Summary
Deze methode is het introduceren van een transgenic in het endotheel van konijn halsslagaderen. Invoering van de transgenic zodat kan worden nagegaan van de biologische rol van de transgenic product in normale slagaders of ziekte modellen. De methode is ook handig voor het meten van de activiteit van regelgevende opeenvolgingen van DNA.
Abstract
Het doel van deze methode is om een transgenic in het endotheel van geïsoleerde segmenten van beide gemeenschappelijke halsslagaderen konijn. De methode behaalt focal endotheel-selectieve Transgenese, waardoor een onderzoeker bepalen de biologische rol van endotheel-uitgedrukt transgenen en kwantificeren van de in vivo transcriptionele activiteit van de opeenvolgingen van DNA in de grote slagader endotheliale cellen. De methode maakt gebruik van chirurgische isolatie van gemeenschappelijke halsslagaderen konijn en een arteriotomy voor een uiting van transgenic virale vector in de arteriële lumen. Een korte incubatieperiode van de vector in de lumen, met latere aspiratie van de inhoud van lumen, volstaat om efficiënte en duurzame uitdrukking van de transgenic in het endotheel, met geen detecteerbare transductie of expressie buiten de geïsoleerde arteriële segment. De methode kan beoordeling van de biologische activiteit van transgenic producten zowel in normale aders en in modellen van vasculaire ziekten bij de mens, terwijl het vermijden van systemische effecten die kunnen worden veroorzaakt door gericht op gene levering naar andere sites (bijv. de lever) of door de alternatieve aanpak van overlegging van de genetische constructies aan het endotheel van germ lijn Transgenese. Toepassing van de methode wordt beperkt door de noodzaak van een bekwame chirurg en werkzaam, een goed uitgeruste operatiekamer, de kosten van de aankoop en huisvesting konijnen, en de behoefte aan expertise in genenoverdracht vector constructie en het gebruik. Met deze methode verkregen resultaten omvatten: Transgenic-gerelateerde veranderingen in arteriële structuur, buiten, extracellulaire matrix of vasomotorisch functie; verhogingen of verlagingen van de arteriële ontsteking; wijzigingen in de vasculaire cel apoptosis; en progressie, vertraging of regressie van ziekten zoals intima hyperplasie of atherosclerose. De methode kunt ook meting van het vermogen van inheemse en synthetische regelgevende DNA-sequenties te wijzigen van de expressie van de transgenic in endotheliale cellen, omvatten de resultaten bieden: niveaus van transgenic mRNA niveaus van transgenic proteïne en niveaus van transgenic enzymatische activiteit.
Introduction
Het doel van deze methode is om een transgenic in het endotheel van konijn gemeenschappelijk halsslagaderen. Invoering van de transgenic zodat kan worden nagegaan van de biologische rol van de transgenic product zowel in normale slagaders konijn modellen van menselijke arterieel vaatlijden. Overexpressie van de transgenic in ziekte modellen kan onthullen of de transgenic (en haar eiwit product) belofte als therapeutische agenten1,2,3,4 tonen. Opneming van cis-acteren regelgevende elementen in de transgenic expressie cassette kunt beoordeling van de activiteit van deze elementen in arteriële endotheel in vivo5,6. Kennis van de activiteit van specifieke cis-acteren regelgevende elementen kan worden gebruikt om te ontwerpen meer-actieve expressie cassettes en mechanismen van genregulatie in de grote slagader endotheel in vivo7sonde.
Konijnen zijn een waardevol model voor diverse aspecten van menselijke vasculaire fysiologie en ziekte. Konijnen delen veel vasculaire functies bij de mens. Bijvoorbeeld, zijn hematologische basislijnwaarden, hemostatische regulering en vasculaire longitudinale spanning vergelijkbaar tussen de konijnen en de mens8. Konijn modellen van vasculaire ziekten repliceren toonsoort wezenstrek van vele menselijke ziekten met inbegrip van: aneurysma (soortgelijke geometrische en flow eigenschappen)9, vasospasm (soortgelijke reactie op endovasculaire behandeling)10,11, en atherosclerose (intima plaques met gelijkaardige eigenschappen met inbegrip van een kern die rijk is aan lipide, macrofagen en vlotte spier cellen in een vezelige cap)12,13. Dienovereenkomstig, konijn modellen zijn ontwikkeld voor vele vasculaire ziekten zoals trombose, vasospasm, aneurysma, diabetes, vasculaire graft stenose en atherosclerose8,13,14, 15,16.
Voor onderzoekers kiezen uit dierlijke modellen van vasculaire fysiologie en ziekte, heeft het konijn verschillende voordelen. Vergeleken bij knaagdieren, toestaan de grotere schepen van konijnen gemakkelijker chirurgische manipulatie, gebruik van endovasculair apparaten en een grotere hoeveelheid weefsel voor kwantitatieve metingen. Konijnen zijn veel dichter fylogenetisch bij primaten dan knaagdieren17, en de grotere genetische diversiteit van outbred konijnen beter benadert de genetische variabiliteit van de mens. Genetische diversiteit is met name belangrijk voor preklinische studies, die-door hun aard-doel het ontwikkelen van therapieën die kunnen worden toegepast op de genetisch divers menselijke populatie. Zoals met vele zo niet alle andere soorten van het model, konijn genen zijn gemakkelijk gekloond of gesynthetiseerd omdat het konijn genoom heeft geweest sequenced met hoge dekking (7,48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Vergeleken met andere grote dierlijke modellen (zoals honden, varkens of schapen), konijnen zijn relatief goedkoop om te kopen en huis en ze zijn gemakkelijker te kweken en te behandelen. Specifieke vaatziekten modellen bij konijnen, elke hebben hun eigen voordelen en tekortkomingen als modellen van ziekten bij de mens die buiten het bestek van dit manuscript8,12,18. Een onderzoeker toetst deze voordelen en tekortkomingen om te bepalen als het konijn het beste model is voor een specifieke experimentele vraag te beantwoorden.
Invoering van deoxyribonucleic acid (DNA) regulerende sequenties in de endotheliale cellen in vivo kunt onderzoek van de activiteit van deze sequenties in een complexe fysiologische omgeving. In vitro onderzoek bij transfected endotheliale cellen kunnen nuttig zijn voor de initiële beoordeling van de regelgevende opeenvolgingen van DNA; echter zijn expressie niveaus in weefselkweek modellen soms niet weergegeven wanneer de studies herhaalde in vivo5,19,20 zijn. In vitro -systemen kunnen ook bruikbaar zijn voor het verkennen van fundamentele trajecten van eiwit signalering en endotheel fysiologie, evenals communicatie tussen gekweekte vasculaire cellen; complexere trajecten of regelgevende netwerken die worden beïnvloed door complexe populaties van naburige vasculaire cellen of het immuunsysteem worden echter best bestudeerd in een in vivo systeem6,20. De hierin beschreven methode biedt een platform voor het verkennen van de verordening van transgenic expressie in het endotheel binnen de context van een intact vaartuig, met of zonder ziekte. Het systeem in-vivo laat ook onderzoek van fysiologische en pathologische cellulaire overspraak en identificatie van de bijdragen van het immuunsysteem bij verordening van gen expressie6.
Germinale Transgenese (vooral bij muizen) is een alternatieve benadering voor de regie van transgenic expressie naar endotheliale cellen. Deze aanpak kan bieden levenslang transgenic expressie, met endothelial targeting gemedieerd door specifieke promotor of regelgevende gebieden21,22. Echter, de generatie van transgene muizen is tijdrovend en duur, meerdere transgene regels moeten vaak worden getest om ervoor te zorgen de doelgerichtheid van de transgenic aan de gewenste celtype en verwezenlijking van adequate transgenic expressie niveaus, en experimentele resultaten in lymfkliertest systemen kunnen afhankelijk van de stam. Lymfkliertest transgene modellen met endotheel-gerichte transgenen hebben veel voordelen: er is geen behoefte om te voeren operatie op elke proefdieren met het oog op Transgenese, experimentele muizen kunnen worden gekweekt met talrijke andere beschikbare transgene muizen in Bestel voor het testen van genetische en fenotypische interacties, en er is een brede selectie van antilichamen die met lymfkliertest eiwitten reageren, karakterisering van fenotypen vergemakkelijken. Doelgerichtheid van transgenen aan het endotheel via de kiembaan meestal resulteert echter in transgenic expressie gedurende de therapieën,22 waardoor het moeilijk is om te bepalen van de site waarop het product transgenic handelt. Dit geldt met name wanneer het product transgenic wordt uitgescheiden, omdat een product van de transgenic uitgescheiden door endotheliale cellen in de hele de therapieën biologische activiteit zou kunnen op een aantal sites binnen een dier hebben. Hoewel de methode beschreven in dit manuscript technische expertise en gespecialiseerde voorzieningen vereist zijn, kan het minder tijdrovend en minder duur dan een endotheel-specifieke transgene muis-lijn te ontwikkelen. Het zorgt voor de beoordeling van de functie van een eiwit selectief in de endotheliale cellen van een segment van de grote slagader, en het maakt gebruik van de contralaterale gemeenschappelijke halsslagader als een gekoppelde besturingselement (het elimineren van systemische factoren die tussen experimentele variëren kunnen dieren-bijvoorbeeld, bloeddruk of cholesterolniveaus-als ongecontroleerde variabelen).
