Этот метод является введение трансген в эндотелия кролик сонных артерий. Внедрение системы трансген позволяет оценки биологической роли трансген продукта либо в нормальных артерий или модели заболеванием. Этот метод также полезен для измерения активности регулирования последовательностей ДНК.
Цель этого метода-ознакомить трансген в эндотелия изолированных сегментов как кролик общих сонных артерий. Этот метод достигает фокуса эндотелия селективные трансгенез, тем самым позволяя следователя для определения биологической роли эндотелиальной выразил трансгенов и количественно оценить действие в естественных условиях транскрипционный анализ последовательностей ДНК в большой артерии эндотелиальные клетки. Данный метод использует хирургические изоляции кролик общей сонной артерии и arteriotomy доставить трансген выражая вирусный вектор в артериальной люмен. Короткий инкубационный период вектора в просвете, с последующей аспирацией содержимого люмен, достаточным для достижения эффективного и прочного выражение трансген в эндотелии, без обнаружению трансдукция или выражение вне изолированные артериального сегмента. Метод позволяет оценки биологической деятельности трансген продуктов как в нормальных артериях, так и в модели сосудистых заболеваний человека, избегая системные эффекты, которые могут быть вызваны либо путем направленной доставки генов на другие сайты (например. печени) или альтернативный подход доставки генетической конструкции эндотелия трансгенез зародышевой линии. Применение метода ограничена потребность квалифицированный хирург и анестезиолог, хорошо оборудованной операционной комнате, затраты на приобретение и жилья кроликов и необходимости для экспертизы в перенос генов вектор строительства и эксплуатации. Результаты, полученные с помощью этого метода включают: трансген связанных изменений в артериальной структуры, клеточности, внеклеточная матрица или вазомоторный функции; увеличение или сокращение в артериальной воспаления; изменения в апоптоз клеток сосудов; и прогрессии, замедление или регрессии таких заболеваний, как гиперплазия интимы или атеросклероза. Этот метод также позволяет измерять родной и синтетических регулирования последовательностей ДНК возможность изменять трансген выражение в эндотелиальных клетках, обеспечивая результаты, которые включают в себя: уровни трансген мРНК, уровни белка трансген и уровни трансген Ферментативная активность.
Цель этого метода-ознакомить трансген в эндотелия кролик общих сонных артерий. Введение трансген позволяет оценки биологической роли трансген продукта в нормальной артерий и кролик модели человеческих заболеваний артерий. Сверхэкспрессия трансген в модели заболеванием может выявить ли трансген (и белковый продукт) обещают как терапевтические1,,,234. Включение регулирования элементов СНГ-Исполняющий обязанности в кассету трансген выражение позволяет оценки деятельности этих элементов в артериальной эндотелия в vivo5,6. Знания о деятельности конкретных СНГ действующих нормативных элементов может использоваться для разработки более активных выражение кассеты и зонд механизмы регуляции генов в большой артерии эндотелия в vivo7.
Кролики являются ценным модель для различных аспектов человеческого сосудистой физиологии и болезни. Кролики имеют много сосудистых черты с людьми. Например гематологические значения базовых, кровоостанавливающие регулирование и сосудистой продольное напряжение похожи между8кроликов и людей. Кролик модели сосудистых заболеваний повторить ключевые особенности многих заболеваний человека, в том числе: аневризм (аналогичных геометрических и характеристики потока)9, спазм сосудов (аналогичный ответ Эндоваскулярное лечение)10,11, и атеросклероз (интимы таблички с аналогичными функциями, включая основные богатые липидов, макрофаги и гладкомышечные клетки в волокнистых шапку)12,13. Соответственно, были разработаны модели кролика для многих сосудистых заболеваний, таких как тромбоз, спазм сосудов, аневризмы, диабет, стеноз сосудистого трансплантата и атеросклероз8,13,14, 15,16.
