Summary
Cette méthode consiste à introduire un transgène dans l’endothélium des artères carotides de lapin. Introduction du transgène permet l’évaluation du rôle biologique du produit transgénique en artères normales ou des modèles de maladies. La méthode est également utile pour mesurer l’activité des séquences régulatrices de l’ADN.
Abstract
L’objectif de cette méthode consiste à introduire un transgène dans l’endothélium des segments isolés des deux artères carotides communes de lapin. La méthode atteint focal transgénèse endothéliales sélectives, permettant ainsi un enquêteur pour déterminer les rôles biologiques de transgènes endothéliales exprimés et de quantifier l’activité transcriptionnelle in vivo des séquences d’ADN dans les grosses artères cellules endothéliales. La méthode utilise l’isolement chirurgie des artères carotides communes de lapin et une artériotomie pour livrer un vecteur viral exprimant le transgène dans la lumière artérielle. Une courte période d’incubation du vecteur dans la lumière, avec aspiration ultérieure des contenus lumen, est suffisante pour parvenir à une expression efficace et durable du transgène dans l’endothélium, sans transduction détectable ou l’expression en dehors de la segment artériel isolé. La méthode permet l’évaluation de l’activité biologique des produits transgène artères normales tant dans les modèles de la maladie vasculaire humaine, tout en évitant les effets systémiques qui pourraient être causées soit par ciblage livraison de gènes vers d’autres sites (par exemple. le foie) ou par la méthode alternative de livrer des constructions génétiques à l’endothélium par transgénèse ligne germe. Application de la méthode est limitée par la nécessité d’un habile chirurgien et anesthésiste, une salle d’opération bien équipée, les coûts d’achat et de lapins de logement et la nécessité d’une expertise dans la construction de vecteur de transfert génétique et l’utilisation. Les résultats obtenus avec cette méthode incluent : altérations liées transgène structure artérielle, cellularité, matrice extracellulaire ou fonction vasomotrice ; augmentation ou réduction de l’inflammation artérielle ; altérations de l’apoptose des cellules vasculaires ; et progression, un retard ou régression des maladies comme l’hyperplasie intimale ou l’athérosclérose. La méthode permet également la mesure de la capacité natives et synthétiques réglementaires de séquences d’ADN pour modifier l’expression de transgènes dans les cellules endothéliales, fournissant des résultats qui incluent : niveaux du transgène ARNm, teneur en protéines du transgène et niveaux du transgène activité enzymatique.
Introduction
L’objectif de cette méthode consiste à introduire un transgène dans l’endothélium des artères carotides communes de lapin. Introduction du transgène permet l’évaluation du rôle biologique du produit transgénique artères normales tant dans les modèles de lapin de la maladie artérielle humaine. La surexpression du transgène dans les modèles de maladies peut révéler si le transgène (et son produit protéique) semblent prometteurs comme agents thérapeutiques1,2,3,4. Inclusion des éléments régulateurs intramoléculaires dans la cassette d’expression de transgènes permet l’évaluation de l’activité de ces éléments dans l’endothélium artériel en vivo5,6. Connaissance de l’activité des éléments réglementaires spécifiques intramoléculaires peut être utilisé pour la conception des cassettes d’expression plus active et pour sonder les mécanismes de régulation génique dans la grande artère endothélium en vivo7.
Les lapins sont un modèle précieux pour divers aspects de la physiologie vasculaire humaine et la maladie. Lapins partagent beaucoup de dispositifs vasculaires avec les humains. Par exemple, les valeurs hématologiques de base, règlement hémostatique et la tension longitudinale vasculaire sont similaires entre les lapins et les humains8. Modèles de lapin de maladies vasculaires répliquent les caractéristiques principales de nombreuses maladies humaines, y compris : les anévrismes (similaire géométriques et caractéristiques d’écoulement)9, vasospasme (réponse similaire au traitement endovasculaire)10,11, et l’athérosclérose (plaques intima avec des fonctions similaires, y compris un noyau riche en lipides, macrophages et le muscle lisse des cellules dans un plafond fibreux)12,13. Par conséquent, les modèles de lapin ont été développés pour de nombreuses maladies vasculaires telles que la thrombose, vasospasme, anévrisme, diabète, sténose vasculaire et l’athérosclérose8,13,14, 15,,16.
Pour les chercheurs en choisissant parmi les modèles animaux de la physiologie vasculaire et la maladie, le lapin présente plusieurs avantages. Par rapport à des rongeurs, des gros vaisseaux de lapins permettent plus facile les manipulations chirurgicales, l’utilisation de dispositifs endovasculaires et une plus grande quantité de tissu pour des mesures quantitatives. Les lapins sont beaucoup plus proches phylogénétiquement de primates que les rongeurs17, et la plus grande diversité génétique des lapins non consanguins mieux rapproche de la variabilité génétique des êtres humains. La diversité génétique est particulièrement importante pour les études précliniques, qui-par leur nature-le but de développer des thérapies qui peuvent être appliqués à la population humaine génétiquement diversifiée. Comme beaucoup, si pas toutes les autres espèces de modèles, gènes de lapin sont facilement clonés ou synthétisées car a séquencé le génome de lapin avec une couverture élevée (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Par rapport aux autres grands modèles animaux (tels que les chiens, les porcs ou mouton), les lapins sont relativement peu coûteux à l’achat et la maison et ils sont plus faciles à élever et gérer. Les modèles spécifiques de maladies vasculaires chez les lapins chaque ont des avantages et des défauts comme modèles de maladies humaines qui dépassent la portée de ce manuscrit8,12,18. L’enquêteur devrait examiner ces avantages et des lacunes afin de déterminer si le lapin est le meilleur modèle pour répondre à une question précise expérimentale.
Introduction de séquences régulatrices de l’acide désoxyribonucléique (ADN) dans les cellules endothéliales en vivo permet d’investigation de l’activité de ces séquences dans un environnement complexe physiologique. Des études in vitro dans les cellules endothéliales transfectées peuvent être utiles pour l’évaluation initiale des séquences régulatrices de l’ADN ; Toutefois, les niveaux d’expression dans des modèles de culture de tissus ne sont pas parfois reproduites lorsque les études sont répétées en vivo5,19,,20. In vitro systèmes peuvent également être utiles pour explorer des voies de base des protéines de signalisation et physiologie endothéliale ainsi que communication entre des cellules vasculaires ; Cependant, les voies plus complexes ou des réseaux de régulation qui sont influencés par les populations complexes des cellules vasculaires voisins ou le système immunitaire sont mieux étudiées dans un in vivo système6,20. La méthode décrite ci-après fournit une plate-forme pour explorer la régulation de l’expression du transgène dans l’endothélium dans le contexte d’un bateau intact, avec ou sans maladie. Le système in vivo permet également d’investigation de la diaphonie cellulaire physiologique et pathologique et identification des contributions du système immunitaire à la régulation du gène expression6.
