Vivo में खरगोश को जीन हस्तांतरण आम मन्या धमनी Endothelium
Summary
इस विधि को खरगोश मन्या धमनियों के endothelium में एक transgene परिचय है । transgene का परिचय transgene उत्पाद की जैविक भूमिका के मूल्यांकन की अनुमति देता है या तो सामांय धमनियों या रोग मॉडल में । विधि भी डीएनए विनियामक दृश्यों की गतिविधि को मापने के लिए उपयोगी है ।
Abstract
इस विधि का लक्ष्य दोनों खरगोश आम मन्या धमनियों के पृथक खंडों के endothelium में एक transgene परिचय है. विधि फोकल endothelial-चयनात्मक transgenesis प्राप्त करता है, जिससे एक अंवेषक endothelial की जैविक भूमिकाओं-व्यक्त transgenes निर्धारित करने के लिए और बड़ी धमनी में डीएनए दृश्यों की vivo transcriptional गतिविधि में यों तो की अनुमति देता है endothelial कक्ष । विधि खरगोश आम मन्या धमनियों के सर्जिकल अलगाव का उपयोग करता है और एक arteriotomy एक transgene-व्यक्त वायरल वेक्टर में धमनी लुमेन उद्धार करने के लिए । लुमेन में सदिश की एक छोटी गर्मी की अवधि, लुमेन सामग्री के बाद आकांक्षा के साथ, endothelium में transgene की कुशल और टिकाऊ अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है, कोई पता लगाने के transduction या अभिव्यक्ति के बाहर के साथ पृथक धमनी खंड । विधि दोनों सामांय धमनियों में और मानव संवहनी रोग के मॉडल में transgene उत्पादों की जैविक गतिविधियों का आकलन करने की अनुमति देता है, जबकि प्रणालीगत प्रभाव है कि या तो अंय साइटों (उदाहरणके लिए जीन वितरण लक्ष्यीकरण द्वारा कारण हो सकता है परहेज जिगर) या रोगाणु लाइन transgenesis द्वारा endothelium को आनुवंशिक constructs देने के वैकल्पिक दृष्टिकोण से । विधि के आवेदन एक कुशल सर्जन और anesthetist, एक अच्छी तरह से सुसज्जित ऑपरेटिंग कमरे, क्रय और आवास खरगोश की लागत, और जीन स्थानांतरण वेक्टर निर्माण और उपयोग में विशेषज्ञता के लिए की जरूरत के लिए की जरूरत द्वारा सीमित है । इस विधि के साथ प्राप्त परिणामों में शामिल हैं: धमनी संरचना, सेलुलर, extracellular मैट्रिक्स, या vasomotor समारोह में transgene से संबंधित परिवर्तन; बढ़ जाती है या धमनी सूजन में कमी; संवहनी कोशिका apoptosis में परिवर्तन; और प्रगति, मंदता, या intimal हाइपरप्लासिया या atherosclerosis जैसे रोगों के प्रतिगमन । विधि भी देशी और सिंथेटिक डीएनए विनियामक अनुक्रम की क्षमता की माप की अनुमति देता है endothelial कोशिकाओं में transgene अभिव्यक्ति में परिवर्तन, परिणाम है कि शामिल प्रदान: transgene mRNA के स्तर, transgene प्रोटीन के स्तर, और transgene के स्तर एंजाइमी हालचाली.