Gentherapie is een veelbelovende aanpak voor de behandeling van vasculaire ziekten, vooral chronische ziekten, omdat een verzamelaanvraag duurzame of eventueel levenslang uitdrukking van een therapeutisch gen23kan bieden. De therapeutische belofte van gentherapie is onderzocht in diermodellen van somatische genenoverdracht, vaak gericht op de lever24,25, dat een relatief gemakkelijk doelwit, is omdat veel bloed overgebrachte virale vectoren hepatotropic zijn. Nochtans, als u wilt dat een effect op vaatziekten, gentherapie gericht op de lever moet bereiken systemische overexpressie van eiwitten. Dit vereist meestal grote doses van vector, die giftige of zelfs dodelijke26 kunnen. Bovendien, verhoogde systemische niveaus van een eiwit verhogen het risico op uit-target bijwerkingen, die kunnen bemoeilijken of zelfs verbergen interpretatie van experimentele resultaten. Lokale gentherapie gericht op vasculaire endotheel, zoals beschreven in dit manuscript kon voorkomen dat systemische bijwerkingen, omdat de geïnfundeerd vector is niet wijd verspreid buiten de getransduceerde arteriële segment, en lokale vasculaire effecten kunnen worden bereikt zonder wijzigingen in systemische plasma niveaus van proteïne. 27 bovendien een veel lager bedrag van vector is nodig om het transduce van een arteriële segment dan nodig is om robuuste hepatische transductie. Transgenic expressie van de lever is gemeld te dalen na verloop van tijd, waarschijnlijk als gevolg van de omzet van de cel, waarbij herhaalde toediening als op hoog niveau transgenic expressie moet worden gehandhaafd. 28 daarentegen de lage omzet snelheid van het endotheel biedt stabiele expressie ten minste 48 weken in chow-gevoed konijnen en gedurende ten minste 24 weken in atherosclerotische laesies van cholesterol-gevoed konijnen. 1 , 27
Om te bepalen of deze methode voor genoverdracht op konijn gemeenschappelijke carotis endotheel geschikt is, moeten de voordelen en nadelen (tabel 1) worden beschouwd in het kader van de doelstellingen van het specifieke onderzoek. Voordelen van deze methode zijn: outbred konijnen beter representatief zijn voor de menselijke genetische diversiteit dan zijn ingeteelde muizen (belangrijk voor preklinische werkzaamheden); konijnen zorgen voor grotere schepen om gemakkelijker te manipuleren en meer weefsel voor analyse; de methode kan bereiken endotheel-gerichte transgenic expressie veel sneller dan germinale endothelial targeting in transgene muizen; vector dosis kan gemakkelijk worden aangepast aan de variabele niveaus model van transgenic expressie; processen die specifiek zijn voor groot-slagader endotheel kunnen worden onderzocht; en lokale vasculaire Transgenese staat de tegenovergestelde halsslagader in hetzelfde dier te worden gebruikt als een besturingselement, systemische factoren als ongecontroleerde variabelen elimineren. Heeft de volgende nadelen: speciale faciliteiten en expertise zijn vereist; minder genetisch gemodificeerde achtergronden waarop u wilt experimenteren zijn beschikbaar bij konijnen dan bij muizen; en er is een minder uitgebreide selectie van antilichamen tegen konijn versus muis eiwitten (voor immunodetection van transgenic eiwitten en andere antigenen die belangrijk zijn bij de interpretatie van de experimentele resultaten kunnen zijn).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Universiteit van Washington Office van het welzijn van dieren en bijbehorende institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC), en werden voltooid in overeenstemming en naleving van alle relevante regelgevend en institutioneel richtsnoeren.
Opmerking: Genoverdracht op konijn gemeenschappelijk halsslagaderen wordt uitgevoerd door een chirurg met de hulp van een anesthesist of de assistent op konijnen.
1. genoverdracht op konijn gemeenschappelijk halsslagaderen: pre operatie
- Anesthetize van het konijn. Weeg het konijn. 30 mg/kg ketamine en 2 mg/kg xylazine combineren in een spuit. Injecteren ketamine/xylazine intramusculaire (IM) in de spieren van de paraspinous voor het opwekken van de verdoving.
- Terwijl u wacht voor konijn te worden verdoofd, de bereidingslokaal en de operatiekamer (OR) tabellen voorbereiden.
- In het bereidingslokaal OR: plaats de oogheelkundige zalf en de fentanyl patch binnen het bereik van de voorbereiding tabel; Tondeuses en een vacuüm voor het scheren van het konijn nek en oor; instellen gereserveerd van een prep pad van alcohol, een katheter 24G x ¾", een injectie poort en chirurgische tape teneinde de intraveneuze lijningang (IV) de rabbit's oor ader.
- In de OR: de bewakingsapparatuur instellen en de positie van de sondes [elektrocardiogram (EKG), zuurstof saturatie (SpO2), temperatuur] op de tafel van de OR; bereiden van zuurstof en Isofluraan; stropdas gaas strip aan het gezichtsmasker om veilig naar het konijn en plaats het masker op het hoofd einde van de tabel.
Opmerking: De gaas strips gebonden op het gezichtsmasker moet 2 staarten van ongeveer 45 cm. - Inschakelen van de opwarming van de aarde water deken op de tafel van de OR. Op de top van water deken, plaats een opgerolde handdoek voor ondersteuning van de nek en een plaat van de dispersief elektrode (later Geplaatst onder rabbit's rug).
- De pomp of IV met 100 mL van een zoutoplossing IV zak instellen met een 18-19G naald gekoppeld en het debiet ingesteld op 10 mL/h per kg.
- 1 mL van lidocaïne HCl combineren (2% stockoplossing) en bupivicaine HCl 1 mL (0,5% stockoplossing) in een injectiespuit, om te worden gebruikt als een lokale pijnstillende.
- Wanneer het konijn is volledig verdoofd, voorbereiden op het konijn chirurgie.
Opmerking: Controleer of het ontbreken van een pedaal reflex (snuifje een teen; blik voor het intrekken van ledematen) te waarborgen verdoving diepte, blijven toezien op de pedaal reflex gedurende de operatie.- Ophthalmic zalf toepassen ogen. Verwijder ontlasting uit het konijn de endeldarm door op te drukken met gehandschoende vingers op de voorste onderbuik (boven de endeldarm) en bewegende vingers richting de anus. Dit zal zorgen voor latere plaatsing van een rectale temperatuursonde.
- Het scheren van de voorste hals uit de sternale inkeping aan de rand van de onderkaak tijdens het gebruik van een vacuüm om het gebied schoon te houden. Ook beide oren voor de plaatsing van de IV en de fentanyl patch bijlage scheren, en scheren een linker achterzijde midden teen voor de puls-oxymetrie-sonde.
Opmerking: Het protocol wordt ervan uitgegaan dat de chirurg aan de rechterkant van het konijn voor de gehele procedure. Als de chirurg de OR setup aan de andere kant plaatsen, omgekeerde kanten in deze stap de draden en IV tegenover van de chirurg te houden. De zijkanten van de toekomstige stappen moeten ook worden ontstoken indien nodig. - Veeg de linker oor met een alcohol prep pad, plaats een 24G IV-katheter in de ader van de linker oor cap met de injectie-poort en tape van de katheter/port aan de rabbit's oor om het te beveiligen. Een fentanyl patch (25 µg/h) toepassen op het rechteroor van het konijn.
- Transport van het konijn in de OR en liggende plaats op de operatietafel met een opgerolde nek ondersteuning handdoek onder de rabbit's nek net onder het hoofd. Zachtjes uitbreiden van het konijn nek tot het rechte en ongeveer horizontaal.
- Haak van het konijn tot het gezichtsmasker met O2 op op 1 L/min, en start Isofluraan administratie. Beveilig het masker door inwikkeling van de uiteinden van de strook van de gaas gebonden aan het masker rond de nek ondersteuning handdoek onder het konijn. Pas Isofluraan (meestal 1-2%) zo nodig (op basis van hartslag, ademhaling en pedaal reflex) te handhaven goede verdoving voor de rest van de procedure.
- Zorg ervoor dat de verspreide elektrode plaat is gecentreerd onder de rug van het konijn. Plaats de temperatuur en de puls-oximeter sondes en toepassen van de EKG leidt tot het konijn.
- Hook-up IV zoutoplossing op de poort van de katheter in de rabbit's oor, beginnen de zoute pomp bij 10 mL/h per kg.