Transgénèse germinale (surtout chez la souris) est une approche alternative pour diriger l’expression transgénique aux cellules endothéliales. Cette approche peut fournir toute la vie de transgene expression, ciblage endothéliale médiée par le promoteur spécifique ou régions régulatrices21,22. Cependant, la génération de souris transgéniques est long et coûteux, plusieurs lignées transgéniques doivent être souvent testées pour s’assurer le ciblage du transgène au type de cellule désirée et la réalisation des niveaux d’expression de transgènes adéquate et expérimentale résultats dans les systèmes murins peuvent être dépendante de la souche. Modèles murins transgéniques transgènes endothéliales ciblées présentent de nombreux avantages : il n’y a pas besoin d’effectuer une chirurgie sur chaque animal expérimental afin d’atteindre la transgénèse, souris expérimentales peuvent être croisées avec des nombreux autres transgéniques disponibles dans afin de tester les interactions génétiques et phénotypiques, et il y a une large sélection d’anticorps qui réagissent avec les protéines murines, faciliter la caractérisation des phénotypes. Cependant, ciblant des transgènes à l’endothélium par l’intermédiaire de la lignée germinale généralement traduit par transgene expression tout au long de la vascularisation,22 rend difficile de déterminer le site au cours de laquelle agit le produit transgénique. Cela est particulièrement vrai lorsque le produit transgénique est sécrété, parce qu’un transgène produit sécrété par les cellules endothéliales tout au long de la vascularisation pourrait avoir une activité biologique dans n’importe quel nombre de sites au sein d’un animal. Bien que la méthode décrite dans ce manuscrit nécessite une expertise technique et des installations spécialisées, il peut être beaucoup moins de temps et moins cher que de développer une ligne de souris transgéniques endothéliales spécifiques. Il permet l’évaluation de la fonction d’une protéine sélectivement dans les cellules endothéliales du tronçon de la grande artère, et il permet d’utiliser la carotide commune controlatérale comme témoin apparié (élimination des facteurs systémiques pouvant varier entre expérimental animaux-par exemple, la pression artérielle ou cholestérol-comme des variables non contrôlées).
La thérapie génique est une approche prometteuse pour le traitement des maladies vasculaires, les maladies chroniques en particulier, parce qu’une seule application peut offrir expression soutenue et peut-être toute la vie d’un gène thérapeutique23. La promesse thérapeutique de la thérapie génique a été explorée dans des modèles animaux de transfert génique somatique, ciblant souvent le foie24,25, qui est une cible relativement facile, car beaucoup de vecteurs virales transmissibles par le sang est hépatotrope. Cependant, pour avoir un effet sur les maladies vasculaires, la thérapie génique ciblée vers le foie doit atteindre systémique surexpression de protéines. Ceci exige généralement de fortes doses de vecteur, qui peut être toxique ou mortelle26. En outre, augmenté les niveaux systémiques d’une relance de la protéine le risque d’effets secondaires hors cible qui pourrait compliquer ou même obscurcir l’interprétation des résultats expérimentaux. Une thérapie génique locale ciblant l’endothélium vasculaire, comme décrit dans ce manuscrit pourrait éviter des effets secondaires systémiques parce que le vecteur perfusé n’est pas largement diffusé au-delà du segment artériel transduite, et les effets vasculaires locaux peuvent être réalisés sans changements systémiques plasmatiques de la protéine. 27 en outre, un montant bien inférieur du vecteur est nécessaire pour transmettre un segment artériel que celle nécessaire pour atteindre la transduction hépatique robuste. Transgene expression du foie a été signalée à diminuer au fil du temps, probablement en raison de renouvellement cellulaire, exigeant des doses répétées si haut niveau transgene expression doit être maintenue. 28 en revanche, le taux de rotation faible de l’endothélium fournit une expression stable pendant au moins 48 semaines chez les lapins nourris et pendant au moins 24 semaines dans les lésions athéroscléreuses des lapins nourris de cholestérol. 1 , 27
Pour déterminer si cette méthode de transfert de gènes à endothélium carotide commune de lapin est appropriée, les avantages et les inconvénients (tableau 1) considérer dans le contexte des objectifs de recherche spécifiques. Les avantages de cette méthode incluent : les lapins non consanguines sont mieux représentatifs de la diversité génétique humaine que sont les souris consanguines (importants pour les travaux préclinique) ; fournissent des lapins plus gros navires pour une manipulation plus facile et plus de tissu pour analyse ; la méthode peut atteindre axés sur l’endothélium transgene expression beaucoup plus rapidement que ne le fait germinales endothéliales ciblage chez des souris transgéniques ; dose de vecteur peut être facilement ajustée à des niveaux variables de modèle d’expression du transgène ; des processus spécifiques à la grande artère endothélium puissent être étudiés ; et transgenèse vasculaire locale permet à la carotide opposée chez le même animal à utiliser comme un contrôle, en éliminant les facteurs systémiques comme variables incontrôlées. Les inconvénients incluent : montages spéciaux et l’expertise sont nécessaires ; moins les milieux génétiquement modifiés permettant d’expérimenter sont disponibles chez le lapin que chez la souris ; et il y a une moins grande sélection d’anticorps de lapin par rapport aux protéines de souris (par immunodétection de protéine transgénique et autres antigènes qui peuvent être importants pour l’interprétation des résultats expérimentaux).
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Université de Washington Office de bien-être des animaux et animalier institutionnel associé et utilisation Comité (IACUC) et ont été achevés conformément au respect de tous et pertinentes réglementaire et institutionnel lignes directrices.
Remarque : Transfert de gènes aux artères carotides communes de lapin est effectuée sur des lapins par un chirurgien à l’aide d’un anesthésiste ou un assistant.
1. transfert de gène aux artères carotides communes de lapin : pré-opération
- Anesthésier le lapin. Peser le lapin. Combiner la kétamine 30 mg/kg et 2 mg/kg de xylazine dans une seringue. Injecter la kétamine/xylazine intramusculaire (IM) dans les muscles paraspinous pour induire l’anesthésie.
- En attendant pour lapin à devenir anesthésiés, préparer la salle de préparation et les tables de la salle d’opération (OR).
- Dans la salle de préparation d’OR : placer la pommade ophtalmique et le patch de fentanyl à portée de la table de préparation ; mettre en place les tondeuses à cheveux et un vide pour raser le cou du lapin et l’oreille ; mettre de côté un tampon alcoolisé, un cathéter 24 x ¾", un orifice d’injection et ruban chirurgical pour fixer la ligne intraveineuse (IV) dans la veine des oreilles du lapin.
- Dans l’OR : mettre en place les équipements de surveillance et de positionner les sondes [électrocardiogramme (ECG), saturation en oxygène (SpO2), température] sur la table d’OR ; préparer l’oxygène et isoflurane ; attacher la bande de gaze pour le masque facial à fixer sur le lapin et placez le masque sur la tête de ligne du tableau.
NOTE : Les bandes de gaze attachés sur le masque devraient avoir 2 queues d’environ 45 cm. - Allumez la couverture au réchauffement de l’eau sur la table d’OR. Sur le dessus de la couverture de l’eau, placez une serviette roulée pour support de cou et une électrode de dispersion (plus tard placé sous le dos du lapin).
- Mettre en place la pompe ou IV avec 100 mL d’un solution salin sac IV avec une aiguille de 18-19G attaché et régler le débit à 10 mL/h / kg.
- Mélanger 1 mL de chlorhydrate de lidocaïne (solution mère de 2 %) et 1 mL de bupivicaine HCl (0,5 % solution mère) dans une seringue, pour être utilisé comme un analgésique local.
- Quand le lapin est complètement anesthésié, préparer le lapin pour la chirurgie.
Remarque : Vérifier l’absence d’un réflexe de pédale (pincée par orteil ; oeil pour retrait de branche) pour assurer la profondeur anesthésique et continuer à surveiller le réflexe pédale tout au long de la chirurgie.- Appliquer pommade ophtalmique pour les yeux. Enlever les selles du rectum du lapin en appuyant avec les doigts gantés sur le bas ventre antérieur (au-dessus du rectum) et le mouvement des doigts vers l’anus. Cela permettra plus tard mise en place d’une sonde de température rectale.
- Raser le cou antérieur de l’encoche sternal jusqu’au bord de la mandibule tout en utilisant un aspirateur à nettoyer la zone. Aussi se raser les deux oreilles pour le placement de l’IV et l’attachement de patch de fentanyl et raser un orteil moyen arrière gauche pour la sonde un oxymètre de pouls.