Introduction
इस विधि के लक्ष्य को खरगोश आम मन्या धमनियों के endothelium में एक transgene परिचय है । transgene का परिचय सामान्य धमनियों में और मानव धमनी रोग के खरगोश मॉडल में transgene उत्पाद की जैविक भूमिका के आकलन की अनुमति देता है । रोग मॉडल में transgene के व्यक्त प्रकट कर सकते है कि transgene (और उसके प्रोटीन उत्पाद) चिकित्सकीय एजेंटों के रूप में वादा दिखाओ1,2,3,4। transgene अभिव्यक्ति कैसेट में सीआईएस एक्टिंग विनियामक तत्वों को शामिल करने से vivo5,6 मेंधमनी endothelium में इन तत्वों की सक्रियता का आकलन सक्षम हो जाता है । विशिष्ट सीआईएस अभिनय नियामक तत्वों की गतिविधि का ज्ञान अधिक सक्रिय अभिव्यक्ति कैसेट डिजाइन करने के लिए और vivo7में बड़ी धमनी endothelium में जीन विनियमन के तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
खरगोश मानव संवहनी शरीर विज्ञान और रोग के विभिंन पहलुओं के लिए एक मूल्यवान मॉडल हैं । खरगोश मनुष्यों के साथ कई संवहनी सुविधाओं का हिस्सा है । उदाहरण के लिए, आधारभूत रक्त मूल्यों, hemostatic विनियमन, और संवहनी अनुदैर्ध्य तनाव खरगोशों और मनुष्यों के बीच समान हैं8. संवहनी रोगों के खरगोश मॉडल सहित कई मानव रोगों की मुख्य विशेषताएं दोहराने: aneurysms (समान ज्यामितीय और प्रवाह विशेषताओं)9, vasospasm (अंतर्वाहिकी उपचार के लिए इसी तरह की प्रतिक्रिया)10,11, और atherosclerosis (लिपिड, मैक्रोफेज में अमीर एक कोर, और एक रेशेदार टोपी में चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं सहित समान सुविधाओं के साथ intimal सजीले टुकड़े)12,13. तदनुसार, खरगोश मॉडल ऐसे घनास्त्रता, vasospasm, धमनीविस्फार, मधुमेह, संवहनी भ्रष्टाचार रोग के रूप में कई संवहनी रोगों के लिए विकसित किया गया है, और atherosclerosis8,13,14, 15,16.
संवहनी शरीर विज्ञान और रोग के पशु मॉडल के बीच चुनने के शोधकर्ताओं के लिए, खरगोश के कई फायदे हैं । कुतर की तुलना में, खरगोशों के बड़े जहाजों आसान शल्य हेरफेर, अंतर्वाहिकी उपकरणों के उपयोग, और मात्रात्मक माप के लिए ऊतक की एक बड़ी राशि की अनुमति देते हैं । खरगोश बहुत करीब है phylogenetically से रहनुमाओं के लिए कर रहे है17कुतर रहे हैं, और नस्ली खरगोशों की अधिक से अधिक आनुवंशिक विविधता मनुष्यों की आनुवंशिक परिवर्तनशीलता को बेहतर अनुमानित । आनुवंशिक विविधता विशेष रूप से नैदानिक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, जो-उनके स्वभाव से-उद्देश्य है कि आनुवंशिक रूप से विविध मानव आबादी के लिए लागू किया जा सकता है चिकित्सा विकसित करने के लिए । कई के साथ के रूप में नहीं तो अंय सभी मॉडल प्रजातियों, खरगोश जीन आसानी से क्लोन या संश्लेषित कर रहे है क्योंकि खरगोश जीनोम उच्च कवरेज (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2] के साथ अनुक्रम किया गया है । अंय बड़े पशु मॉडल (जैसे कुत्तों, सूअर, या भेड़ के रूप में) की तुलना में, खरगोश खरीद और घर के लिए अपेक्षाकृत सस्ती कर रहे है और वे नस्ल और संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं । खरगोशों में विशिष्ट संवहनी रोग मॉडल प्रत्येक मानव रोग के मॉडल है कि इस पांडुलिपि8,12,18के दायरे से बाहर हैं के रूप में अपने स्वयं के फायदे और कमियों है । एक अंवेषक इन लाभों और कमियों की समीक्षा के लिए अगर खरगोश एक विशिष्ट प्रयोगात्मक सवाल का जवाब देने के लिए सबसे अच्छा मॉडल है निर्धारित करना चाहिए ।
vivo में endothelial कोशिकाओं में deoxyribonucleic एसिड (DNA) विनियामक अनुक्रम की शुरूआत एक जटिल शारीरिक वातावरण में इन दृश्यों की गतिविधि की जांच सक्षम बनाता है । इन विट्रो में transfected endothelial कोशिकाओं में अध्ययन डीएनए विनियामक अनुक्रम के प्रारंभिक आकलन के लिए उपयोगी हो सकता है; हालांकि, vivo5,19,20 मेंअध्ययन दोहराया जाता है जब ऊतक संस्कृति मॉडल में अभिव्यक्ति का स्तर कभी नहीं reproduced कर रहे हैं । इन विट्रो में सिस्टम भी प्रोटीन संकेतन और endothelial शरीर क्रिया विज्ञान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संस्कृतिपूर्ण संवहनी कोशिकाओं के बीच संचार के बुनियादी रास्ते की खोज के लिए उपयोगी हो सकता है; हालांकि, और अधिक जटिल रास्ते या विनियामक नेटवर्क है कि पड़ोसी संवहनी कोशिकाओं या प्रतिरक्षा प्रणाली के जटिल आबादी से प्रभावित कर रहे है सबसे अच्छा में एक vivo प्रणाली6,20में अध्ययन कर रहे हैं । यहां वर्णित विधि के साथ या बिना रोग के एक बरकरार पोत के संदर्भ में endothelium में transgene अभिव्यक्ति के विनियमन की खोज के लिए एक मंच प्रदान करता है । vivo में प्रणाली भी शारीरिक और रोग सेलुलर crosstalk की जांच और प्रतिरक्षा प्रणाली के योगदान की पहचान जीन अभिव्यक्ति के विनियमन के लिए परमिट6।
रोगाणु लाइन transgenesis (विशेष रूप से चूहों में) endothelial कोशिकाओं को transgene अभिव्यक्ति निर्देशन के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है । यह तरीका विशिष्ट प्रवर्तक या विनियामक क्षेत्रों21,22द्वारा मध्यस्थता endothelial लक्ष्यीकरण के साथ जीवन-दीर्घ transgene अभिव्यक्ति प्रदान कर सकता है । हालांकि, ट्रांसजेनिक चूहों की पीढ़ी समय लेने वाली और महंगी है, कई ट्रांसजेनिक लाइनों अक्सर वांछित सेल प्रकार और पर्याप्त transgene अभिव्यक्ति स्तर की उपलब्धि के लिए transgene का लक्ष्यीकरण सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए, और प्रयोगात्मक murine प्रणालियों में परिणाम तनाव पर निर्भर हो सकता है । endothelial-लक्षित transgenes के साथ Murine ट्रांसजेनिक मॉडल कई फायदे हैं: transgenesis को प्राप्त करने के क्रम में हर प्रयोगात्मक पशु पर सर्जरी प्रदर्शन करने की कोई जरूरत नहीं है, प्रयोगात्मक चूहों में कई अन्य उपलब्ध ट्रांसजेनिक चूहों के साथ पैदा किया जा सकता है आदेश आनुवंशिक और phenotypic बातचीत का परीक्षण करने के लिए, और वहां एंटीबॉडी की एक विस्तृत चयन कि murine प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया, phenotypes के लक्षण वर्णन की सुविधा है । हालांकि, रोगाणु लाइन के माध्यम से endothelium को transgenes के लक्ष्यीकरण आमतौर पर vasculature भर में transgene अभिव्यक्ति में परिणाम,22 यह मुश्किल साइट है जिस पर transgene उत्पाद अभिनय है निर्धारित करने के लिए कर रही है । यह विशेष रूप से सच है जब transgene उत्पाद स्रावित है, क्योंकि एक transgene उत्पाद vasculature भर में endothelial कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक जानवर के भीतर साइटों के किसी भी संख्या में जैविक गतिविधि हो सकता है । हालांकि विधि इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीकी विशेषज्ञता और विशेष सुविधाओं की आवश्यकता है, यह कम समय लेने वाली और कम एक endothelial-विशिष्ट ट्रांसजेनिक माउस लाइन के विकास से महंगा हो सकता है । यह बड़ी धमनी के एक खंड के endothelial कोशिकाओं में चुनिंदा एक प्रोटीन के समारोह के आकलन के लिए अनुमति देता है, और यह contralateral आम मन्या का उपयोग एक बनती नियंत्रण के रूप में परमिट (प्रणालीगत कारकों को नष्ट करने कि प्रयोगात्मक के बीच भिन्न हो सकते हैं पशु-उदाहरण के लिए, रक्तचाप या कोलेस्ट्रॉल के स्तर-अनियंत्रित चर के रूप में) ।
जीन थेरेपी संवहनी रोगों के उपचार के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है, विशेष रूप से पुराने रोगों, क्योंकि एक भी आवेदन निरंतर या संभवतः जीवन एक चिकित्सीय जीन23की लंबी अभिव्यक्ति प्रदान कर सकते हैं । जीन थेरेपी के चिकित्सकीय वादा दैहिक जीन हस्तांतरण के पशु मॉडलों में पता लगाया गया है, अक्सर जिगर को लक्षित24,25, जो एक अपेक्षाकृत आसान लक्ष्य है क्योंकि कई रक्त जनित वायरल वैक्टर hepatotropic हैं । हालांकि, संवहनी रोग पर एक प्रभाव है, जीन जिगर को लक्षित थेरेपी प्रोटीन के प्रणालीगत एक्सप्रेस प्राप्त करना चाहिए । यह आमतौर पर वेक्टर, जो विषाक्त या भी घातक हो सकता है की बड़ी खुराक की आवश्यकता है26। इसके अलावा, एक प्रोटीन के प्रणालीगत स्तर में वृद्धि बंद लक्ष्य साइड इफेक्ट है, जो जटिल या भी प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या अस्पष्ट सकता है के जोखिम को बढ़ा । स्थानीय जीन endothelium लक्ष्यीकरण संवहनी चिकित्सा के रूप में इस पांडुलिपि में वर्णित प्रणालीगत दुष्प्रभाव से बचने क्योंकि संचार वेक्टर व्यापक रूप से transduced धमनी क्षेत्र से परे नहीं फैलाया जा सकता है, और स्थानीय संवहनी प्रभाव के बिना प्राप्त किया जा सकता है प्रोटीन के प्रणालीगत प्लाज्मा स्तर में परिवर्तन । 27 इसके अलावा, वेक्टर की एक बहुत कम राशि के लिए मजबूत यकृत transduction को प्राप्त करने की जरूरत है की तुलना में एक धमनी खंड transduce की जरूरत है । जिगर से Transgene अभिव्यक्ति के लिए समय के साथ गिरावट की सूचना दी गई है, शायद सेल कारोबार के कारण, दोहराया खुराक की आवश्यकता होती है अगर उच्च स्तर Transgene अभिव्यक्ति को बनाए रखा है । 28 इसके विपरीत, endothelium के कम कारोबार दर चाउ-फेड खरगोशों में कम से ४८ सप्ताह के लिए स्थिर अभिव्यक्ति प्रदान करता है और कोलेस्ट्रॉल से तंग आ चुके खरगोशों के atherosclerotic घावों में सबसे कम 24 हफ्तों के लिए । 1 , 27
यह निर्धारित करने के लिए कि खरगोश आम मन्या endothelium के लिए जीन हस्तांतरण की यह विधि उपयुक्त है, तो फायदे और नुकसान (तालिका 1) विशिष्ट शोध लक्ष्यों के संदर्भ में विचार किया जाना चाहिए । इस विधि के लाभ में शामिल हैं: नस्ल खरगोश मानव आनुवंशिक विविधता के बेहतर प्रतिनिधि से कर रहे है नस्ल चूहों (नैदानिक काम के लिए महत्वपूर्ण); खरगोश आसान हेरफेर और विश्लेषण के लिए और अधिक ऊतक के लिए बड़ा जहाजों प्रदान; विधि endothelium-लक्षित transgene अभिव्यक्ति कहीं अधिक जल्दी से प्राप्त कर सकते है से रोगाणु लाइन endothelial ट्रांसजेनिक चूहों में लक्ष्यीकरण; वेक्टर खुराक आसानी से transgene अभिव्यक्ति के मॉडल चर स्तर को समायोजित किया जा सकता है; बड़ी धमनी endothelium के लिए विशिष्ट प्रक्रियाओं की जांच की जा सकती है; और स्थानीय संवहनी transgenesis विपरीत मन्या एक ही जानवर में एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है, अनियंत्रित चर के रूप में प्रणालीगत कारकों को नष्ट करने. नुकसान में शामिल हैं: विशेष सुविधाओं और विशेषज्ञता की आवश्यकता है; कम आनुवंशिक रूप से संशोधित पृष्ठभूमि, जिस पर प्रयोग करने के लिए चूहों की तुलना में खरगोश में उपलब्ध हैं; और वहाँ माउस प्रोटीन बनाम खरगोश के लिए एंटीबॉडी का एक कम व्यापक चयन है (transgene प्रोटीन और अन्य एंटीजन कि प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या में महत्वपूर्ण हो सकता है की immunodetection के लिए).
Protocol
Representative Results
Discussion
सर्जिकल तकनीक योग्यता विशेष ध्यान के कुछ पहलुओं । सावधान विच्छेदन के जरिए आम मन्या धमनी के पूर्ण प्रदर्शन और जुड़ाव जीन हस्तांतरण और arteriotomy मरम्मत की सुविधा होगी. हालांकि, विच्छेदन के दौरान, मन्या धमनी क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम HDAd रिएजेंट, प्रशासनिक सहायता के लिए जूलिया Feyk, और शल्य चिकित्सा सलाह और समर्थन के लिए तुलनात्मक चिकित्सा पशु चिकित्सा सेवाओं के विभाग का उपयोग करने की अनुमति के लिए AdVec, Inc धंयवाद । यह काम HL114541 और जॉन एल लोके, जूनियर चैरिटेबल ट्रस्ट द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
| 1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
| 20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
| Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
| Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |
References
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