Для исследователей, выбирая среди животных моделей сосудистой физиологии и болезней кролик имеет несколько преимуществ. По сравнению с грызунами, более крупных судов кроликов позволяют легче хирургические манипуляции, использование устройства Эндоваскулярная и большее количество ткани для количественных измерений. Кролики являются гораздо ближе филогенетически приматов чем грызунов17, и больше генетического разнообразия беспородных кроликов лучше приближается генетическая изменчивость людей. Генетическое разнообразие особенно важна для доклинических исследований, который-по их природа цель разработать методы лечения, которые могут быть применены к генетически разнообразны человеческой популяции. Как с, многие, если не все другие модели видов генов кролика легко клонировать или синтезированных потому что кролика геном были упорядочены с высоким охватом (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. По сравнению с других крупных животных моделей (например, собак, свиней и овец), кролики являются сравнительно недорого купить и дома и они легче породы и обрабатывать. Конкретные заболевания сосудов модели в кроликов каждый имеют свои преимущества и недостатки как модели болезней человека, которые выходят за рамки этой рукописи8,12,18. Следователь должен рассмотреть эти преимущества и недостатки, чтобы определить, если кролик является наилучшей моделью для ответа на конкретный вопрос экспериментальной.
Введение регулирования последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в эндотелиальных клеток в естественных условиях позволяет расследование деятельности этих последовательностей в сложных физиологических условиях. В vitro исследования в transfected эндотелиальных клеток может быть полезным для первоначальной оценки регулирования последовательностей ДНК; Однако уровни выражения в культуре ткани модели иногда не воспроизводятся когда исследования являются неоднократные в vivo5,19,20. В vitro системы также может быть полезным для изучения основных пути белка сигнализации и эндотелиальных физиологии, а также связь между искусственный сосудистый клетки; Однако более сложные пути или регулирования сети, которые находятся под влиянием комплекса населения соседних клеток сосудистой или иммунной системы наилучшим учился в в естественных условиях системы6,20. Метод, описанный здесь обеспечивает платформу для изучения регуляции трансген выражения в эндотелия в контексте нетронутыми судна, с или без болезни. В естественных условиях система также позволяет исследование физиологических и патологических сотовой перекрестных помех и идентификации взносов иммунной системы в регуляции генов выражение6.
Трансгенез зародышевой линии (особенно в мышах) является альтернативный подход для направления трансген выражение эндотелиальных клеток. Этот подход может обеспечить выражение пожизненный трансген, с эндотелиальной ориентации при посредничестве конкретной промоутера или регулирования регионах21,22. Однако поколение трансгенных мышей является длительным и дорогостоящим, несколько трансгенных линий должны испытываться часто обеспечить целенаправленное использование трансген для нужной ячейки типа и достижения адекватного трансген выражение уровня и экспериментальные результаты в мышиных системы могут зависеть от деформации. Мышиных transgenic моделей с таргетингом на эндотелиальных трансгенов имеют много преимущества: нет необходимости для выполнения операции на всех экспериментальных животных с целью достижения трансгенез, экспериментальный мышей может разводили множество других доступных трансгенных мышей в для тестирования взаимодействий генетических и фенотипические, и существует широкий выбор антител, которые реагируют с мышиных белки, облегчения характеризации фенотипов. Однако ориентация трансгенов эндотелия через зародышевой линии обычно приводит к трансген выражение во всем сосудистую,22 , что делает его трудно определить сайт, на котором действует трансген продукт. Это особенно верно, когда выделяется трансген продукт, потому что продукт трансген, выделяемый эндотелиальных клеток на протяжении сосудистую может иметь биологической активности в любое количество сайтов в пределах животного. Хотя метод, описанный в этой рукописи требует технического опыта и специализированных объектов, это может быть менее затратным по времени и менее дорогостоящим, чем развивающиеся эндотелиальных конкретных трансгенные мыши линии. Это позволяет для оценки функции белка выборочно в эндотелиальных клетках сегмента крупные артерии, и она разрешает использование контралатеральной общей сонной артерии как элемент парных (устранении системных факторов, которые могут различаться между экспериментальной животные-например, кровяного давления и холестерина-как неконтролируемых переменных).