Remarque : Le protocole suppose que le chirurgien est sur le côté droit du lapin pour l’ensemble de la procédure. Si le programme d’installation de l’OR place le chirurgien sur le côté opposé, inverser les côtés dans cette étape de garder les fils et IV en face du chirurgien. Les côtés des étapes futures devraient également être commutées au besoin. - Essuyez l’oreille gauche avec un tampon alcoolisé, placer un cathéter IV de 24G, dans la veine de l’oreille gauche, couvrez-les avec l’orifice d’injection et tape le cathéter/port d’oreille du lapin pour le fixer. Appliquer un patch de fentanyl (25 µg/h) à l’oreille droite du lapin.
- Transporter le lapin dans l’OR et placer en position couchée sur la table d’opération avec une serviette de soutien col roulé sous le cou du lapin juste en dessous de la tête. Doucement s’étendent cou du lapin jusqu'à ce qu’elle est droite et horizontale environ.
- Accrochez le lapin jusqu'à le masque facial avec O2 sur à 1 L/min et commencer l’administration isoflurane. Fixez le masque en encapsulant les extrémités de la bande de gaze lié au masque autour de la serviette de soutien du cou sous le lapin. Ajustez l’isoflurane (généralement 1 à 2 %) selon vos besoins (basé sur la fréquence cardiaque, fréquence respiratoire et réflexe de pédale) pour maintenir une anesthésie appropriée pour le reste de la procédure.
- Veiller à ce que la plaque électrode de dispersion est bien centrée sous DOS du lapin. Déposez les sondes de température et de l’oxymètre de pouls et appliquez les cordons EKG sur le lapin.
- Raccorder la saline IV sur le port de sonde dans l’oreille du lapin, démarrer la pompe saline à 10 mL/h / kg.
Remarque : Après 1 h, la pompe saline peut être réduite à 5 mL/h / kg. - Restreindre les pattes avant du lapin en souplement les liant à la table. Éventuellement, placer une petite table en plastique sur le lapin pour protéger le lapin ne soient soumises à la pression thoracique/abdominale, le chirurgien s’appuyant sur thorax/abdomen du lapin.
NOTE : La petite table à prévenir la régurgitation forcée du contenu abdominal. - Injecter 2 mL de lidocaïne préalablement préparée (2 % stock) / bupivacaïne (0,5 % stock) (mix 50/50) par voie sous-cutanée le long de la ligne d’incision de cou prévues pour anesthésie locale.
- Laissez l’assistant préparent le champ opératoire avec 3 alternant scrubs de chlorhexidine et isopropanol, puis un spray avec betadine. Gommage, blouse et des gants, suivant une technique aseptique appropriée.
Remarque : Le chirurgien doit être vêtu 2 x loupes chirurgicales pour aider avec la première moitié de la chirurgie. Au cours de la chirurgie de survie, il est essentiel de maintenir la stérilité du chirurgien et du champ opératoire. Seulement l’assistant doit gérer tous les éléments non stériles, et matériel stérilisé doit être passé au chirurgien ou placé sur la table drapée instrument aseptiquement. Serviettes stériles permet de maintenir la stérilité lors de la manipulation de matériel non stérile comme le microscope par le chirurgien.
2. survie chirurgie (transfert de gènes)
- Préparer les instruments et un champ stérile.
- Laissez l’assistant ouvrir le pack drap stérile contenant un drapé de table, un drapé de papier pour le lapin et plusieurs serviettes. Conditions d’asepsie, transférer les articles au chirurgien.
- Drapé de la table de l’instrument. Place les 6 serviettes stériles et le papier drapé sur la table drapée.
- Avec 4 serviettes, drapez le cou du lapin, laissant seulement le site opératoire exposé (environ 4 cm x 10 cm). Posez le drap de papier sur le lapin.
- Laissez l’assistant ouvrir le pack instrument stérilisé et placez-la aseptiquement sur la table de l’instrument.
- Laissez l’assistant ouvrir l’équipement suivant et placer en conditions aseptiques sur la table de l’instrument ou à la main au chirurgien : trois seringues de 1 mL (et une aiguille si les seringues ne sont pas déjà chargés avec des aiguilles), une seringue de 20 mL, une aiguille 21G, une aiguille 19G, 3-0 Polyglycolic sutures acide (PGA), suture PGA 5-0, 7-0 suture en polypropylène et deux 24 G IV-cathéters.
- Fixer le câble de bistouri électrique pour le drapé de lapin à l’aide de la pince Kantrowitz et puis déposer la fiche fin hors de la table 7.25". Laissez l’assistant connecter le câble à l’appareil d’électrochirurgie et mettez l’appareil sous tension.
- Remplir une seringue de 20 mL de sérum physiologique stérile, prélevé une poche IV ou du flacon détenues par l’assistant. Utiliser cette solution saline au besoin pour garder les tissus exposés humide au cours de la procédure.
- Préparez une seringue de 1 mL avec 1 mL de milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, pour le lavage de l’artère). Pour chaque artère carotide qui va être transduite, 0,35 mL du virus dilué sont nécessaires. Si le même virus est utilisé pour les deux parties, préparer une seringue de 1 mL avec virus dilué dans DMEM à un volume de 0,7 mL. Si différents côtés reçoivent différents virus [par exemple un contrôle de virus « Null » d’un côté], préparer les deux seringues de 1 mL, chacun avec 0,35 mL de solution antivirus. Pour l’adénovirus helper-dépendante, la concentration de virus est 2 x 1011 particules virales (vp) / mL.
NOTE : Laisser l’assistant prépare le virus. Le chirurgien établit suspension DMEM et virus dans des seringues stériles. - Découper un trou dans le drapé. La taille du trou doit être la même taille que le champ opératoire sur le cou du lapin qui est encadrée par les serviettes à l’étape 2.1.3. Fixer les coins du trou dans le drap de papier pour les serviettes sous-jacentes qui sont drapées sur le cou du lapin avec les pinces de la serviette.
- Isoler les artères carotides communes.
NOTE : 2 x loupes chirurgicales devrait être utilisé pour cette partie.- Couper la peau avec un bistouri électrique le long de la ligne médiane qui s’étend d’environ 7-9 cm parotidien vers la mandibule et serrer la peau ouverte avec des colliers de serviette.
- Faites une coupe latérale courte à travers le carénage avec le bistouri électrique à l’extrémité caudale. Insérez ensuite les grands ciseaux dans la coupe et carrément disséquer le fascia le long de la ligne médiane ensemble. Couper le fascia disséqué vers le bas de la ligne médiane avec le bistouri électrique.
- Avec des petits ciseaux de dissection, disséquer entre les muscles en forme de V (sternocephalic musculaire) et le muscle de sternohyoid sur la trachée, d’exposer les artères carotides communes, à partir du côté droit.
- Disséquer l’artère carotide commune droite contre les tissus environnants, divisant toutes les branches, depuis la base du cou en direction caudale au croisement du nerf pharyngien parotidien. Utilisation les boucles de silicium chirurgicales pour aider à se rétracter l’artère au cours de la dissection.
Remarque : Il faut ne pas déranger le nerf vague qui est parallèle à la carotide commune, ou bien les petits nerfs qui traversent la carotide commune. - Ligaturer les grosses branches se détacher de l’artère carotide commune (1-2 par côté) avec suture soie 5-0 avant de couper la branche distale pour libérer un segment de 4-5 cm de la carotide. Couper les branches ligaturées 1-2 mm de la cravate afin que la cravate ne glisse pas hors tension.
- Répétez la dissection du côté gauche (étapes 2.2.3 - 2.2.5).
- Infuser les vecteurs dans les artères carotides communes.