Opmerking: Na 1 h, de zoute pomp kan worden teruggebracht tot 5 mL/h per kg. - Beperken van het konijn voorpoten door hen los te koppelen aan de tabel. Plaats eventueel een kleine kunststof tafel over het konijn te behoeden voor het konijn wordt onderworpen aan de borst/abdominale druk van de chirurg leunend op rabbit's borst/buik.
Opmerking: De kleine tafel kan helpen voorkomen dat gedwongen regurgitatie abdominale inhoudsopgave. - Injecteren van 2 mL van eerder bereid lidocaïne (2% stock) / bupivacaine (0,5% stock) (50/50 mix) subcutaan langs de lijn van de incisie geplande nek voor plaatselijke verdoving.
- Laat de assistent de chirurgische site voorbereiden met 3 afwisselend scrubs van chloorhexidine isopropanol en vervolgens een spray met betadine. Scrub, jurk en handschoen, na juiste aseptische techniek.
Opmerking: De chirurg moet dragen 2 x chirurgische loupes om te helpen met de eerste helft van de operatie. Tijdens de operatie overleven is het essentieel om de steriliteit van de chirurg en de chirurgische veld. Alleen de Office-assistent worden niet-steriele items moet omgaan, en gesteriliseerde materialen mag aseptisch worden doorgegeven aan de chirurg of geplaatst op de tafel gedrapeerd instrument. Steriele handdoeken kunnen worden gebruikt door de chirurg om te handhaven steriliteit terwijl het manipuleren van niet-steriele apparatuur zoals de Microscoop.
2. voortbestaan chirurgie (Gene Transfer)
- Instrumenten en steriele veld voorbereiden.
- Laat de Office-assistent openen de steriele draperen pack bevat een tabel draperen, een papieren gordijn voor het konijn en meerdere handdoeken. Aseptisch Breng de items naar de chirurg.
- Drape de instrument-tabel. Plaats de 6 steriele handdoeken en het papier drape op de tafel gedrapeerd.
- Draperen met 4 handdoeken, de rabbit's nek, waardoor alleen de chirurgische site blootgesteld (ongeveer 4 cm x 10 cm). Leg het papier draperen over het konijn.
- Laat de assistent de gesteriliseerde instrumentenpak open en plaats aseptisch op de tafel van het instrument.
- Laat de Office-assistent openen de volgende apparatuur en aseptisch plaats op de tafel instrument of hand naar de chirurg: drie 1 mL spuiten (en een naald als de spuiten niet al met naalden geladen zijn), een 20 mL spuit een 21G naald, één 19G naald, 3-0 polyglycolic zuur (PGA) hechtdraad, 5-0 PGA hechtdraad, 7-0 polypropyleen hechtdraad en twee 24 G IV-katheters.
- Beveilig de elektrocauterisatie-kabel aan op de konijn draperen met behulp van de 7,25" Kantrowitz pincet en vervolgens drop de stekker off van de tabel einde. Laat de assistent sluit de kabel aan op de unit voor elektrochirurgie en schakel de stroom op.
- Vul een 20 mL spuit met steriele zoutoplossing, getrokken uit een IV zak of flacon gehouden door de Office-assistent. Gebruik deze saline desgewenst blootgestelde weefsel om vochtig te houden tijdens de procedure.
- Bereiden een spuit van 1 mL met 1 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM, voor het wassen van de slagader). Voor elke halsslagader die zal worden transduced, zijn 0,35 mL verdunde virus nodig. Als hetzelfde virus wordt gebruikt voor beide zijden, bereiden u een 1 mL spuit met virus verdund in DMEM tot een volume van 0,7 mL. Als verschillende partijen ontvangen verschillende virussen [bijvoorbeeld een "Null" virus zeggenschap aan de ene kant], bereiden twee 1 mL spuiten, elk met 0.35 mL oplossing van het virus. De concentratie van het virus is voor helper-afhankelijke adenovirus, 2 x 1011 virale deeltjes (vp) / mL.
Opmerking: Laat de assistent bereiden van het virus. De chirurg stelt DMEM en virus schorsing in steriele spuiten. - Een gat in het gordijn. De grootte van het gat moet even groot zijn als de chirurgische site op de rabbit's nek dat wordt omlijst door de handdoeken in stap 2.1.3. Klem de hoeken van het gat in de papieren gordijn aan de onderliggende handdoeken die zijn gedrapeerd over de rabbit's nek met de handdoek klemmen.
- De gemeenschappelijke halsslagaderen isoleren.
Opmerking: 2 x chirurgische loupes moet worden gebruikt voor dit deel.- Snijd de huid met een elektrocauterisatie langs de middellijn uitbreiding van ongeveer 7-9 cm cranially naar de onderkaak en de huid open klem met handdoek klemmen.
- Maak een korte laterale knippen door de fascia met de elektrocauterisatie caudal eind. Voeg vervolgens de grote schaar in de cut en bot ontleden de fascia langs hele middellijn. Snijd de ontleed fascia beneden de middellijn met elektrocauterisatie.
- Met een kleine ontleden schaar, ontleden tussen de V-vormige spieren (sternocephalic spier) en de sternohyoid spier in de luchtpijp, bloot de gemeenschappelijke halsslagaderen, beginnend aan de rechterkant.
- Ontleden de right admin halsslagader vrij van de omringende weefsels, verdelen alle takken, vanaf het honk van nek caudally met de overschrijding van de faryngaal zenuw cranially. Gebruik chirurgische silicon lussen om hulp bij het intrekken van de slagader tijdens dissectie.
Opmerking: Let erop niet verstoren de vagus-zenuw die parallel loopt aan de gemeenschappelijke halsslagader of de kleinere zenuwen die de gemeenschappelijke halsslagader oversteken. - Afbinden elke grote takken afkomstig uit de gemeenschappelijke halsslagader (1-2 per kant) met 5-0 zijde hechtingen vóór het snijden van de tak distally om gratis een 4-5 cm-segment van de halsslagader. Snijd ligaturen takken 1-2 mm van de band, zodat de band doet niet glijden.
- Herhaal dissectie aan de linker kant (stappen 2.2.3 - 2.2.5).
- Vectoren inblazen gemeenschappelijk halsslagaderen.
Opmerking: Een chirurgische Microscoop (16 X) wordt gebruikt als nodig voor het uitvoeren van arteriotomy, infusie van vectorbestrijding/oplossing en arteriotomy reparatie.- Laat de assistent de chirurgische loupes verwijderen uit de chirurg en de chirurgische Microscoop juiste positie zetten. Een steriele handdoek draperen over de Microscoop dat manipulatie van de Microscoop zonder het steriel veld besmetten.
- Injecteren van heparine [150 internationale eenheden (IU) /kg] in de IV-katheter en spoelen met 10 mL zoutoplossing.
- Terugkomend op de geïsoleerde rechts gemeenschappelijke halsslagader, zet twee zijden dassen rond het midden gedeelte van de gemobiliseerde carotis segment en binden van een enkele bovenhands knoop op elk - zonder aanscherping van hen.
- De naald van de 19G net boven de schuine kant buigen tot ongeveer 80° met het stuurprogramma van de grote naald (niet knikken de schuine kant; Figuur 1).
- Klem de slagader aan elk uiteinde van het geïsoleerde segment met vasculaire clips, plaatsen van de craniale clip eerst te voorzien van slagader vullen en dan het plaatsen van de caudal clip.
- De gemeenschappelijke halsslagader aanprikken met de gebogen 19G naald gewoon craniale caudal vasculaire clip, nemen veel zorg aan niet doorprikken de achterkant of zijkant muren. De naald-tip vooraf in het lumen en trekken het tweemaal om ervoor te zorgen dat arteriotomy volledig worden doorlopen op de wand van de slagader. Dan trekken zorgvuldig de naald.
Opmerkingen: Het is belangrijk om het maken van een arteriotomy die netjes dringt door in alle lagen van de wand van de slagader en wordt de wand van de slagader niet ontleden (door axiaal door de adventitia en de media). Om dit te bereiken, moet de halsslagader worden doorboord met het topje van de naald zo dicht mogelijk tot een hoek van 90° tegen de wand van de slagader (Figuur 1) geplaatst. Carotis punctie onder een hoek van 90° wordt geholpen door de slagader grijpen door de adventitia met een fijne Tang en zachtjes het oppervlak van de slagader te heffen terwijl u de tip van naald gewoon caudal tot het punt van de lift. Deze manoeuvre vermindert ook het risico van het raken van de achterste muur (Figuur 1). - Ontvouwen en bos-up diverse gaas pads in een nest op te leggen van de spuit gebruikt voor de Infusies. Plaats het nest op de rabbit's borst caudal aan de incisie.
- Een IV-katheter zetten met de spuit die bevat alleen-DMEM (niet te strak) en buig de katheter ~ 4 mm van het uiteinde, zodat de bocht op ongeveer 75° houdt nadat deze is uitgebracht.
- Invoegen van de IV-katheter in de ader tot het buigpunt en wassen alle bloed van de slagader met DMEM (~ 0,25 mL x 2). Voor elke wassen, vul de slagader met DMEM en verwijder residuele DMEM uit het schip lumen door voorzichtig op de ader met een gehandschoende vinger, begin gewoon caudal naar de craniale vasculaire clip te drukken. Met behoud van zachte druk, schuif de vinger van craniale caudal. De luminal inhoud zal wassen via de arteriotomy.
- Houd de katheter in de slagader en de DMEM spuit voor de spuit met virus oplossing uit te wisselen. Zorg ervoor dat dat geen lucht de katheter invoert.
- Schuif de zijden dassen beneden de slagader zodat ze de slagader op de locatie van het uiteinde van de katheter omringen, maar doen geen draai hen.
- Infundeer 0,03 mL van de oplossing van het virus te duwen van de resterende DMEM uit de katheter en vervolgens het leegmaken van de slagader. Samenvouwen door opnieuw het verwijderen van alle vloeistof uit de lumen met een vinger, Cranio aan caudal (zoals in stap 2.3.9).
- Draai de twee banden rond uiteinde van de katheter te verzegelen de lumen. Infusie van de virus-oplossing (~ 0,25 mL; 2 x 1011 vp/mL voor adenovirus) door de plunjer van de injectiespuit zachtjes te drukken totdat de slagader aan fysiologische kaliber is opgezwollen.
Opmerking: Het is belangrijk dat de slagader breidt uit naar fysiologische kaliber en opgezwollen tijdens virus infusie blijft. Als dat niet het geval is, de mate van genenoverdracht aanzienlijk zal dalen. - Voorzichtig vast de spuit op het nest van de gaas.
- Een 7-0 polypropyleen Sutuur (geologie) plaats in de gemeenschappelijke carotis adventitia gewoon caudal van de craniale vasculaire clip ter gelegenheid van de craniale grens van gene transductie
- Nadat het virus-bevattende oplossing in de slagader lumen gedurende 20 minuten is, verwijder het virus-bevattende spuit en vervangen door een lege spuit. Gecombineerd het virus-bevattende oplossing voorzichtig tot het schip wordt samengevouwen en wordt de spuit verwijderen. Knippen of ongedaan maken van de zijden dassen en voorzichtig het verwijderen van de katheter.
Opmerking: Snijden de banden zeer korte aids in ze te verwijderen. Het verwijderen van de katheter zorgvuldig om te voorkomen dat schade aan de carotis endotheel. - Met behulp van de chirurgische Microscoop, sluit de arteriotomy met 7-0 polypropyleen met behulp van een X-patroon (Figuur 2).
- Maak een eerste pass invoeren op de onderst-juiste van de arteriotomy en verlaten het schip in de linkerbenedenhoek. Dan kruis de opening en maak een tweede pass van rechtsboven naar linksboven.
- Voordat de koppelverkoop van de hechtdraad, spoelen de slagader door kort het vrijgeven van de craniale vasculaire clip. Bloed zal vloeien uit de arteriotomy wanneer de clip wordt vrijgegeven, lucht en resterende virus verwijderen uit de lumen.
- Trek de hechtdraad om te zacht sluiten van de arteriotomy en binden een hechtdraad met 2 square knopen.
Nota: Trekken van de hechtdraad te krap zal veroorzaken opeenhoping van het weefsel dat stroom zal verstoren, waardoor het risico van trombose en wijzigen van de stroom die kan een belangrijke ongecontroleerde variabele in ziekte modellen.
- Laat de craniale vasculaire clip, waarna de caudal vasculaire clip met lichte druk met gaas elke bloeden te stoppen. Als het bloeden aanhoudt, blijven druk gedurende 1-2 minuten. Als de arteriotomy goed gesloten werd, stopt het bloeden altijd binnen dit tijdsbestek.
- Laat de assistent injecteren van buprenorfine [0,02 mg/kg; subcutaan (SQ)] op omstreeks deze tijd om postoperatieve analgesie totdat fentanyl plasma niveaus therapeutische geworden.
Opmerking: Een tweede buprenorfine injectie (0,02 mg/kg; SQ) kan worden moest 6 h na de eerste injectie analgesie handhaven totdat fentanyl plasma niveaus therapeutische geworden. - Herhaal virus infusie protocol betreffende linkerkant als volgt 2.3.2 - 2.3.19.
- Sluiting van de wond
- Gebruik een 5-0 PGA Sutuur (geologie) om te sluiten van de middellijn fascia met een continue hechtdraad.
- Met een 3-0 PGA hechtdraad, sluit u de huid met een intradermale patroon met behulp van een begraven knoop aan beide uiteinden.
- Post-operatieve herstel en opruimen.
Opmerking: Het konijn moet worden bewaakt continu voor goede oxygenatie en lichaamstemperatuur tijdens het herstellen van de verdoving. Herstel moet plaatsvinden in een kalme, rustige omgeving.- Isofluraan en zuurstof stroom uitschakelen en verwijder het gezichtsmasker van konijn.
- IV vloeistoffen losgemaakt, maar laat de IV-poort plaats voor noodopening IV.
- Neem het konijn naar het gebied van herstel en lag op zijn kant in een kooi met een opwarming van de aarde water deken ingeschakeld (of eventueel een Bair Hugger kachel).
- O2 door masker te geven totdat de SpO2 stabiel is.
- Laat die het konijn in een kooi herstellen, spiegelen het naar de andere kant elke 15 min, totdat het konijn kan gaan op zijn achterpoten zitten en bewegen.
- Wanneer het konijn is mobiel, de IV uit haar oor te verwijderen voordat u terugkeert naar de kooi.
Opmerking: Niet het konijn tot terugkeren het gezelschap van andere dieren tot het volledig is hersteld van de verdoving.
- Ontdoen van iets dat contact gehad met de vector of was op het operationele vlak, volgende passende biohazard en slijpsel afval protocollen.
3. genoverdracht op konijn gemeenschappelijk halsslagaderen: postoperatieve zorg
- Het beoordelen van de algehele conditie van het konijn dagelijks na chirurgie, controleren op wondgenezing, bewijs van infectie, eetlust, ademhaling en tekenen van pijn.
- Controleer de rabbit's oor positie (oren naar beneden een teken van pijn of leed, vooral als ze worden gekoppeld aan een slordig verschijning). Controleer dat het konijn mobiele en actief blijft. Controleer het konijn voor normale ademhaling zonder stridor. Controleer of de wond schoon, droog en intact is. Controleer het konijn voor een normale lichaamstemperatuur. Veterinaire diensten te raadplegen als het konijn niet mobiel en actief, met normale lichaamstemperatuur, een nette uitstraling, een schone wond en normale ademhaling is.
- Selectievakje voor normale voedselinname en bewijzen van verse ontlasting en urine.
Opmerking: Voedselinname kan worden verlaagd na de operatie, maar moet terugkeren naar normaal binnen 2 dagen; dienen als aanvullende voedsel zo nodig.
- Verwijder de patch fentanyl op postoperatieve dag 3.
Opmerking: Buprenorfine kan worden beheerd als nodig is voor postoperatieve pijn die niet door de patch fentanyl wordt beheerd, of ingeval de fentanyl patch vroeg wordt verwijderd.
4. de terminal oogst chirurgie: pre operatie
- Anesthetize van het konijn. Zie de punten 1.3 en 1.3.5 met betrekking tot de verwezenlijking en het onderhoud van anesthesie.
- Weeg het konijn. 30 mg/kg ketamine en 2 mg/kg xylazine combineren in een spuit. Injecteren van ketamine/xylazine IM in de spieren van de paraspinous voor het opwekken van de verdoving.
- Bereiden de bereidingslokaal en/of tabellen tijdens het wachten voor het konijn te worden verdoofd.
- In het bereidingslokaal OR: setup Tondeuses en een vacuüm voor het scheren van het konijn nek en oor.
- In de operatiekamer: bewakingsapparatuur instellen en de positie van de sondes (SpO2, temperatuur) op de tafel van de OR; bereiden van zuurstof en Isofluraan; bind een gaas-strook aan het gezichtsmasker om veilig naar het konijn en plaats het masker op het hoofd einde van de tabel.
Opmerking: De gaas strips gebonden op de gelaatsmasker moeten 2 staarten van ongeveer 45 cm. - Opwarming van de aarde water deken op de OR tabel inschakelen. Op de top van de deken van water, plaats een opgerolde handdoek voor ondersteuning van de nek en een plaat van de dispersief elektrode (later Geplaatst onder rabbit's rug).
- Combineren van 1 mL van lidocaïne HCl (2% stock) en bupivicaine HCl 1 mL (0,5% stock) (50/50 mix) in een spuit als een lokale pijnstillende.
- Wanneer het konijn is volledig verdoofd, voorbereiden op het konijn chirurgie.
- Verwijder ontlasting uit het rectum, zoals beschreven in punt 1.3.1, met het oog op latere plaatsing van een temperatuursonde.
- Scheren het konijn uit de sternale inkeping aan de hoek van de onderkaak tijdens het gebruik van een vacuüm om het gebied schoon te houden. Ook het scheren van de linker achterzijde midden teen voor de puls-oxymetrie-sonde.
Opmerking: Het protocol wordt ervan uitgegaan dat de chirurg zal aan de rechterkant van het konijn. Als de OR setup zal chirurg plaats aan de overkant, omkeren kanten in deze stap te houden van de draden tegenover van de chirurg. De zijkanten van de toekomstige stappen moeten ook worden ontstoken indien nodig. - Transport van het konijn in de OR en liggende plaats op de operatietafel met een opgerolde nek ondersteuning handdoek onder de rabbit's nek net onder het hoofd. Zachtjes uitbreiden van het konijn nek tot het rechte en ongeveer horizontaal.
- Haak van het konijn tot gezichtsmasker met O2 op op 1 L/min, en start Isofluraan administratie. Beveilig het masker door inwikkeling van de uiteinden van de strook van de gaas gebonden aan het masker rond de nek ondersteuning handdoek onder het konijn. Pas Isofluraan (meestal 1-2%) zo nodig om goede verdoving voor de rest van de procedure.
- Zorg ervoor dat de dispersief elektrode plaat is gecentreerd onder rabbit's rug. Plaats van temperatuur en puls-oximeter sondes.
- Beperken van het konijn voorpoten door hen los te koppelen aan de tabel.
Opmerking: Plaats eventueel een kleine kunststof tafel over konijn te behoeden voor het konijn wordt onderworpen aan de borst/abdominale druk van de chirurg leunend op rabbit's borst/buik. Het doel hier is om te voorkomen dat gedwongen regurgitatie abdominale inhoudsopgave. - Injecteren van 2 mL van lidocaïne (2% stockoplossing) / bupivacaine (0,5% stockoplossing) (50/50 mengen; uit stap 2.4) subcutaan langs de lijn van de incisie geplande nek voor plaatselijke verdoving.
- Spray de chirurgische site met betadine. Zet op schone handschoenen voor chirurgische ingreep.
5. de terminal chirurgie (vaartuig Harvest)
- Instrumenten en chirurgische veld voorbereiden.
- Open een schone draperen pack met daarin een tabel draperen en een papieren gordijn voor het konijn. Drape de instrument-tabel.
- Open het instrumentenpak, plaats op de tafel van het instrument en instrumenten te regelen. Plaats de volgende apparatuur op de tafel van instrument: een 20 mL spuit en één 21G naald.
- Beveilig de elektrocauterisatie-kabel aan op de konijn draperen met behulp van de 7,25" Kantrowitz pincet. Sluit de stekker aan de eenheid elektrochirurgie en zet hem aan.
- Vul een 20 mL spuit met steriele zoutoplossing. Gebruik deze zoutoplossing zo nodig het blootgestelde weefsel om vochtig te houden tijdens de procedure.
- Plaats het papier draperen over het konijn en een gat te maken in het draperen over de chirurgische site op rabbit's nek. Klem de hoeken van gat in plaats op de huid van het konijn met de handdoek klemmen.
- Isoleren halsslagaderen voor gemeenschappelijk gebruik.
Opmerking: 2 x chirurgische loupes moet worden gebruikt voor dit deel.- Snijd de huid met een elektrocauterisatie langs de middellijn uitbreiding van ongeveer 7-9 cm cranially naar de onderkaak en klem huid open met handdoek klemmen.
Opmerking: Als de oogst is slechts een paar dagen na de vorige operatie, elektrocauterisatie is niet nodig. Knip de hechtingen en trek voorzichtig open de insnijding van de vorige operatie. - Maak een korte laterale knippen door de fascia met een elektrocauterisatie caudal eind. Grote schaar vervolgens invoegen in de snit en bot ontleden de fascia langs de gehele middellijn. Snijd de ontleed fascia beneden de middellijn met de elektrocauterisatie.
- Met een kleine ontleden schaar, ontleden tussen de V-vormige spieren (sternocephalic spier) en de sternohyoid spier in de luchtpijp, te isoleren van de gemeenschappelijke halsslagaderen, beginnend aan de rechterkant.
- Ontleden de juiste slagader vrij van de omringende weefsels van base van nek caudally met de overschrijding van de faryngaal zenuw cranially. Gebruik chirurgische silicon lussen om hulp bij het intrekken van de slagader tijdens dissectie.
- Herhaal dissectie aan de linker kant (stappen 5.2.3 - 5.2.4).
- Afbinden met een 3-0 zijde Sutuur (geologie), de gemeenschappelijke halsslagader cranial aan het segment dat is doordrenkt met de vector (gebruik adventitial hechtdraad geplaatst op eerste chirurgie te vinden van de craniale omvang van vector infusie. Vervolgens het afbinden van de halsslagader caudal aan de gerepareerde arteriotomy.
- Accijnzen van de carotis segment tussen de ligations en de lumen met zoutoplossing te spoelen. Trim away excess adventitial weefsel van het vaartuig en snij de carotis segment in kleinere stukken voor de verschillende eindpunt analyses (histologie, DNA, RNA acid (RNA), eiwit, explant cultuur, enz.).
- Injecteer 1 mL van Beuthanasia IV bij euthanaseren, en bevestigen van euthanasie van het konijn.
- Snijd de huid met een elektrocauterisatie langs de middellijn uitbreiding van ongeveer 7-9 cm cranially naar de onderkaak en klem huid open met handdoek klemmen.
- Ontdoen van iets dat contact gehad met de vector of was op het operationele vlak, volgende passende biohazard en slijpsel afval protocollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ter uitvoering van deze methode met vertrouwen, zijn voorbereidende experimenten dienen te worden vastgesteld dat de exploitant efficiënt en reproduceerbare genenoverdracht, met transgenic expressie voornamelijk in luminal endotheliale cellen behaalt. In onze ervaring, is dit gemakkelijkst beoordeeld met behulp van een vector die β-galactosidase uitdrukt. 3 dagen verwijderd 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) kleuring van gemeenschappelijke carotis segmenten na vector infusie, evenals meting van β-galactosidase mRNA (boodschapper-RNA) met kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase ketting reactie (qRT-PCR), zal onthullen efficiëntie, reproduceerbaarheid en locatie van de getransduceerde cellen. Voor experimenten die onderzoeken van de effecten van transgenic expressie of de activiteit van cis-acteren transcriptionele elementen meten, meten we meestal transgenic mRNA als een eerste indicatie van het niveau en de reproduceerbaarheid van genenoverdracht.
Een nieuwe operator in ons laboratorium gezocht om de vaardigheid met deze methode door transducing konijn gemeenschappelijk halsslagaderen met een adenovirale vector (2 x 1011 vp/mL) uiting van een β-galactosidase transgenic, gedreven door een cytomegalovirus (CMV) promotor. Getransduceerde slagaders werden gekapt 3 dagen later en dwars werden gesneden in segmenten. Afzonderlijke segmenten waren toen beide open knippen axiaal of verlaten als intact ringen. Alle van de segmenten waren X-gal gekleurd in microcentrifuge buizen. Segmenten die had zijn opengesneden axiaal werden geplaatst op een horizontaal oppervlak en het luminal oppervlak maximaal blootgesteld, met pinnen zo nodig om te voorkomen dat het segment curling. En face beelden van de luminal oppervlakken toonde robuuste endothelial kleuring met X-gal (figuren 3A en 3B). Axiale beelden van het luminal oppervlak van intact carotis ringen toonde X-gal kleuring alleen op het luminal oppervlak (cijfers 3 c en 3D). De segmenten die was axiaal geopend werden verwerkt tot paraffine, gesegmenteerd en contra gekleurd met haematoxyline en eosine of nucleaire snel rood. Beelden Toon X-gal kleuring voornamelijk in het endotheel, hoewel er een kleine hoeveelheid vlekken in de adventitial laag (cijfers 3E en 3F). Transductie van adventitial cellen kan optreden via lekkage van vector via de site arteriotomy of door lekkage via kleine takken proximale naar de sites van kant tak afbinding. 29
In een afzonderlijk experiment, een nieuwe operator gezocht om de vaardigheid bij het bereiken van reproduceerbare niveaus van transgenic expressie, als een prelude op experimenten gericht op onderzoek naar de biologische activiteit van de transgenen. Konijn gemeenschappelijk halsslagaderen waren getransduceerde met helper-afhankelijke adenovirus (2 x 1011 vp/mL) met een apo A-I (HDAdApoAI) of transgenic van de IL-10 (HDAdIL10), beide onder controle van een CMV-promotor. Getransduceerde slagaders werden gekapt 3 dagen na transductie en snijd dwars in segmenten. RNA is uitgepakt uit het schip segmenten en apo A-ik en IL-10 mRNA expressies werden gekwantificeerd door qRT-PCR, met normalisatie te glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) mRNA in dezelfde extracten (Figuur 4). In de slagaders van het HDAdIL10-getransduceerde, slechts 1 van de 6 slagaders had een zeer lage, maar aantoonbaar apo A-ik mRNA signaal. Expressie van apo A betekent-ik mRNA 700-fold groter was in de getransduceerde met HDAdApoAI dan in getransduceerde met HDAdIL10 schepen schepen. Lage niveaus van endogene IL-10 mRNA werden ontdekt in HDAdApoAI-getransduceerde slagaders, met gemiddelde expressie toegenomen 6-fold in HDAdIL10-getransduceerde slagaders. Van de nota is er aanzienlijke intra - en intersite - artery variabiliteit in signaaltransductie efficiëntie en transgenic expressie, zoals aangegeven in de figuren 3 en 4, respectievelijk. Wij vinden deze variabiliteit zelfs met ervaren operators.
Figuur 1 . Arteriotomy in de gemeenschappelijke halsslagader. Fijne pincet zijn gebruikt de halsslagader adventitia begrijpen en toepassen van opwaartse tractie op de slagader. Deze manoeuvre breidt het vaartuig lumen en genereert een verticaal oppervlak waarin de gebogen 19G naald is ingevoegd, waardoor het minimaliseren van het risico van prikken de achterste muur van de slagader. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Sluiting van gemeenschappelijke carotis arteriotomy. De arteriotomy wordt afgesloten met een 7-0 polypropyleen hechtdraad, met behulp van een X-patroon. De eerste pass van de naald en hechtdraad treedt de slagader lumen onderaan rechts van de arteriotomy (site 1) en verlaat de lumen links onderaan (plaats 2). De naald hechtdraad Kruis van de arteriotomy en de lumen in de rechterbovenhoek (site 3) opnieuw in te voeren. De naald verlaat vervolgens de lumen in de linkerbovenhoek (site 4). Zachte tractie aan beide uiteinden van de hechtdraad sluit de arteriotomy. De uiteinden van de hechtdraad (verlaten van de site 1 en site 4) zijn verbonden met 2 square knopen. Grijze cirkels vertegenwoordigen sites van hechtingen passeren van de vaatwand. Ononderbroken blauwe lijnen geven de gebieden aan waar de hechtdraad buiten de vaatwand is. Gestippelde blauwe lijnen geven de gebieden aan waar de hechtdraad binnen de lumen is. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Efficiënte endothelial transgenic expressie. Konijn gemeenschappelijk halsslagaderen waren getransduceerde met een adenovirale vector uiting geven aan een β-galactosidase transgenic en geoogste 3 dagen later. Getransduceerde slagader segmenten waren X-gal gekleurd intact ringen of na wordt geopend met een axiale knippen. (A-B) Nl gezicht beelden van het luminal oppervlak van de carotis ringen die axiaal opengesneden waren. (C-D) Axiale weergaven in de luminal ruimte van intact carotis ringen. (E-F) X-gal gekleurd, paraffine-ingebedde carotis segmenten werden gesegmenteerd en contra met (E) de haematoxyline en eosine of (F) nucleaire snel rood gekleurd. Schaal bar = 100 µm. Ik = intima; M = media; en een = adventitia. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Kwantificering van transgenic mRNA uitdrukking. Getransduceerde konijn gemeenschappelijk halsslagaderen waren met helper-afhankelijke adenovirus uiting van beide apo A-I (HDAdApoAI) of IL-10 (HDAdIL10) onder controle van een CMV-promotor. Slagaders zijn 3 dagen later geoogst. mRNA uitdrukking van (A) Apo A-ik (B) IL-10 werden gekwantificeerd door qRT-PCR, genormaliseerd naar GAPDH mRNA in de zelfde ader en uitgedrukt als willekeurige eenheden (AU). Balk geeft gemiddelde waarde; P -waarde is van rank-sum test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Voordelen | Nadelen | |
| Ten opzichte van knaagdier modellen | Dichter fylogenetisch bij primaten | Duurder huis te koop |
| Grotere genetische diversiteit, versoepeling van klinische vertaling | Moeilijker te fokken en verwerken | |
| Grotere schepen makkelijker chirurgische manipulatie en biedt meer weefsel voor kwantitatieve analyse | Uitgebreidere voorschriften | |
| Maakt gebruik van endovasculair inrichtingen die zijn ontworpen voor de mens | Minder genetisch gemodificeerde achtergronden | |
| Minder-uitgebreide selectie van antilichamen tegen proteïnen van konijn | ||
| In vergelijking met grotere dierlijke modellen | Relatief goedkoop te kopen en huis | Eventueel minder klinisch relevante dan andere grote diermodellen voor sommige vasculaire ziekten |
| Gemakkelijker te kweken en te hanteren | ||
| In vergelijking met de kiembaan Transgenese | Transgenic uitgedrukt alleen in de grote slagader; effect van transgenic specifiek op de site van belang kan worden bepaald | Toepassing van de methode op cellen dan endotheel is moeilijk |
| Contralaterale halsslagader kunt gebruiken als een gepaarde controle; elimineert systemische parameters (bv., bloeddruk, cholesterolgehalte) als ongecontroleerde variabelen | Operatiekamer en chirurgische expertise vereist; kern van voorzieningen waarschijnlijk niet beschikbaar | |
| Hogere doorvoer voor het testen van DNA regelgevende reeks activiteit in groot schip endotheel | Transgenic worden niet uitgedrukt kan in de meeste vasculaire bedden | |
| Potentieel sneller en goedkoper | ||
| Systemische blootstelling aan transgene eiwit onwaarschijnlijk — minimaliseert af-target effecten | ||
| In vergelijking met systemische therapie van het gen benaderingen (bijv.. Lever signaaltransductie via perifere veneuze injectie) |
Meer-stable transgenic expressie dan systemische (lever) gentherapie | Vector levering vereist chirurgische ingreep |
| Transgenic uitgedrukt in de wand van de slagader, waardoor de lokale levering van hoge niveaus van transgene proteïne | Operatiekamer en chirurgische expertise vereist | |
| Systemische blootstelling aan transgene eiwit onwaarschijnlijk — minimaliseert af-target effecten | Behandeling beperkt tot slagaders die speciaal om in te grijpen gericht zijn; systemische factoren niet te behandelen (bijv., lipiden) | |
| Contralaterale halsslagader kunt gebruiken als een gepaarde controle; systemische parameters (bijv. bloeddruk, cholesterolgehalte) elimineert als ongecontroleerde variabelen | ||
| Veel lager vector dosis vereist |
Tabel 1. Voor- en nadelen van konijn gemeenschappelijke halsslagader endotheel-selectieve gene transfer model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bepaalde aspecten van chirurgische techniek verdienen bijzondere aandacht. Volledige blootstelling en mobilisatie van de gemeenschappelijke halsslagader via zorgvuldige dissectie zal gene transfer en arteriotomy reparatie. Echter tijdens de dissectie, moet rechtstreekse manipulatie van de halsslagader worden geminimaliseerd om te voorkomen dat vasospasm. Bovendien, elke bloeden grenzend aan de slagader moet worden gestopt door toepassing van lichte druk met gaas en extravasated bloed moet worden opgeschoond onmiddellijk door het spoelen van het gebied met normale zout. Het is ook belangrijk om te voorkomen beschadiging van de nervus vagus, die parallel aan de gemeenschappelijke halsslagader loopt. Trimmen van de adventitia op het gebied van de geplande arteriotomy, zal de exploitant zowel voor het uitvoeren van een schone en functionele arteriotomy en om te herstellen van de arteriotomy helpen. Ten slotte, takken uit de gemeenschappelijke halsslagader moeten worden geïdentificeerd en veilig afgebonden om te voorkomen lekkage van de vector uit de carotis lumen.
Er zijn ook kritieke aspecten van vector infusie en arteriotomy reparatie. Tijdens de vector infusie is het belangrijk om de gemeenschappelijke halsslagader aan fysiologische of iets groter kaliber om efficiënte transductie opzwellen. Wanneer het herstellen van de arteriotomy, moet de hechtdraad doordringen in de vaatwand zo dicht mogelijk aan de randen van de arteriotomy, en moet netjes invoeren en verlaten de lumen plaats axiaal passeren op de vaatwand. Als alleen de buitenste lagen van de vaatwand samen getrokken worden omdat de hechtdraad axiaal de vaatwand passeert in plaats van radiaal passeren op de muur en het invoeren van het lumen, een gat in de intima blijft en het risico van trombose zal toenemen. Als de hechtdraad doorboringen te wijd zijn verdeeld, of als de hechtdraad is overdreven aangescherpt als gebonden, worden weefsel plooien aangemaakt op de arteriotomy site. Deze plooien verstoren normale laminaire doorbloeding, ook steeds meer risico op trombose. Behoud van consistente stroom kenmerken is belangrijk voor experimenten uitgevoerd in diermodellen van ziekten (bv., atherosclerose) omdat de gewijzigde stroom kan bijdragen aan de ziekte proces30.
Nieuwe exploitanten tegenkomen vaak thrombosed slagaders bij de oogst. Luminal trombose is een verwoestende complicatie, waardoor de slagader onbruikbaar als een experimentele monster. Om te voorkomen dat trombose, beheren we routinematig IV heparine voor genenoverdracht. Trombose is ook voorkomen door zorgvuldige sluiting van de arteriotomy, zoals hierboven beschreven. De heparine dosering kan worden verhoogd om te voorkomen dat trombose of aspirine postoperatief kan worden gegeven. Echter een hogere dosis van heparine zou ook vergroten de kans op bloeden complicaties, en aspirine kan interfereren met experimentele eindpunten, vooral als de ontsteking wordt bestudeerd. Daarom is het beter te richten op de verbeterde chirurgische techniek als middel ter voorkoming van trombose.
Als gemanipuleerd te krachtig, kunnen halsslagaderen ondergaan spasme, die ook tot trombose bijdragen kan door het verlagen van de stroom. Als vasospasm wordt aangetroffen, kan het worden verlicht door toepassing van actuele papaverine. Wanneer vaartuig oogsten zijn gepland voor meer dan 2-3 dagen na transductie en trombose een zorg is, kan transcutane echografie worden gebruikt om het schip bij noninvasively te beoordelen. Ontdekking van thrombosed slagaders kan leiden tot euthanasie om te besparen op huisvestingskosten. Extra dieren kunnen ook snel om te vullen experimentele groepen worden ingeschreven. Peri - en na - intervention sterfte die zijn gekoppeld aan deze methode moet < 1% (dwz., niet verschillend van sterfte verbonden met andere operaties uitgevoerd op gezonde konijnen)31.
Na een operator wordt comfortabel met de technische aspecten van het chirurgische protocol, een mogelijkheid voor het uitvoeren van efficiënte genoverdracht op het endotheel moet worden geverifieerd, met behulp van de methoden beschreven in de sectie boven op representatieve resultaten. Als er zich problemen voordoen met de verwezenlijking van reproduceerbare genenoverdracht, is de boosdoener waarschijnlijk in een van de twee gebieden. Nadat het vaartuig geïsoleerd is en het bloed van de lumen is gewassen, is het belangrijk om te verwijderen van de DMEM was buffer zodat de geïnfundeerd vector-oplossing wordt niet verdund tijdens transductie. De andere belangrijk aspect is het opzwellen van het schip naar de fysiologische of iets groter kaliber tijdens vector infusie. Omdat in onze ervaring, een halsslagader die niet volledig opgezwollen of blijft niet opgezwollen tijdens de infusie 20 minuten durende betrouwbaar lage transgenic expressie heeft, is het waarschijnlijk dat zwelling van de slagader aan fysiologische kaliber de signaaltransductie verbetert efficiëntie. Echter, we hebben nooit onderzocht dit systematisch. Het is mogelijk dat verhoging van de druk van de infusie boven het niveau van fysiologische kon transductie efficiëntie verhogen, en ook de mogelijkheid van hogere niveaus van signaaltransductie van cellen in de vasculaire media. Verstoring van het endotheel blok zou echter waarschijnlijk schade van het vaartuig en het risico van trombose verhogen. Als het vaartuig is blijft niet voor de gehele 20 minuten durende vector-incubatie periode opgezwollen, is het waarschijnlijk dat de vector van takken van de gemeenschappelijke halsslagader lekt. Wees voorzichtig tijdens dissectie te identificeren en afbinden van alle takken om te voorkomen lekkage van de vector uit de carotis lumen.
Deze methode heeft verschillende beperkingen die gerelateerd zijn aan het gebruik van konijnen. Konijnen zijn minder dure huis te voeden dan de andere grote dieren (honden, varkens, schapen); de kosten van aanschaf, huisvesting en voeding van konijnen zijn echter aanzienlijk meer dan voor muizen en ratten. De operatiekamer faciliteiten en regelgevende vereisten voor konijn operaties zijn ook veel uitgebreider dan voor knaagdieren. Daarnaast is veel technische expertise nodig om het effectief uitvoeren van het chirurgische gene transfer protocol. Deze expertise kan worden verkregen door exploitanten die hebben had geen formele chirurgische opleiding. Ten minste 2 personen in onze groep (met inbegrip van de primaire auteur van dit manuscript) hebben de chirurgische technieken geleerd en toegepast hen productief. Echter zijn nauwgezet opleiding en een zorgvuldige validering van een operator's gene spuitrendement en reproduceerbaarheid (zoals beschreven in de sectie representatieve resultaten) nodig voordat de exploitant kan om kwalitatief hoogwaardige gegevens te genereren.
Opsluiting van transgenic meningsuiting vrijwel uitsluitend aan het endotheel met deze methode29,32,33,34,35,36,,37 is handig kan onderzoek van transgenic effecten in endotheliale cellen en meting van de activiteit van cis-acteren regelgevende opeenvolgingen van DNA in de endotheliale cellen. Een klein aantal adventitial of mediale cellen kan worden transduced; het onvermogen van deze methode om efficiënt transduce nonendothelial cellen voorkomt echter dat de toepassing van de methode aan de studie van andere soorten vasculaire muur cellen (zoals zachte spiercellen en macrofagen). Hoewel overexpressie van secreted eiwitten uit getransduceerde endotheliale cellen kunnen onderzoek van de effecten van deze proteïnen op andere vasculaire cel typen, de rol van niet-uitgescheiden eiwitten in deze andere vasculaire celtypen (bv. receptoren of eiwitten betrokken in signaaltransductie) met deze methode kan niet worden onderzocht.
Als een middel voor het testen van de slagader muur-gerichte gentherapie, verschilt de methode van andere preklinische methoden op twee belangrijke manieren. Ten eerste, de methode maakt gebruik van een konijn model voor in vivo tests van gentherapie in plaats van meer gebruikte knaagdier modellen8,12,15,38,39. Het gebruik van konijnen kunt beoordeling van transgenic expressie en de biologische rol van de transgenic product in een dierlijk model van outbred, die meer representatief is voor de menselijke genetische diversiteit dan ingeteelde knaagdieren. Het model kan worden gebruikt ter beoordeling van de therapie van het gen in een normale konijn slagaders of konijn slagaders die Arteriële pathologie die is vergelijkbaar met die gevonden in zieke menselijke slagaders hebben. Konijn slagaders zijn ook dichter in grootte bij menselijke slagaders dan knaagdieren slagaders en veel meer weefsel voor analyse geeft dan is beschikbaar van knaagdier slagaders. Het tweede grote verschil is dat deze methode een chirurgische aanpak gebruikt voor transgenic vector naar het vasculaire endotheel. Somatische gentherapie wordt vaak geleverd systemisch, vaakst door zich te richten van de lever met het doel van de wijziging van plasma niveaus van de transgenic eiwit25,40. Door zich te richten vasculaire endotheel, levert de methode het therapeutische transgenic product lokaal, met de concentratie van de piek in de wand van de slagader, precies waar het is nodig voor vaatziekten behandeling. Door het leveren van de transgenic alleen lokaal, elimineert de methode ook systemische bijwerkingen van het product transgenic. Andere groepen zijn het ontwikkelen van methodes met behulp van peptiden, antilichamen of andere Eiwitmantel aanpassingen voor het targeten van systeemkritisch ingespoten vectoren aan gezonde of zieke endotheel om lokale vasculaire gene therapie41,42 , 43. maar deze targeting methoden blijven in ontwikkeling, en zijn nog steeds bemoeilijkt door de aanzienlijke systemische signaaltransductie, vooral in de lever42,43,44. Onze chirurgische methode biedt een nauwkeurige en efficiënte invoering van transgenen aan het vasculaire endotheel met minimale - indien aanwezig - transductie op andere locaties. 1 de methode is ook een handiger, efficiënt en hoger-in de gehele gemiddelde (t.o.v. germinale Transgenese of systemische injectie van endotheel-gerichte vectoren) voor het testen van de activiteit van regelgevende opeenvolgingen van DNA in het grote schip endotheel, voor testen transgenic eiwitfunctie in de wand van de slagader, en voor het testen van schip-muur-gerichte gentherapie.
Met deze methode kan onderzoek naar de biologische rol van elke transgenic, wanneer het wordt uitgedrukt in de grote slagader endotheel. Als gewijzigd naar express-van-verliesfunctie reagentia zoals dominante negatieve receptoren of korte haarspeld RNA, zou het onderzoek naar de rol van endogene endothelial eiwitten en signaalroutes mogelijk. De methode kan ook worden gebruikt voor het meten van de transcriptionele activiteit van elke opeenvolging van DNA van cis-acteren in de grote slagader endotheliale cellen5,6,7. Bovendien, de methode kunt testen van elk type van gene transfer vector voor efficiëntie en veiligheid wanneer lokaal aan endotheel geleverd, en zal onthullen de mogelijkheid van de vector om duurzaam transgenic expressie. Ten slotte, staat de methode ontwikkeling en testen van combinaties van vectoren en transgenen die zijn ontworpen voor het leveren van vasculaire muur-gerichte gentherapie. De methode kan dienen als een instrument voor screening om therapeutische genen die macht-in de toekomst te identificeren-worden geleverd aan het endotheel van alle grote arteriën (of alle zieke grote arteriën) door percutaneously ingespoten vasculaire muur-gerichte vectoren. Vanwege reeds bestaande immuniteit bij de mens tot adenovirus type 545, zal het lastig zijn te gebruiken adenovirus type 5 gebaseerde vectoren in klinische toepassingen. Engineering van het adenovirus 5 Eiwitmantel, gebruik van alternatieve adenovirus serotypen46, of het gebruik van minder-immunogene vectoren zoals AAV mogelijk vereist om vasculaire gentherapie naar de kliniek. Als een experimentele rol, echter zijn wij niet op de hoogte van elke vector die met helper-afhankelijke adenovirus 5 concurreren kan bij de verwezenlijking van doeltreffend en duurzaam transgenic expressie in bloedvaten1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken AdVec, Inc. voor toestemming voor het gebruik van HDAd reagentia, Julia Feyk voor administratieve bijstand en de veterinaire diensten van de afdeling van vergelijkende geneeskunde voor chirurgische advies en ondersteuning. Dit werk werd gesteund door HL114541 en de John L. Locke, Jr. Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
| 1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
| 20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
| Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
| Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |
References
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- Falkenberg, M., et al. Increased expression of urokinase during atherosclerotic lesion development causes arterial constriction and lumen loss, and accelerates lesion growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 10665-10670 (2002).
- Schneider, D. B., et al. Expression of Fas ligand in arteries of hypercholesterolemic rabbits accelerates atherosclerotic lesion formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 298-308 (2000).
- Du, L., Dronadula, N., Tanaka, S., Dichek, D. A. Helper-dependent adenoviral vector achieves prolonged, stable expression of interleukin-10 in rabbit carotid arteries but does not limit early atherogenesis. Hum Gene Ther. 22, 959-968 (2011).
- Dronadula, N., et al. Construction of a novel expression cassette for increasing transgene expression in vivo in endothelial cells of large blood vessels. Gene Ther. 18, 501-508 (2011).
- Dronadula, N., Wacker, B. K., Van Der Kwast, R., Zhang, J., Dichek, D. A. Stable In Vivo Transgene Expression in Endothelial Cells with Helper-Dependent Adenovirus: Roles of Promoter and Interleukin-10. Hum Gene Ther. 28, 255-270 (2017).
- Dong, G., Schulick, A. H., DeYoung, M. B., Dichek, D. A. Identification of a cis-acting sequence in the human plasminogen activator inhibitor type-1 gene that mediates transforming growth factor-b1 responsiveness in endothelium in vivo. J Biol Chem. 271, 29969-29977 (1996).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Zeng, Z., et al. Hemodynamics and anatomy of elastase-induced rabbit aneurysm models: similarity to human cerebral aneurysms. AJNR Am J Neuroradiol. 32, 595-601 (2011).
- Macdonald, R. L., Wallace, M. C., Montanera, W. J., Glen, J. A. Pathological effects of angioplasty on vasospastic carotid arteries in a rabbit model. J Neurosurg. 83, 111-117 (1995).
- Nakai, K., Numaguchi, Y., Moritani, T. Vasospasm model of a rabbit common carotid artery for endovascular research. Acad Radiol. 9, 270-275 (2002).
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Baumgartner, C., Brandl, J., Munch, G., Ungerer, M. Rabbit models to study atherosclerosis and its complications - Transgenic vascular protein expression in vivo. Prog Biophys Mol Biol. 121 (2), 131-141 (2016).
- Wang, K., et al. Three-Layered PCL Grafts Promoted Vascular Regeneration in a Rabbit Carotid Artery Model. Macromol Biosci. 16 (4), 608-618 (2016).
- Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. Eur J Cardiothorac Surg. 30, 451-463 (2006).
- Dornas, W. C., Oliveira, T. T., Augusto, L. E., Nagem, T. J.
- Graur, D., Duret, L., Gouy, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379 (6563), 333-335 (1996).
- Yanni, A. E. The laboratory rabbit: an animal model of atherosclerosis research. Lab Anim. 38, 246-256 (2004).
- Miao, C. H., et al. Inclusion of the hepatic locus control region, an intron, and untranslated region increases and stabilizes hepatic factor IX gene expression in vivo but not in vitro. Mol. Ther. 1, 522-532 (2000).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Schlaeger, T. M., et al. Uniform vascular-endothelial-cell-specific gene expression in both embryonic and adult transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3058-3063 (1997).
- Cowan, P. J., et al. Targeting gene expression to endothelial cells in transgenic mice using the human intercellular adhesion molecule 2 promoter. Transplantation. 62 (2), 155-160 (1996).
- Sehara, Y., et al. Persistent Expression of Dopamine-Synthesizing Enzymes 15 Years After Gene Transfer in a Primate Model of Parkinson's Disease. Hum Gene Ther Clin Dev. 28, 74-79 (2017).
- Tangirala, R. K., et al. Regression of atherosclerosis induced by liver-directed gene transfer of apolipoprotein A-I in mice. Circulation. 100, 1816-1822 (1999).
- Benoit, P., et al. Somatic gene transfer of human ApoA-I inhibits atherosclerosis progression in mouse models. Circulation. 99, 105-110 (1999).
- Raper, S. E., et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab. 80, 148-158 (2003).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37, 316-327 (2017).
- Brunetti-Pierri, N., et al. Transgene expression up to 7 years in nonhuman primates following hepatic transduction with helper-dependent adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 24, 761-765 (2013).
- Rome, J. J., et al. Anatomic barriers influence the distribution of in vivo. gene transfer into the arterial wall. Modeling with microscopic tracer particles and verification with a recombinant adenoviral vector. Arterioscler Thromb. 14, 148-161 (1994).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab Invest. 85, 9-23 (2005).
- Brodbelt, D. Perioperative mortality in small animal anaesthesia. Vet J. 182, 152-161 (2009).
- Schulick, A. H., Dong, G., Newman, K. D., Virmani, R., Dichek, D. A.
- Vassalli, G., Agah, R., Qiao, R., Aguilar, C., Dichek, D. A. A mouse model of arterial gene transfer. Antigen-specific immunity is a minor determinant of the early loss of adenovirus-mediated transgene expression. Circ Res. 85, 25-32 (1999).
- Schneider, D. B., Fly, C. A., Dichek, D. A., Geary, R. L. Adenoviral gene transfer in arteries of hypercholesterolemic nonhuman primates. Hum Gene Ther. 9, 815-821 (1998).
- Newman, K. D., et al. Adenovirus-mediated gene transfer into normal rabbit arteries results in prolonged vascular cell activation, inflammation, and neointimal hyperplasia. J Clin Invest. 96, 2955-2965 (1995).
- Jiang, B., et al. Helper-dependent adenovirus is superior to first-generation adenovirus for expressing transgenes in atherosclerosis-prone arteries. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 1317-1325 (2011).
- Gruchala, M., et al. Gene transfer into rabbit arteries with adeno-associated virus and adenovirus vectors. J Gene Med. 6, 545-554 (2004).
- Lee, Y. T., et al. Mouse models of atherosclerosis: a historical perspective and recent advances. Lipids Health Dis. 16, 12 (2017).
- Manning, M. W., Cassi, L. A., Huang, J., Szilvassy, S. J., Daugherty, A. Abdominal aortic aneurysms: fresh insights from a novel animal model of the disease. Vasc Med. 7, 45-54 (2002).
- Lai, C. H., et al. Recombinant adeno-associated virus vector carrying the thrombomodulin lectin-like domain for the treatment of abdominal aortic aneurysm. Atherosclerosis. 262, 62-70 (2017).
- Tan, P. H., et al. Antibody targeted gene transfer to endothelium. J Gene Med. 5, 311-323 (2003).
- Nicklin, S. A., White, S. J., Nicol, C. G., Von Seggern, D. J., Baker, A. H. In vitro and in vivo characterisation of endothelial cell selective adenoviral vectors. J Gene Med. 6, 300-308 (2004).
- White, K., et al. Engineering adeno-associated virus 2 vectors for targeted gene delivery to atherosclerotic lesions. Gene Ther. 15, 443-451 (2008).
- Kaliberov, S. A., et al. Retargeting of gene expression using endothelium specific hexon modified adenoviral vector. Virology. 447, 312-325 (2013).
- Schulick, A. H., et al. Established immunity precludes adenovirus-mediated gene transfer in rat carotid arteries. Potential for immunosuppression and vector engineering to overcome barriers of immunity. J Clin Invest. 99, 209-219 (1997).
- Hollingdale, M. R., Sedegah, M., Limbach, K. Development of replication-deficient adenovirus malaria vaccines. Expert Rev Vaccines. 16, 261-271 (2017).
