I Vivo Genoverføring til kaninen felles arteria carotis endotelet

Summary

Denne metoden er å innføre en transgene i endotelet av kanin carotis arteriene. Innføringen av transgene lar vurdering av biologiske rollen av transgene produktet i normale arterier eller sykdom modeller. Metoden er også nyttig for å måle aktivitet av regulatoriske DNA-sekvenser.

Abstract

Målet med denne metoden er å innføre en transgene i endotelet av isolerte deler av begge kanin felles carotis arteriene. Metoden oppnår fokal endothelial-selektive transgenesis, og dermed slik at etterforsker å bestemme biologiske rollene endothelial-uttrykt effekter av transgener og kvantifisere i vivo transcriptional aktiviteten til DNA-sekvenser i store arterie endotelceller. Metoden bruker kirurgisk isolering av kanin felles carotis arteriene og en arteriotomy for å levere en transgene-uttrykke viral vektor i arterial lumen. En kort inkubasjonstiden av vektoren i lumen, med påfølgende aspirasjon av lumen innholdet, er tilstrekkelig til å oppnå og varig uttrykket av transgene i endotelet, uten synlig signaltransduksjon eller uttrykket utenfor det isolert arteriell segment. Metoden gjør vurdering av de biologiske aktivitetene av transgene produkter både i normale arterier og modeller for menneskelig vaskulær sykdom, mens du unngår systemiske effekter som kan være forårsaket enten av målretting gen levering til andre nettsteder (f.eks. leveren) eller av alternativ tilnærming å levere genetisk konstruksjoner til endotelet av bakterie linjen transgenesis. Påføringsmetode begrenses av behovet for en dyktig kirurg og anesthetist, en velutstyrt operasjonsstuen, kostnadene ved innkjøp og bolig kaniner, og behovet for kompetanse i genoverføring vektor bygging og bruk. Resultater oppnådd med denne metoden inkluderer: transgene-relaterte endringer i arterial struktur, cellularity, ekstracellulær matrix eller vasomotor funksjon; økning eller reduksjon i arterial betennelse; endringer i vascular celle apoptose; og fremdrift, retardasjon eller regresjon av sykdommer som intimal hyperplasia eller åreforkalkning. Metoden kan også måling av evnen av innfødte og syntetisk DNA regulatoriske sekvenser å endre transgene uttrykk i endotelceller, gir resultater som omfatter: nivåer av transgene mRNA, nivåer av transgene protein og nivåer av transgene enzymatisk aktivitet.

Introduction

Målet med denne metoden er å innføre en transgene i endotelet av kanin felles carotis arteriene. Innføringen av transgene lar vurdering av biologiske rollen av transgene produktet både i normale arterier og kanin modeller av menneskelig arterial sykdom. Overuttrykte transgene sykdom modeller kan avsløre om transgene (og protein produktet) viser lover som terapeutiske agenter^1,2,3,4. Inkludering av cis-fungerende regulatoriske elementer i transgene uttrykk kassetten gjør vurdering av aktiviteten til disse elementene i arterial endotelet i vivo^5,6. Kunnskap om aktiviteten til bestemte cis-fungerende regulatoriske elementer kan brukes til å utforme aktive uttrykk kassetter og å undersøke mekanismer av genet regulering i store arterien endotelet i vivo⁷.

Kanin er en verdifull modell for ulike sider ved menneskelige vaskulær fysiologi og sykdom. Kanin aksje mange vaskulær funksjoner med mennesker. For eksempel er opprinnelige Hematologisk verdier, hemostatic regulering og vaskulær langsgående spenning like mellom kaniner og mennesker⁸. Kanin modeller av vaskulær sykdom gjenskape nøkkel vise egenskaper av mange menneskelige sykdommer, inkludert: aneurismer (lignende geometriske og flyt)⁹, vasospasme (lignende svar til endovascular behandling)^10,11, og aterosklerose (intimal plaketter med lignende funksjoner inkludert en kjerne rik på lipid, makrofager og glatt muskel celler i en fibrøs cap)^12,13. Følgelig kanin modeller har blitt utviklet for mange vascular sykdommer som blodpropp, vasospasme, aneurisme, diabetes, vaskulære pode stenose og aterosklerose^{8,13,14, 15,16}.

For forskere å velge blant dyr modeller av vaskulær fysiologi og sykdom, har kaninen flere fordeler. Sammenlignet med gnagere, kan de større fartøyene kaniner lettere kirurgisk manipulasjon, bruk av endovascular enheter, og en større mengde vev for kvantitative mål. Kanin er mye nærmere phylogenetically primater enn gnagere¹⁷, og større genetisk mangfold av outbred kanin bedre tilnærmet genetisk variasjon av mennesker. Genetisk mangfold er spesielt viktig for prekliniske studier, som-av natur-målet å utvikle terapier som kan brukes til genetisk ulike menneskelige befolkningen. Som med mange om ikke alle andre modellen arter, kanin gener er lett klonet eller syntetisert fordi kanin genomet har blitt sekvensert med høy dekning (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Sammenlignet med andre store dyr modeller (som hunder, griser og sauer), kanin er relativt billig å kjøpe hus og de er enklere å avle og håndtere. Bestemt vaskulær sykdom modeller i kaniner hver har sine egne fordeler og svakheter som modeller for menneskelig sykdom som er utenfor omfanget av dette manuskriptet^8,12,18. En etterforsker bør se disse fordeler og mangler å avgjøre hvis kaninen er den beste modellen for å svare på et bestemt eksperimentelle spørsmål.

Innføring av deoksyribonukleinsyre (DNA) regulatoriske sekvenser i endotelceller i vivo gjør det mulig for undersøkelse av aktiviteten til disse sekvensene i komplekse fysiologiske omgivelser. In vitro studier i transfekterte endotelceller kan være nyttig for den innledende vurderingen av regulatoriske DNA-sekvenser; men er uttrykket nivåer i vev kultur modeller noen ganger ikke reprodusert når studiene er gjentatt i vivo^5,19,20. In vitro systemer kan også være nyttig for å utforske grunnleggende veiene av protein signalering og endothelial fysiologi samt kommunikasjon mellom kulturperler vaskulære celler. men er mer kompliserte gangstier eller regulatoriske nettverk som er påvirket av komplekse bestander av nærliggende vaskulære celler eller immunsystemet best studerte i en i vivo systemet^6,20. Metoden beskrevet her gir en plattform for å utforske regulering av transgene uttrykk i endotelet innen rammen av et intakt fartøy, med eller uten sykdom. I vivo systemet tillater også undersøkelse av fysiologiske og patologiske mobilnettet crosstalk og identifisering av bidrag av immunsystemet til regulering av gene expression⁶.

Bakterie-line transgenesis (spesielt i mus) er en alternativ tilnærming for regissere transgene uttrykk til endotelceller. Denne tilnærmingen kan gi livslang transgene uttrykk, endothelial målretting formidlet av bestemte arrangøren eller regulatoriske regioner^21,22. Men generasjonen av transgene mus er tidkrevende og kostbar, flere transgene linjer ofte må testes for å sikre målretting av transgene til ønsket celle type og prestasjon av tilstrekkelig transgene uttrykk nivåer, og eksperimentelle resultatene i murine systemer kan være press-avhengige. Murine transgene modeller med endotelial målrettede effekter av transgener har mange fordeler: det er ikke nødvendig å utføre kirurgi på hver eksperimentelle dyr for å oppnå transgenesis, eksperimentelle mus kan bred med mange andre tilgjengelige transgene mus i for å teste genetiske og fenotypiske interaksjoner, og det er et bredt utvalg av antistoffer som reagerer med murine proteiner, tilrettelegge karakteristikk av fenotyper. Men målretting av effekter av transgener til endotelet via bakterie linjen vanligvis resulterer i transgene uttrykk gjennom blodkar,²² gjør det vanskelig å finne ut hvilket område som transgene produktet fungerer. Dette gjelder særlig når transgene produktet utskilles, fordi et transgene produkt utskilles av endotelceller gjennom er blodkar kunne ha biological aktivitet på en rekke områder innenfor et dyr. Selv om metoden beskrevet i dette manuskriptet krever teknisk ekspertise og spesialiserte anlegg, kan det være mindre tidkrevende og billigere enn utvikle en endothelial-spesifikke transgene musen linje. Det tillater for vurdering av funksjonen av et protein selektivt i endotelceller av et segment i store arterien, og det tillater bruk av kontralateral carotis communis som en tilkoblet (eliminere systemiske faktorer som kan variere fra experimental dyr-for eksempel blodtrykk eller kolesterol nivåer-som ukontrollert variabler).

Genterapi er en lovende metode for behandling av vaskulær sykdom, spesielt kroniske sykdommer, fordi en enkelt applikasjon kan gi vedvarende eller muligens livslang uttrykk for en terapeutisk genet²³. Terapeutiske løftet av genterapi har blitt utforsket i dyr modeller av somatiske genoverføring, ofte målretting leveren^24,25, som er en relativt lett mål fordi mange blodbårne virus vektorer er hepatotropic. Men for å ha en effekt på vaskulær sykdom, må genterapi rettet mot leveren oppnå systemisk overuttrykte proteiner. Dette krever vanligvis store doser av vektor, som kan være giftig eller med dødelig²⁶. Videre økt systemisk nivåer av lønnsforhøyelse protein risikoen for off-målet bivirkninger, som kan komplisere eller selv skjule tolkning av eksperimentelle resultater. Lokale genterapi målretting vaskulære endotelet som beskrevet i dette manuskriptet kunne unngå systemisk bivirkninger fordi infundert vektoren ikke er allment spres utover transduced arteriell segmentet, og lokale vaskulær effekter kan oppnås uten endringer i systemisk Plasmanivåer av protein. ²⁷ i tillegg en langt lavere mengde vektor er nødvendig å transduce en arteriell segmentet enn nødvendig å oppnå robust hepatic signaltransduksjon. Transgene uttrykk fra leveren har blitt rapportert å avta over tid, trolig på grunn av celle omsetning, krever gjentatte dosering hvis høyt nivå transgene uttrykket er opprettholdt. ²⁸ derimot den lave omløpshastighet av endotelet gir stabil uttrykk for minst 48 uker i chow-matet kaniner og minst 24 uker i aterosklerotisk lesjoner av kolesterol-matet kaniner. ^{1 , 27}

For å fastslå om denne metoden for genoverføring til kaninen felles carotis endotelet er hensiktsmessig, bør fordeler og ulemper (tabell 1) vurderes i sammenheng med de spesifikke forskning mål. Fordeler ved denne metoden inkluderer: outbred kanin er bedre representant for menneskelig genetisk mangfold enn er innavlet mus (viktig for prekliniske arbeid); kaniner gi større fartøy for lettere manipulasjon og flere vev for analyse; metoden kan oppnå endotelet målrettede transgene uttrykk langt raskere enn bakterie-line endothelial målretting i transgene mus; Vector-dose kan enkelt justeres til modell variabel nivåer av transgene uttrykk. prosessene gjelder for store-arterie endotelet kan undersøkes; og lokale vaskulær transgenesis lar motsatt carotis i samme dyret som en kontroll, eliminere systemiske faktorer som ukontrollert variabler. Ulemper inkludere: spesielle fasiliteter og kompetanse er nødvendig; færre genmodifiserte bakgrunn på å eksperimentere finnes i kanin enn i mus; og det er en mindre omfattende utvalg av antistoffer mot kanin versus musen proteiner (for immunodetection av transgene protein og andre antigener som kan være viktige i å tolke eksperimentelle resultater).

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her ble godkjent av University of Washington Office of Animal Welfare og tilknyttede institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC), og ble avsluttet i samsvar og overholdelse av alle relevante regulatoriske og institusjonelle retningslinjer. Merk: Genoverføring til kaninen felles carotis arteriene utføres på kanin av en kirurg ved hjelp av en anestesilegen eller assistent. 1. genoverføring til kaninen felles carotis arteriene: før operasjon Bedøve kanin…

Representative Results

For å implementere denne metoden med tillit, er foreløpig eksperimenter nødvendig for å etablere at operatøren oppnår effektiv og reproduserbar genoverføring, transgene uttrykk i luminal endotelceller. I vår erfaring vurderes dette lettest ved hjelp av en vektor som uttrykker β-galactosidase. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) flekker av felles carotis segmenter fjernet 3 dager etter vektor infusjon, samt måling av β-galactosidase mRNA (messenger RNA) med…

Discussion

Visse aspekter av kirurgisk teknikk fortjener spesiell oppmerksomhet. Full eksponering og mobilisering av carotis communis via forsiktig disseksjon vil lette genet overføring og arteriotomy reparere. Men under dissection, bør direkte manipulering av arteria carotis minimaliseres for å unngå vasospasme. I tillegg blødninger tilstøtende til arterien bør stoppes ved å bruke lett trykk med gasbind og extravasated blod skal ryddes opp umiddelbart ved å rense området med vanlig saltvann. Det er også viktig å unngå…

Materials

Disposables
3mL syringe with 24G needle	Becton Dickinson	309571	2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery
1mL syringe with 27G needle	Becton Dickinson	309623	6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery
20mL syringe, luer lock	Nipro Medical Corp	JD+20L
Catheters, 24G x 3/4"	Terumo Medical Products	SROX2419V
19G needle	Becton Dickinson	305187	Gene transfer surgery only
21G needle	Becton Dickinson	305165	For 20 mL syringe of saline
Gauze 4" x 4"	Dynarex	3242	~10-15 per surgery
3-0 silk suture	Covidien Ltd.	S-244
5-0 silk suture	Covidien Ltd.	S-182	Gene transfer surgery only
7-0 polypropylene suture	CP Medical	8648P	Gene transfer surgery only
5-0 polyglycolic acid suture	CP Medical	421A	Gene transfer surgery only
3-0 polyglycolic acid suture	CP Medical	398A	Gene transfer surgery only
Alcohol swabs	Covidien Ltd.	6818	For placement of I.V. line
Catheter plug	Vetoquinol	411498	Gene transfer surgery only
Ketamine HCl, 100 mg/mL	Vedco Inc.	05098916106
Xylazine, 100 mg/mL	Akorn Inc.	4821
Lidocaine HCl, 2%	Pfizer	00409427702
Bupivacaine HCl, 0.5%	Pfizer	00409161050
Beuthanasia D-Special	Intervet Inc.	NDC 00061047305	Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL	Patterson Veterinary	12496075705	Gene transfer surgery only
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride	Baxter	2B1309	2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one
Heparin  (5000 U/mL)	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-047-10	Gene transfer surgery only
Fentanyl patch, 25 mcg/hr	Apotex Corp.	NDC 60505-7006-2	Gene transfer surgery only
Isoflurane	Multiple vendors	Catalog number not available
Gene transfer vector			Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straight	Roboz	RS-7900	Gene transfer surgery only
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt	Roboz	RS-6828
Needle holder /w suture scissors	Miltex	8-14-IMC	Gene transfer surgery only
Castroviejo scissors	Roboz	RS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock	Roboz	RS-6412	Gene transfer surgery only
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt	Roboz	RS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs	Roboz	RS-6514	2x
Backhaus towel clamp 3.5"	Roboz		4x
Micro clip setting forceps 4.75"	Roboz	RS-6496	Gene transfer surgery only
Micro vascular clips, 11 mm	Roboz		2x for gene transfer surgery only
Surg-I-Loop	Scanlan International	1001-81M	5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width	Roboz	RS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm	Roboz	RS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip	Roboz	RS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3mm tips	Roboz	RS-7110	2x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tips	Roboz	RS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips	Roboz	RS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips	Roboz	RS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width	Roboz	RS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width	Fine Science Tools	11092-12	2x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight	Fine Science Tools	11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode	MACAN Manufacturing	HPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pump	Multiple vendors	Catalog number not available
Forced air warming unit	3M	Bair Hugger Model 505	Gene transfer surgery only
IV infusion pump	Heska	Vet IV 2.2	Gene transfer surgery only
Isoflurane vaporizer and scavenger	Multiple vendors	Catalog number not available
Veterinary multi-parameter monitor	Surgivet	Surgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unit	MACAN Manufacturing	MV-9
Surgical microscope	D.F. Vasconcellos	M900	Needs ~16x magnification