Remarque : Un microscope chirurgical (16 X) est utilisé au besoin pour effectuer l’artériotomie, infusant la lutte antivectorielle/solution et la réparation de l’artériotomie.- Laissez l’assistant retirer la loupe chirurgicale le chirurgien et déplacez-y le microscope chirurgical de position. Drapez une serviette stérile sur le microscope pour permettre la manipulation du microscope sans contaminer le champ stérile.
- Injecter de l’héparine [150 unités internationales (UI) / kg] dans le cathéter IV et rincer avec 10 mL de sérum physiologique.
- Revenant à la carotide commune droite isolée, mettre deux cravates en soie autour de la partie médiane du segment mobilisé carotide et nouez un nœud unique de chacun - sans les serrer.
- Plier l’aiguille 19G juste au-dessus du biseau à environ 80° avec le pilote de la grande aiguille (ne pas plier le biseau ; La figure 1).
- Bloquer l’artère à chaque extrémité du segment isolé avec clips vasculaires, plaçant le clip crânien tout d’abord pour permettre l’artère remplissage et puis en plaçant la pince caudale.
- La perforation de l’artère carotide commune avec l’aiguille 19G plié juste crânienne au clip vasculaire caudal, prenant bien soin de ne pas percer les murs arrière ou latérales. Faire avancer la pointe de l’aiguille dans la lumière et se retirer deux fois pour s’assurer qu’artériotomie traverse complètement la paroi de l’artère. Ensuite soigneusement retirer l’aiguille.
Notes : Il est important de créer une artériotomie qui pénètre toutes les couches de la paroi de l’artère proprement et ne pas disséquer la paroi de l’artère (en passant axialement dans l’adventice et médias). Pour ce faire, la carotide devrait être perforée avec la pointe de l’aiguille positionnée aussi près que possible à un angle de 90° contre la paroi de l’artère (Figure 1). Ponction carotidienne à un angle de 90° est facilitée en saisissant l’artère par l’adventice avec une pince fine et en soulevant doucement la surface de l’artère tout en appuyant sur la pointe de l’aiguille juste caudale jusqu’au point de levage. Cette manoeuvre a également réduit le risque de frapper le mur arrière (Figure 1). - Dépliez et tas-up plusieurs tampons de gaze dans un nid sur lequel mettre la seringue utilisée pour les infusions. Placer le nid sur la poitrine du lapin caudale à l’incision.
- Mettre un cathéter IV à la seringue contenant DMEM uniquement (pas trop serré) et plier le cathéter environ 4 mm de l’extrémité pour le coude tient à environ 75° après qu’il est libéré.
- Insérer le IV-cathéter dans l’artère jusqu’au point de virage et laver tout le sang de l’artère avec DMEM (~ 0,25 mL x 2). Pour chaque lavage, remplir l’artère de DMEM et puis enlever DMEM résiduelle de la lumière du vaisseau en appuyant doucement sur l’artère avec un doigt ganté, commençant juste caudal au clip vasculaire crânien. Tout en maintenant une légère pression, glissez le doigt de crânienne à la caudale. Le contenu luminal se lavent par l’intermédiaire de l’artériotomie.
- Garder le cathéter dans l’artère et échanger la seringue DMEM pour la seringue contenant la solution antivirus. Assurez-vous qu’aucun air ne pénètre dans le cathéter.
- Faites glisser les cravates en soie vers le bas de l’artère afin qu’elles entourent l’artère à l’endroit de l’extrémité du cathéter, mais ne serrez pas eux.
- Faire infuser 0,03 mL de la solution antivirus pour pousser le DMEM restant sur le cathéter et puis vider l’artère. Réduisez-la en enlevant à nouveau tous les fluides de la lumière avec un doigt, extrémité caudale (comme dans l’étape 2.3.9).
- Serrer les deux liens autour de cathéter pour sceller la lumière. Faire infuser la solution antivirus (~ 0,25 mL ; 2 x 1011 vp/mL pour les adénovirus) en appuyant sur le piston de la seringue doucement jusqu'à ce que l’artère est distendue au calibre physiologique.
Remarque : Il est important que l’artère se développe au calibre physiologique et qu’il reste distendue durant la perfusion de virus. Si ce n’est pas le cas, le degré de transfert de gènes va baisser significativement. - Déposer délicatement la seringue sur le nid de la gaze.
- Placer une suture en polypropylène 7-0 dans l’adventice carotide commune juste caudale du clip vasculaire crânien pour marquer la limite crânienne de transduction de gène
- Après que la solution contenant le virus a été dans la lumière de l’artère pendant 20 min, retirer la seringue contenant le virus et remplacez-la par une seringue vide. Aspirer la solution contenant le virus doucement jusqu'à ce que le navire s’effondre et enlevez la seringue. Couper ou annuler les cravates en soie et retirer doucement le cathéter.
NOTE : Couper les liens sida très court à les éliminer. Retirer le cathéter avec précaution pour ne pas endommager l’endothélium carotidienne. - En utilisant le microscope chirurgical, fermer l’artériotomie en polypropylène 7-0 à l’aide d’un modèle X (Figure 2).
- Faire une première passe entrant en bas à droite de l’artériotomie et abandonné le navire en bas à gauche. Puis traverser l’ouverture et faire un second passage de haut-droite, en haut à gauche.
- Avant d’attacher vers le bas de la suture, débusquer l’artère en relâchant très brièvement le clip vasculaire crânien. Sang s’écoule hors de l’artériotomie lorsque le clip est sorti, enlevant air et virus résiduel de la lumière.
- Tirer la suture pour doucement fermer l’artériotomie et attacher un fil de suture avec 2 noeuds de square.
Remarque : En tirant la suture trop serré entraînera groupage du tissu qui perturbera la circulation, en augmentant le risque de thrombose et en modifiant les flux qui peut être une variable importante incontrôlée dans les modèles de maladies.
- Relâchez le clip vasculaire crânien, puis le clip vasculaire caudal à l’aide d’une légère pression avec de la gaze pour arrêter tout saignement. Si le saignement persiste, continuer la pression pendant 1-2 min. Si l’artériotomie était bien fermé, le saignement s’arrête toujours dans ce laps de temps.
- Laissez l’assistant injecter buprénorphine [0,02 mg/kg ; sous-cutanée (SQ)] à propos cette fois de fournir l’analgésie postopératoire jusqu'à ce que les concentrations plasmatiques de fentanyl devient thérapeutiques.
Remarque : Une deuxième buprénorphine injection (0,02 mg/kg ; SQ) peut être nécessaire 6 h après la première injection de maintenir une analgésie jusqu'à ce que les concentrations plasmatiques de fentanyl devient thérapeutiques. - Répétez les protocole de perfusion de virus à gauche en suivant les étapes 2.3.2 - 2.3.19.
- Fermeture de la plaie
- Utilisez une suture de PGA 5-0 pour fermer le carénage de la ligne médiane avec une suture continue.
- Avec une suture de PGA 3-0, fermer la peau avec un modèle intradermique à l’aide d’un noeud enterré aux deux extrémités.
- Nettoyage et récupération post-opératoire.
Remarque : Le lapin doit être surveillé en permanence pour une bonne oxygénation et la température corporelle tout en récupérant de l’anesthésie. Devrait se faire dans un environnement calme et tranquille.- Désactiver les flux isoflurane et d’oxygène et enlever le masque de lapin.
- Décrocher les fluides IV mais laisser le port IV en place pour l’accès des secours IV.
- Prenez le lapin à la zone de récupération et couchez sur le côté dans une cage avec une couverture d’eau-réchaud allumé (ou éventuellement un radiateur de Bair Hugger).
- Donner O2 par masque jusqu'à ce que le SpO2 est stable.
- Laissez que le lapin récupérer dans une cage, retournant de l’autre côté toutes les 15 min, jusqu'à ce que le lapin peut s’asseoir sur ses pattes arrières et se déplacent.
- Quand le lapin est mobile, retirez la IV de son oreille avant de retourner à la cage.
Remarque : Ne retournez pas le lapin à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce qu’il est complètement remis de l’anesthésie.
- Disposer de tout ce qui a été en contact avec le vecteur ou était dans le champ opératoire, remoulages et biohazard approprié suivant déchets protocoles.
3. transfert de Gene aux artères carotides communes de lapin : soins post-opératoires
- Évaluer l’état global du lapin par jour après la chirurgie, recherchant la cicatrisation des plaies, preuve de l’infection, l’appétit, la respiration et des signes de douleur.
- Vérifier la position d’oreille du lapin (les oreilles vers le bas peuvent être un signe de douleur ou de détresse, surtout lorsqu’il est couplé avec un aspect désordonné). Vérifiez que le lapin reste mobile et active. Vérifier le lapin pour une respiration normale sans stridor. Vérifiez que la plaie est propre, sec et intact. Vérifier le lapin pour une température corporelle normale. Consulter les services vétérinaires si le lapin n’est pas mobile et active, avec une température corporelle normale, un aspect bien rangé, une plaie propre et normale de la respiration.
- Vérifiez la prise alimentaire normale et preuve des selles fraîches et l’urine.
Remarque : La prise alimentaire peut être réduite après la chirurgie, mais devrait revenir à la normale dans les 2 jours ; fournir de la nourriture supplémentaire au besoin.
- Retirer le patch de fentanyl au jour postopératoire 3.
NOTE : Buprénorphine peut être administrée selon les besoins pour les douleurs post-opératoires qui ne sont pas géré par le patch de fentanyl, ou dans le cas où le patch de fentanyl est retiré au début.
4. terminal récolter chirurgie : pré-opération
- Anesthésier le lapin. Voir les sections 1.3 et 1.3.5 concernant l’obtention et le maintien de l’anesthésie.
- Peser le lapin. Combiner la kétamine 30 mg/kg et 2 mg/kg de xylazine dans une seringue. Injecter la kétamine/xylazine IM dans les muscles paraspinous pour induire l’anesthésie.
- Préparer la salle de préparation et ou les tables pendant que vous attendez le lapin à devenir anesthésiés.
- Dans la salle de préparation d’OR : installation de tondeuses à cheveux et un vide pour raser le cou et les oreilles du lapin.
- Dans la salle d’opération : installation d’équipements de surveillance et de positionner les sondes (SpO2, température) sur la table d’OR ; préparer l’oxygène et isoflurane ; Attachez une bande de gaze pour le masque facial à fixer sur le lapin et placez le masque sur la tête de ligne du tableau.
NOTE : Les bandes de gaze attachés sur le masque facial doivent avoir 2 queues d’environ 45 cm. - Allumez la couverture au réchauffement de l’eau sur la table d’OR. Sur le dessus de la couverture de l’eau, placez une serviette roulée pour support de cou et une électrode de dispersion (plus tard placé sous le dos du lapin).
- Mélanger 1 mL de chlorhydrate de lidocaïne (stock 2 %) et 1 mL de bupivicaine HCl (0,5 % stock) (mix 50/50) dans une seringue comme analgésique local.
- Quand le lapin est complètement anesthésié, préparer le lapin pour la chirurgie.
- Enlever les selles du rectum, tel que décrit à l’alinéa 1.3.1, pour permettre plus tard mise en place d’une sonde de température.
- Raser le lapin de l’encoche du sternum à l’angle de la mandibule tout en utilisant un aspirateur à nettoyer la zone. Aussi vous raser l’orteil moyen arrière gauche pour la sonde un oxymètre de pouls.
Remarque : Le protocole suppose que le chirurgien sera sur le côté droit du lapin. Si le programme d’installation OR placera chirurgien du côté opposé, inverser les côtés dans cette étape pour maintenir les fils en face du chirurgien. Les côtés des étapes futures devraient également être commutées au besoin. - Transporter le lapin dans l’OR et placer en position couchée sur la table d’opération avec une serviette de soutien col roulé sous le cou du lapin juste en dessous de la tête. Doucement s’étendent cou du lapin jusqu'à ce qu’elle est droite et horizontale environ.
- Accrochez le lapin jusqu'à masque facial avec O2 sur à 1 L/min et commencer l’administration isoflurane. Fixez le masque en encapsulant les extrémités de la bande de gaze lié au masque autour de la serviette de soutien du cou sous le lapin. Ajuster l’isoflurane (généralement 1 à 2 %) au besoin pour maintenir une anesthésie appropriée pour le reste de la procédure.
- Assurez-vous que la plaque électrode de dispersion est bien centrée sous DOS du lapin. Placer les sondes de température et oxymètre de pouls.
- Restreindre les pattes avant du lapin en souplement les liant à la table.
Remarque : Vous pouvez également recouvrir une petite table en plastique lapin pour protéger le lapin ne soient soumises à la pression thoracique/abdominale, le chirurgien s’appuyant sur thorax/abdomen du lapin. Le but ici est d’empêcher la régurgitation forcée du contenu abdominal. - Injecter 2 mL de lidocaïne (2 % solution mère) / bupivacaïne (0,5 % solution mère) (50/50 mix ; à partir de l’étape 2.4) par voie sous-cutanée le long de la ligne d’incision de cou prévues pour anesthésie locale.
- Vaporiser le site chirurgical avec betadine. Enfilez des gants propres pour les interventions chirurgicales.
5. terminale chirurgie (récolte de navire)
- Préparer les instruments et le champ opératoire.
- Ouvrir un drap propre pack contenant une table drapé et le drapé d’un papier pour le lapin. Drapé de la table de l’instrument.
- Ouvrez le pack instrument, placez-la sur la table de l’instrument et ranger instruments. Placer l’équipement suivant sur la table de l’instrument : une seringue de 20 mL et une aiguille de 21G.
- Fixer le câble de bistouri électrique pour le drapé de lapin à l’aide de la pince Kantrowitz 7.25". Branchez la fiche sur l’appareil d’électrochirurgie et allumez-le.
- Remplissez une seringue de 20 mL avec du sérum physiologique stérile. Utiliser cette solution saline au besoin pour garder les tissus exposés humide au cours de la procédure.
- Placez le papier drapé sur le lapin et faites un trou dans le drapé sur le site de la chirurgie sur le cou du lapin. Serrez les coins du trou en place pour la peau du lapin avec les pinces de serviette.
- Isoler les artères carotides communes.
NOTE : 2 x loupes chirurgicales devrait être utilisé pour cette partie.- Couper la peau avec un bistouri électrique le long de la ligne médiane qui s’étend environ 7-9 cm parotidien vers le mandibule et pince la peau ouverte avec des colliers de serviette.
Remarque : Si la récolte est seulement quelques jours après l’intervention précédente, bistouri électrique est inutile. Il suffit de couper les sutures et tirer délicatement ouverte l’incision de la chirurgie antérieure. - Faites une coupe courte latérale par l’intermédiaire de l’aponévrose avec un bistouri électrique à l’extrémité caudale. Insérez ensuite les grands ciseaux dans la coupe et carrément disséquer le fascia le long de la ligne médiane ensemble. Couper le fascia disséqué vers le bas de la ligne médiane avec le bistouri électrique.
- Avec des petits ciseaux de dissection, disséquer entre les muscles en forme de V (sternocephalic musculaire) et le muscle de sternohyoid sur la trachée, à isoler les artères carotides communes, à partir du côté droit.
- Disséquer l’artère droite contre entourant les tissus depuis la base du cou en direction caudale au croisement du nerf pharyngien parotidien. Utilisation les boucles de silicium chirurgicales pour aider à se rétracter l’artère au cours de la dissection.
- Répétez la dissection du côté gauche (étapes 5.2.3 - 5.2.4).
- Avec une suture de soie de 3-0, ligaturer l’artère carotide commune crânienne au segment qui a été infusé avec le vecteur (utilisation de suture adventitiels placé à la première intervention chirurgicale pour localiser l’étendue crânienne de perfusion de vecteur. Puis ligaturer la carotide caudale à l’artériotomie réparé.
- Le segment carotid entre les trompes de l’accise et rincer la lumière avec une solution saline. Couper les tissus adventitiels en excès loin du navire et couper le segment de la carotid en petits morceaux pour les différentes analyses de point de terminaison (histologie, ADN, l’acide ribonucléique (ARN), protéine, explant culture, etc..).
- Injecter 1 mL de Beuthanasia IV à euthanasier et confirmer l’euthanasie du lapin.
- Couper la peau avec un bistouri électrique le long de la ligne médiane qui s’étend environ 7-9 cm parotidien vers le mandibule et pince la peau ouverte avec des colliers de serviette.
- Disposer de tout ce qui a été en contact avec un vecteur ou était dans le champ opératoire, remoulages et biohazard approprié suivant déchets protocoles.
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Representative Results
Pour implémenter cette méthode avec confiance, les expériences préliminaires sont nécessaires pour établir que l’exploitant réalise un transfert efficace et reproductible de gènes, avec l’expression du transgène principalement dans les cellules endothéliales luminales. Dans notre expérience, c’est plus facile d’évaluer à l’aide d’un vecteur qui exprime la β-galactosidase. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) coloration des segments carotides communes enlevé 3 jours après la perfusion de vecteur, ainsi que la mesure de la β-galactosidase ARNm (ARN messager) avec chaîne de polymérase quantitative de transcription inverse réaction (qRT-PCR), révélera l’efficacité, la reproductibilité et la localisation des cellules transduits. Pour les expériences qui étudier les effets de l’expression du transgène ou de mesurent l’activité des éléments transcriptionnelles intramoléculaires, nous mesurent généralement de transgene ARNm comme une première indication du niveau et de la reproductibilité du transfert de gènes.
Un nouvel opérateur dans notre laboratoire a cherché à établir la compétence avec cette méthode de transduction des artères carotides communes avec un vecteur adénoviral (2 x 1011 vp/mL) du lapin exprimer un transgène de β-galactosidase, conduit par un cytomégalovirus (CMV) promoteur. Transduite artères ont été récoltées à 3 jours plus tard et ont été coupés transversalement en segments. Segments individuels étaient alors soit coupe ouverte axialement ou laissé comme anneaux intacts. Tous les segments ont été coloré dans des tubes de microcentrifuge de X-gal. Segments qui avaient été coupés ouverts axial ont été placés sur une surface horizontale et la surface luminale exposés au maximum, en utilisant les broches au besoin pour empêcher le segment de curling vers le haut. En face des images de la surface luminale a montré une coloration endothéliales robuste avec X-gal (Figures 3 a et 3 b). Des images axiales de la surface luminale des anneaux carotide intacts ont montré X-gal coloration seulement sur la surface luminale (Figures 3 et 3D). Les segments qui avaient été ouverts axialement ont été transformées en paraffine, sectionnées et Counter-colorés à l’hématoxyline et éosine ou nucléaire rapide rouge. Images Voir la X-gal coloration principalement dans l’endothélium, bien qu’il y a une petite quantité de coloration dans la couche adventitiels (Figures 3E et 3F). Transduction de cellules adventitiels pourrait se produire par l’intermédiaire de fuite du vecteur à travers le site de l’artériotomie ou en fuite par l’intermédiaire de petites branches proximales sur les sites de ligature de branche de côté. 29
Dans une expérience distincte, un nouvel opérateur a cherché à établir la compétence dans la réalisation des niveaux d’expression du transgène, comme un prélude à des expériences visant à déterminer les activités biologiques des transgènes reproductibles. Lapin des artères carotides communes étaient transduites avec adénovirus helper-dépendante (2 x 1011 vp/mL) contenant un ou l’autre apo A-I (HDAdApoAI) ou transgène IL-10 (HDAdIL10), toutes deux sous contrôle d’un promoteur de CMV. Transduite artères ont été récoltées à 3 jours après le transduction et coupés transversalement en segments. L’ARN a été extrait des segments vasculaires et apo A-I et expressions de l’ARNm de l’IL-10 ont été quantifiées par qRT-PCR, avec normalisation de glycéraldéhyde 3-phosphate-déshydrogénase (GAPDH) ARNm dans le même extrait (Figure 4). Dans les artères HDAdIL10-transduites, seulement 1 sur 6 artères avaient un très faible, mais détectable apo A-I signal d’ARNm. Signifier l’expression de l’apo A-I ARNm est 700-fold plus élevée dans les vaisseaux transduites avec HDAdApoAI que dans les vaisseaux transduites avec HDAdIL10. Faibles niveaux d’ARNm endogène de IL-10 ont été détectés dans les artères HDAdApoAI-transduites, avec moyenne expression a augmenté 6 fois en HDAdIL10-transduites artères. À noter, il y a intra - et inter - artery une variabilité considérable dans l’efficacité de la transduction et expression du transgène, comme illustré dans les Figures 3 et 4, respectivement. Nous trouvons cette variabilité même avec opérateurs expérimentés.
Figure 1 . Artériotomie dans l’artère carotide commune. Pince fine est utilisés pour saisir l’adventice de la carotide et appliquer une traction vers le haut de l’artère. Cette manœuvre augmente la lumière du vaisseau et génère une surface verticale dans lequel est inséré l’aiguille 19G tordue, minimisant ainsi le risque de perforation de la paroi arrière de l’artère. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Fermeture de l’artériotomie carotide commune. L’artériotomie est fermée avec une suture en polypropylène 7-0, à l’aide d’un modèle X. Le premier passage de l’aiguille et la suture entre la lumière de l’artère au bas à droite de l’artériotomie (site 1) et sort de la lumière en bas à gauche (site 2). L’aiguille et la suture puis traversent l’artériotomie et entrez à nouveau la lumière en haut à droite (site 3). L’aiguille sort ensuite la lumière en haut à gauche (site 4). Une traction douce sur les deux extrémités du fil de suture ferme l’artériotomie. Les extrémités de la suture (en sortant du site 1 et 4) sont à égalité avec 2 noeuds de square. Les cercles gris représentent les sites de sutures en passant à travers la paroi des vaisseaux. Solides lignes bleues indiquent les zones où la suture est à l’extérieur de la paroi des vaisseaux. Les lignes bleues en pointillé indiquent les zones où la suture est dans la lumière. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Expression du transgène endothéliales efficace. Les artères carotides communes de lapin ont été transduites avec un vecteur adénoviral exprimer un transgène de β-galactosidase et récoltés trois jours plus tard. Segments de l’artère transduite étaient X-gal teinté anneaux intacts ou après être ouverte avec une coupe axiale. (A-B) En face des images de la surface luminale des anneaux carotides qui ont été découpé selon l’axe. (C-D) Vues axiales dans l’espace luminale des anneaux carotide intacts. (E-F) X-gal teinté, paraffine carotides segments ont été sectionnés et Counter-souillés (E) l’hématoxyline et éosine ou (F) nucléaire rapide rouge. Echelle = 100 µm. J’ai = intima ; M = médias ; et un = adventice. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Quantification de l’expression de l’ARNm transgene. Les artères carotides communes de lapin ont été transduites avec adénovirus helper-dépendante exprimant soit apo A-I (HDAdApoAI) ou IL-10 (HDAdIL10) sous le contrôle d’un promoteur de CMV. Les artères ont été récoltés trois jours plus tard. expression de l’ARNm des Apo (A)-j’ai et (B) IL-10 ont été quantifiés par qRT-PCR, normalisé d’ARNm GAPDH dans la même artère et exprimées en unités arbitraires (UA). Barre indique la valeur moyenne ; Valeur de P est de rang-somme test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Avantages | Inconvénients | |
| Par rapport aux modèles de rongeurs | Plus proche phylogénétiquement de primates | Plus cher à l’achat et la maison |
| Une plus grande diversité génétique, assouplissement traduction clinique | Plus difficiles à élever et gérer | |
| Grands navires permettent plus facilement les manipulations chirurgicales et fournit plus de tissu pour analyse quantitative | Exigences réglementaires plus étendues | |
| Permet l’utilisation de dispositifs endovasculaires conçu pour l’homme | Moins de milieux génétiquement modifiés | |
| Moins-une vaste sélection d’anticorps dirigés contre les protéines de lapin | ||
| Par rapport à des modèles animaux plus gros | Relativement peu coûteux à l’achat et la maison | Peut-être moins cliniquement pertinents que d’autres grands modèles animaux pour certaines maladies vasculaires |
| Plus facile à reproduire et gérer | ||
| Par rapport à la transgénèse germinale | Transgène n'exprimé que dans les grosses artères ; effet du transgène spécifiquement au site d’intérêt peut être déterminée | Application de la méthode de cellules autres que l’endothélium est difficile |
| Pouvez utiliser carotide controlatérale comme témoin apparié ; élimine les paramètres systémiques (p. ex.., la tension artérielle, cholestérol) comme variables incontrôlées | Salle d’opération et expertise chirurgicale requise ; les installations susceptibles de base n’est pas disponible | |
| Débit plus élevé pour tester l’activité réglementaire séquence ADN dans l’endothélium de gros vaisseaux | Transgène ne peut s’exprimer dans la plupart des lits vasculaires | |
| Potentiellement plus rapide et moins cher | ||
| L’exposition systémique à la protéine transgénique improbable — minimise les effets hors cible | ||
| Par rapport aux approches systémiques de thérapie génique (p. ex.. Transduction du foie par injection dans la veine périphérique) |
Expression du transgène plus stable que la thérapie génique (foie) systémique | La prestation de vecteur nécessite une intervention chirurgicale |
| Transgene a exprimé dans la paroi de l’artère, permettant la distribution locale des taux élevés de protéines transgéniques | Salle d’opération et expertise chirurgicale requise | |
| L’exposition systémique à la protéine transgénique improbable — minimise les effets hors cible | Traitement limité aux artères qui sont spécifiquement destinés à l’intervention ; ne traite pas les facteurs systémiques (p. ex.., lipides) | |
| Pouvez utiliser carotide controlatérale comme témoin apparié ; élimine les paramètres systémiques (p. ex., tension artérielle, cholestérol) comme variables incontrôlées | ||
| Beaucoup plus faible dose de vecteur nécessaire |
Le tableau 1. Avantages et inconvénients du modèle de transfert de gène endothéliales sélectif lapin commun l’artère carotide.
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Discussion
Certains aspects de la technique chirurgicale méritent une attention particulière. Une exposition complète et mobilisation de l’artère carotide commune via une dissection minutieuse volonté faciliter réparation artériotomie et de transfert de gène. Cependant, au cours de la dissection, la manipulation directe de l’artère carotide devrait être minimisée pour empêcher un spasme vasculaire. En outre, tout saignement adjacent à l’artère doit être arrêté en appuyant légèrement avec de la gaze et épanchements de sang devrait être nettoyé immédiatement en rinçant la zone avec un soluté physiologique. Il est également important éviter d’endommager le nerf vague, qui est parallèle à l’artère carotide commune. Tailler l’adventice dans le domaine de l’artériotomie planifiée va aider l’opérateur pour effectuer une artériotomie propre et fonctionnelle tant pour réparer l’artériotomie. Enfin, bifurque de l’artère carotide commune doit être identifiés et ligaturées solidement pour éviter les fuites du vecteur de la carotid lumen.
Il y a aussi des aspects cruciaux de la perfusion de vecteur et de la réparation de l’artériotomie. Durant la perfusion de vecteur, il est important de distendre la carotide commune de calibre physiologique ou légèrement supérieur pour atteindre la transduction efficace. Lors de la réparation de l’artériotomie, la suture doit pénétrer dans la paroi des vaisseaux aussi près que possible aux bords de l’artériotomie et devrait proprement entrer et sortir la lumière plutôt que d’aller axialement à travers la paroi des vaisseaux. Si seulement les couches externes de la paroi des vaisseaux sont rassemblés car la suture passe axialement dans la paroi vasculaire plutôt qu’en passant radialement à travers le mur et entrer la lumière, un écart restera dans l’intima et augmentera le risque de thrombose. Si les pénétrations de suture sont trop espacées, ou si la suture est trop serrée lorsque liés, des plis de tissus seront créés sur le site de l’artériotomie. Ces plis perturbent le flux laminaire normale du sang, augmentant aussi risque de thrombose. Maintien des caractéristiques d’écoulement uniforme est important pour les expériences réalisées sur des modèles animaux de maladies (p. ex.., athérosclérose) parce que la modification du débit peut contribuer à la maladie processus30.
Nouveaux opérateurs rencontrent souvent thrombosée artères lors de la récolte. La thrombose luminale est une complication dévastatrice, rendu inutilisable comme un échantillon expérimental de l’artère. Pour prévenir la thrombose, que nous appliquons systématiquement héparine IV avant le transfert de gènes. Thrombose est également empêchée par attention fermeture de l’artériotomie, tel que décrit ci-dessus. Le dosage de l’héparine pourrait être augmenté pour prévenir la thrombose ou l’aspirine pourrait être donnée après l’opération. Cependant, une plus forte dose d’héparine augmenterait également le risque de complications hémorragiques et l’aspirine pouvant gêner l’expérimental des points de terminaison, surtout si l’inflammation est à l’étude. Par conséquent, il est préférable de se concentrer sur la meilleure technique chirurgicale comme moyen de prévention de la thrombose.
Si manipulé trop vigoureusement, artères carotides peuvent subir le spasme, qui pourrait également contribuer à la thrombose en diminuant le débit. Si vasospasme est rencontré, il peut être soulagée par l’application de topique papavérine. Lorsque le navire récoltes sont prévues pendant plus de 2-3 jours après la transduction et la thrombose est une préoccupation, échographie transcutanée peut être utilisé pour évaluer la perméabilité vasculaire non invasive. Découverte des artères thrombosées peut conduire à l’euthanasie pour économiser sur les coûts du logement. Animaux supplémentaires peut également s’inscrire sans tarder, pour remplir des groupes expérimentaux. PERI - et post - intervention mortalité associée à cette méthode doit être < 1 % (i.e., pas différente de la mortalité liée à d’autres chirurgies effectuées sur des lapins en bonne santé)31.
Après un opérateur sera à l’aise avec les aspects techniques du protocole chirurgical, une capacité à effectuer des transferts de gènes efficaces à l’endothélium doit être vérifiée, en utilisant des approches décrites dans la section ci-dessus sur les résultats représentatifs. Si des problèmes surviennent avec la réalisation d’un transfert de gènes reproductible, le coupable est probablement dans l’un des deux domaines. Après que le navire est isolé et le sang se lave avec de la lumière, il est important de retirer le tampon de lavage DMEM afin que la solution perfusée vecteur n’est pas diluée au cours de la transduction. L’autre aspect important est à distendre le navire à calibre physiologique ou légèrement supérieur au cours de la perfusion de vecteur. Parce que, selon notre expérience, une artère carotide qui n’est pas complètement distendue ou ne reste pas distendu pendant la perfusion de 20 minutes avec fiabilité a faible transgene expression, il est probable qu’une dilatation de l’artère de calibre physiologique améliore la transduction efficacité. Cependant, nous avons jamais étudié cela systématiquement. Il est possible que l’augmentation de la pression de perfusion au-dessus des niveaux physiologiques pourrait accroître l’efficacité de la transduction et permettent également des niveaux plus élevés de la transduction des cellules dans les médias vasculaires. Cependant, rupture de la barrière endothéliale serait probablement endommager le navire et augmenter le risque de thrombose. Si le navire ne reste pas distendu pour la période de 20 minutes tout vecteur d’incubation, il est probable que le vecteur est une fuite des branches de l’artère carotide commune. Soyez prudent au cours de la dissection à identifier et à ligaturer toutes les branches pour éviter les fuites du vecteur de la carotid lumen.
Cette méthode présente plusieurs limites qui sont liées à l’usage des lapins. Les lapins sont moins chers loger et nourrir que d’autres grands animaux (chiens, cochons, moutons) ; Cependant, les coûts d’achat, logement et nourrir les lapins sont considérablement plus que pour les souris et les rats. Les installations de salle d’opération et les exigences réglementaires pour les chirurgies de lapin sont également beaucoup plus étendues que pour les rongeurs. En outre, une expertise technique considérable est nécessaire pour effectuer le protocole de transfert de gène chirurgicale efficacement. Cette expertise peut être acquis par les opérateurs qui n’ont eu aucune formation chirurgicale. Au moins 2 personnes dans notre groupe (y compris le principal auteur de ce manuscrit) ont appris les techniques chirurgicales et appliqué leur manière productive. Néanmoins, la formation méticuleuse et une validation minutieuse de l’efficacité de transfert de gène de l’opérateur et de la reproductibilité (comme décrit dans la section résultats représentatifs) sont nécessaires avant que l’opérateur puisse commencer à générer des données de haute qualité.
Confinement de transgene expression presque exclusivement à l’endothélium avec cette méthode29,32,33,34,35,,du3637 est utile qu’elle permet des effets du transgène dans les cellules endothéliales et mesure de l’activité d’intramoléculaires séquences régulatrices de l’ADN dans les cellules endothéliales. Un petit nombre de cellules adventitiels ou médiales peut être transduite ; Cependant, l’incapacité de cette méthode pour transmettre efficacement les cellules nonendothelial empêche l’application de la méthode à l’étude d’autres types de cellules de la paroi vasculaire (telles que les cellules musculaires lisses et les macrophages). Bien que la surexpression de protéines sécrétées de cellules endothéliales transduits peut permettre l’étude des effets de ces protéines sur les autres cellules vasculaires les types, les rôles des protéines non sécrétée dans ces autres types de cellules vasculaires (e.g. récepteurs ou les protéines impliquées dans la transduction du signal) ne peut pas être l’objet d’une enquête avec cette méthode.
Comme un moyen pour les essais de thérapie génique axés sur le mur l’artère, la méthode diffère des autres méthodes précliniques de deux manières principales. Tout d’abord, la méthode utilise un modèle de lapin pour in vivo essais de thérapie génique plutôt que du plus couramment utilisé des modèles de rongeurs8,12,15,38,39. L’utilisation de lapins permet d’évaluation d’expression du transgène et le rôle biologique du produit transgénique dans un modèle animal non consanguine, qui est plus représentative de la diversité génétique humaine que sont les rongeurs consanguines. Le modèle peut être utilisé pour évaluer la thérapie génique dans les deux artères de lapin normal ou dans les artères de lapin disposant de pathologie artérielle qui est semblable à celle trouvée dans les artères malades humains. Les artères de lapin sont également plus proches de taille humaines artères que sont les artères rongeurs et fournir des tissus beaucoup plus pour l’analyse qu’est disponible à partir des artères rongeurs. La deuxième différence majeure est que cette méthode utilise une approche chirurgicale pour livrer le transgène vecteur à l’endothélium vasculaire. Thérapie génique somatique est souvent livrée systématiquement, plus fréquemment en ciblant le foie dans le but de modifier les concentrations plasmatiques du transgène protéines25,40. En ciblant l’endothélium vasculaire, la méthode fournit le produit de transgènes thérapeutiques au niveau local, avec son pic de concentration dans la paroi de l’artère, précisément où elle est nécessaire pour le traitement de maladies vasculaires. En livrant le transgène que localement, la méthode élimine également les effets secondaires systémiques du produit transgénique. Autres groupes élaborent des méthodes utilisant des peptides, anticorps ou autres modifications de capside pour cibler les vecteurs systémiquement injectées à l’endothélium sain ou malade pour fournir de41,thérapie génique vasculaire locale42 , 43. Cependant, ces méthodes de ciblage restent en cours d’élaboration et sont encore compliquées par transduction systémique substantielle, en particulier dans le foie42,43,44. Notre méthode chirurgicale fournit une présentation précise et efficace de transgènes à l’endothélium vasculaire avec transduction minimale - le cas échéant - à d’autres endroits. 1 la méthode est également un plus pratique, efficace et supérieur-tout au long de la moyenne (par rapport à la transgénèse germinale ou injection systémique des vecteurs endothéliales ciblés) pour tester l’activité des séquences régulatrices de l’ADN dans le grand récipient endothélium, pour fonction de protéine test transgène dans la paroi de l’artère et pour les essais de thérapie génique navire-mur-ciblés.
Cette méthode permet d’enquête sur le rôle biologique d’un transgène, lorsqu’il est exprimé dans l’endothélium des grosses artères. Si modifié pour perte de fonction explicite réactifs tels que les récepteurs négatives dominantes ou épingle à cheveux court RNA, il autoriserait enquête sur le rôle des protéines endothéliales endogènes et les voies de signalisation. La méthode peut également être utilisée pour mesurer l’activité transcriptionnelle de toute séquence d’ADN intramoléculaires dans les grosses artères cellules endothéliales5,6,7. En outre, la méthode permet de tester n’importe quel type de vecteur de transfert de gène d’efficacité et de sécurité lorsque remis localement à l’endothélium et dévoilera la capacité du vecteur pour atteindre l’expression transgénique résistant. Enfin, la méthode permet le développement et les essais des combinaisons des vecteurs et des transgènes qui sont conçus pour fournir la thérapie génique d’axés sur la paroi vasculaire. La méthode pourrait servir d’outil de dépistage pour identifier les gènes thérapeutiques qui pourraient à l’avenir-livré à l’endothélium de toutes les grosses artères (ou toutes les grosses artères malades) de vecteurs d’axés sur la paroi vasculaires injectés par voie percutanée. En raison de l’immunité préexistante chez l’être humain à adénovirus type 545, il sera difficile d’utiliser des vecteurs de base 5 adénovirus type en applications cliniques. Ingénierie de la capside adénovirus 5, utiliser des alternatives adénovirus de sérotypes46, ou l’utilisation des vecteurs moins immunogènes tels que AAV peut être nécessaire d’apporter la thérapie génique vasculaire à la clinique. Cependant, comme un outil expérimental, nous sommes pas au courant de tout vecteur qui peut rivaliser avec les adénovirus helper-dépendante 5 dans la réalisation efficace et durable de transgene expression dans les vaisseaux sanguins1.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions AdVec, Inc. pour obtenir l’autorisation d’utiliser des réactifs HDAd, Julia Feyk pour l’assistance administrative et les services vétérinaires du département de médecine Comparative des conseils chirurgicaux et soutien. Ce travail a été soutenu par les HL114541 et le John L. Locke, Jr. Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
| 1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
| 20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
| Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
| Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |
References
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