Генная терапия является перспективным подходом для лечения сосудистых заболеваний, особенно хронических заболеваний, потому что одно приложение может обеспечить устойчивый или возможно пожизненный выражение терапевтических генов23. Терапевтические обещания генной терапии была изучена в животных моделях переноса генов соматических, часто ориентации печени24,25, которая является сравнительно легкой мишенью, потому что многие кровь вирусных векторов гепатотропная. Однако чтобы иметь влияние на заболевания сосудов, генная терапия, ориентированные на печень должны добиться системных гиперэкспрессия белка. Это обычно требует больших доз вектора, которые могут быть токсичными или даже фатальным26. Кроме того увеличение системного уровня белка повышение риска пробить побочных эффектов, которые могли бы осложнить или даже скрыть интерпретации экспериментальных результатов. Местные генной терапии, ориентация эндотелия, как описано в этой рукописи может избежать системных побочных эффектов, потому что заваренного вектор широко не распространены за пределами transduced артериального сегмента, и местных сосудистых эффектов может быть достигнуто без изменения в системные плазменного уровня белка. 27 Кроме того, гораздо меньшее количество векторных требуется передавать артериального сегмента, чем это необходимо для достижения надежной печеночная трансдукции. Трансген выражение из печени сообщалось снижаться со временем, вероятно, объясняется ячейки оборот, требующих повторные дозировки, если выражение высокого уровня трансген должна поддерживаться. 28 в отличие от низкой текучести эндотелия обеспечивает стабильные выражение для по крайней мере 48 недель в Чоу кормить кроликов и по крайней мере 24 недель в атеросклеротических поражений холестерина кормить кроликов. 1 , 27
Чтобы определить, если этот метод переноса генов для общих сонных эндотелия кролик подходит, преимущества и недостатки (Таблица 1) должны рассматриваться в контексте конкретных научно-исследовательских целей. Преимущества этого метода включают: беспородных кролики являются лучше представитель человеческого генетического разнообразия, чем инбредных мышей (важно для доклинических работы); Кролики обеспечивают более крупных судов для простоты обработки и больше ткани для анализа; Этот метод можно добиться эндотелий целевой трансген выражение гораздо быстрее, чем зародыш линии эндотелиальной ориентации у трансгенных мышей; вектор доза может быть легко приспособлено для переменной уровни модели трансген выражения; могут быть исследованы процессы, характерные для крупных артерий эндотелия; и местных сосудистых трансгенез позволяет противоположной сонной артерии в же животное, чтобы использоваться в качестве элемента управления, в устранении системных факторов, как неконтролируемая переменные. Недостатки включают: требуются специальные средства и опыта; меньшее количество генетически модифицированных стола на которые экспериментировать доступны в кроликов, чем у мышей; и есть менее обширный выбор антител к кролика против белков мыши (для immunodetection трансген белок и другие антигены, которые могут иметь важное значение в интерпретации экспериментальных результатов).
Некоторые аспекты хирургической техники заслуживают особого внимания. Полное воздействие и мобилизацию общей сонной артерии через тщательное вскрытие будет облегчить ремонт передачи и arteriotomy гена. Однако во время вскрытия, прямого манипулирования сонной артерии должны быть минимизи…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим AdVec, Inc. для получения разрешения на использование реагентов HDAd, Юлия фейк для административной помощи и сравнительных медицины ветеринарные услуги для хирургического советы и поддержку. Эта работа была поддержана HL114541 и л. Джон Локк, младший благотворительный фонд.
Disposables | |||
3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
Surgical Instruments | |||
Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
Surgical Suite Equipment | |||
Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |