dyr som bruges som en kontrol, at fjerne systemiske faktorer som ukontrolleret variabler. Ulemper omfatter: særlige faciliteter og ekspertise er påkrævet; færre genetisk modificerede baggrunde som at eksperimentere er tilgængelige i kaniner end i mus; og der er en mindre omfattende udvalg af antistoffer mod kanin versus mus proteiner (for immunodetection af transgenet protein og andre antigener, der kan være vigtige i fortolkning af eksperimentelle resultater).
Visse aspekter af kirurgisk teknik fortjener særlig opmærksomhed. Fuld eksponering og mobilisering af den fælles halspulsåren via omhyggelig dissektion vil lette gen overførsel og arteriotomy reparation. Under dissektion, bør direkte manipulation af halspulsåren minimeres for at forhindre vasospasme. Derudover eventuelle blødninger ved siden af arteria bør stoppes ved at anvende let tryk med gaze og røde blod skal renses op straks skylles området med normal saltvand. Det er også vigtigt at undgå at beskadige…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker AdVec, Inc. for at have tilladelse til at bruge HDAd reagenser, Julia Feyk for administrativ bistand og Institut for sammenlignende medicin veterinære tjenester for kirurgisk rådgivning og støtte. Dette arbejde blev støttet af HL114541 og John L. Locke, Jr. Charitable Trust.
Disposables | |||
3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
Surgical Instruments | |||
Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
Surgical Suite Equipment | |||
Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |