Denna metod är att införa en transgen i endotel kanin halspulsåder. Införandet av transgenens tillåter bedömning av transgenens produkten antingen i normala artärer eller sjukdomsmodeller biologiska roll. Metoden är också användbar för att mäta aktiviteten av regulatoriska DNA-sekvenser.
Målet med denna metod är att införa en transgen i endotel isolerade segment av både kanin gemensamma halspulsåder. Metoden uppnår fokal endothelial-selektiv genmodifiering, vilket innebär att en utredare att bestämma de biologiska rollerna av endothelial-uttryckta transgener och kvantifiera invivo transkriptionell aktiviteten av DNA-sekvenser i stora artär endotelceller. Metoden använder kirurgiska isolering av kanin gemensamma halspulsåder och en arteriotomin för att leverera en transgenens-uttryckande viral vektor i arteriell lumen. En kort inkubationstid av vektorn i lumen, med efterföljande aspiration av lumen innehållet, är tillräckligt för att uppnå effektiv och slitstark uttryck för transgenens i endotel, utan påvisbara transduktion eller uttryck utanför de isolerade arteriell segment. Metoden tillåter bedömning av transgenens produkter biologiska verksamhet både i normala artärer och i modeller av human vaskulär sjukdom, samtidigt undvika systemiska effekter som kan orsakas antingen av inriktning gen leverans till andra webbplatser (t.ex. levern) eller av den alternativa metoden för att leverera genetiska konstruktioner till endotelet av germ line genmodifiering. Tillämpningen av metoden begränsas av behovet av en skicklig kirurg och narkosläkare, ett välutrustat operationssalen, kostnaderna för inköp och bostäder kaniner, och behovet av expertis i genöverföring vektorn konstruktion och användning. Resultat som erhålls med denna metod inkluderar: transgenens-relaterade förändringar i arteriell struktur, cellularitet, extracellulär matrix eller vasomotoriska funktion; ökning eller minskning av arteriell inflammation; förändringar i vaskulära cell apoptos; och progression, utvecklingsstörning eller regression av sjukdomar som intimans hyperplasi eller åderförkalkning. Metoden kan också mätning av infödda och syntetiska regulatoriska DNA-sekvenser förmåga att förändra transgenens uttryck i endotelceller, som ger resultat som innehåller: nivåer av transgenens mRNA, nivåer av transgenens protein och nivåer av transgen enzymaktivitet.
Målet med denna metod är att införa en transgen i endotel kanin gemensamma halspulsåder. Införandet av transgenens tillåter bedömning av produktens transgenens biologiska roll såväl i normala artärer kanin modeller av mänsklig arteriell sjukdom. Överuttryck av transgenens i sjukdomsmodeller kan avslöja om transgenens (och dess proteinprodukt) visar löfte som terapeutiska medel1,2,3,4. Införandet av cis verkande reglerande element i transgenens uttryck kassett gör bedömning av aktiviteten av dessa element i arteriell endotel i vivo5,6. Kunskap av aktiviteten hos särskilda cis verkande reglerande faktorer kan användas för att utforma mer aktiva uttryck kassetter och sond mekanismer för genreglering i stora artär endotel i vivo7.
Kaniner är en värdefull modell för olika aspekter av människans vaskulär fysiologi och sjukdom. Kaniner har många gemensamma vaskulär funktioner med människor. Till exempel är hematologiska utgångsvärden, hemostatiska förordning och vaskulär längsgående spänning liknande mellan kaniner och människor8. Kanin modeller av vaskulära sjukdomar replikera nyckelfunktioner till många sjukdomar inklusive: aneurysm (liknande geometriska och flödesegenskaper)9, vasospasm (liknande svar på endovaskulär behandling)10,11, och åderförkalkning (intimans plack med liknande funktioner inklusive en kärna som är rik på lipider, makrofager och smidig muskel cellerna i en fibrös cap)12,13. Följaktligen kanin modeller har utvecklats för många vaskulära sjukdomar såsom trombos, vasospasm, aneurysm, diabetes, vaskulär transplantat stenos och åderförkalkning8,13,14, 15,16.
För forskare att välja bland djurmodeller av vaskulär fysiologi och sjukdom, har kaninen flera fördelar. De större fartygen av kaniner jämfört med gnagare, och kan lättare kirurgisk manipulation, användning av utrustning för transluminal och en större mängd vävnad för kvantitativa mätningar. Kaniner är mycket närmare fylogenetiskt primater än gnagare17, och den största genetiska mångfalden av utkonkurrerat dö ut kaniner bättre approximerar den genetiska variabilityen av människor. Genetisk mångfald är särskilt viktigt för prekliniska studier, som-genom sin natur-målet att utveckla terapier som kan tillämpas på den genetiskt olika mänskliga befolkningen. Som med många om inte alla andra modell arter, kanin gener är enkelt klonade eller syntetiseras eftersom kanin genomet har varit sekvenseras med hög täckning (7,48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Jämfört med andra stora djurmodeller (t.ex. hundar, grisar eller får), kaniner är relativt billiga att köpa och hus och de är lättare att föda upp och hantera. Specifika kärlsjukdom modeller i kaniner varje har sina egna fördelar och brister som modeller för humana sjukdomar som ligger utanför tillämpningsområdet för detta manuskript8,12,18. En utredare bör granska dessa fördelar och brister att avgöra om kaninen är den bästa modellen för att besvara en specifik experimentella fråga.
Införandet av deoxiribonukleinsyra (DNA) reglerande sekvenser i endotelceller i vivo möjliggör undersökning av aktiviteten av dessa sekvenser i en komplex fysiologisk miljö. In vitro -studier med transfekterade endothelial celler kan vara användbar för den första bedömningen av regulatoriska DNA-sekvenser; dock återges uttrycksnivåerna i vävnadsodling modeller ibland inte när studierna är upprepade i vivo5,19,20. In vitro -system kan också vara användbart för att utforska grundläggande vägar av protein signalering och endotel fysiologi samt kommunikation mellan odlade vaskulära celler; dock studeras mer komplexa vägar eller regleringsnät som påverkas av komplexa populationer av angränsande vaskulära celler eller immunsystemet bäst i en in vivo system6,20. Den metod som beskrivs häri ger en plattform för att utforska reglering av transgenens uttryck i endotel inom kontexten av en intakt fartyg, med eller utan sjukdom. I vivo systemet möjliggör också undersökning av fysiologiska och patologiska cellulära överhörning och identifiering av bidrag av immunförsvaret att regleringen av gen uttryck6.
Grodden-line genmodifiering (särskilt i möss) är en alternativ metod för att styra transgenens uttryck till endotelceller. Detta tillvägagångssätt kan ge livslånga transgenens uttryck, endothelial inriktning medieras av specifika promotorn eller regulatoriska regioner21,22. Generering av transgena möss är tidskrävande och dyra dock, flera transgena linjerna måste testas ofta så målinriktning av transgenens till önskad celltyp och uppfyllandet av adekvat transgenens uttryck nivåer, och experimentella resultat i murina system kan vara stam-beroende. Murina transgena modeller med endothelial riktade transgener har många fördelar: det finns ingen anledning att operera på varje experimentella djur för att uppnå genmodifiering, experimentell möss kan uppvuxna med många andra tillgängliga transgena möss i för att testa genetiska och fenotypiska interaktioner, och det finns ett brett urval av antikroppar som reagerar med murina proteiner, underlätta karaktärisering av fenotyper. Dock inriktning av transgener till endotelet via könsceller vanligen resulterar i transgenens uttryck i hela kärlsystemet,22 vilket gör det svårt att avgöra den plats där transgenens produkt agerar. Detta är särskilt sant när transgenens produkten utsöndras, eftersom en transgenens produkt utsöndras av endotelceller i hela vaskulatur kunde ha biologisk aktivitet på valfritt antal platser inom ett djur. Även om den metod som beskrivs i detta manuskript kräver teknisk expertis och specialiserade anläggningar, kan det vara mindre tidskrävande och mindre kostsamt än att utveckla en endothelial-specifika transgena möss linje. Det tillåter för bedömning av funktionen hos ett protein selektivt i endotelceller i ett segment av stora artär, och den tillåter användning av den kontralaterala gemensamma halspulsådern som Parade kontroll (eliminera systematiska faktorer som kan variera bland experimental djur-exempelvis blodtryck eller kolesterolnivåer-som okontrollerad variabler).
Genterapi är en lovande strategi för behandling av vaskulära sjukdomar, särskilt kroniska sjukdomar, eftersom en enda ansökan kan ge ihållande eller möjligen livslångt uttryck för en terapeutisk gen23. Terapeutiska löftet om genterapi har undersökts i djurmodeller av somatiska genöverföring, ofta inriktning lever24,25, vilket är ett relativt enkelt mål eftersom många blodburna virala vektorer är hepatotropic. Men för att ha en effekt på vaskulär sjukdom, måste genterapi riktade till levern uppnå systemiska överuttryck av proteiner. Detta kräver vanligtvis stora doser av vektor, som kan vara giftiga eller jämn dödlig26. Dessutom ökade systemiska nivåer av ett protein höjer risken för off-target biverkningar, vilket kan komplicera eller ens dölja tolkning av experimentella resultat. Lokala genterapi inriktning vaskulära endotel som beskrivs i detta manuskript kunde undvika systemiska biverkningar eftersom infunderas vektorn inte är spridning bortom det transduced arteriell segmentet, och lokala vaskulära effekter kan uppnås utan förändringar i systemisk plasmanivåer av protein. 27 dessutom en betydligt lägre mängd vektor som behövs för att transduce en arteriell segment än som behövs för att uppnå robust nedsatt transduktion. Transgenens uttryck från levern har rapporterats minska över tid, förmodligen på grund av cellens omsättning, som kräver upprepad dosering om hög nivå transgenens uttryck är att bibehållas. 28 däremot den låg Omsättningshastigheten på endotelet ger stabilt uttryck för minst 48 veckor i chow-matade kaniner och i minst 24 veckor i aterosklerotiska lesioner av kolesterol-matade kaniner. 1 , 27
För att avgöra om denna metod för genöverföring till kanin gemensamma halspulsådern endotelet är lämpliga, övervägas fördelar och nackdelar (tabell 1) inom ramen för de särskilda forskning mål. Fördelarna med denna metod är: utkonkurrerat dö ut kaniner är bättre företrädare för mänskliga genetiska mångfalden än inavlade möss (viktigt för prekliniska arbete); kaniner ge större fartyg för lättare manipulation och mer vävnad för analys. metoden kan uppnå endotel-riktade transgenens uttryck långt snabbare än gör groddar-line endothelial inriktning på transgena möss; Vector dos kan enkelt justeras till modell variabla nivåer av transgenens uttryck. processer som är specifika för stora-artär endotelet kan utredas. och lokala vaskulär genmodifiering gör motsatt halspulsådern på samma djur som ska användas som en kontroll, eliminera systematiska faktorer som okontrollerad variabler. Nackdelarna inkluderar: särskilda anläggningar och expertkunskaper krävs; färre genetiskt modifierade bakgrunder att experimentera på finns i kaniner än i möss; och det finns en mindre omfattande urval av antikroppar mot kanin kontra musproteiner (för immunodetection av transgenens protein och andra antigener som kan vara viktiga i tolkningen av experimentella resultat).
Vissa aspekter av operationsteknik förtjänar särskild uppmärksamhet. Full exponering och mobilisering av den gemensamma halspulsådern via noggrann dissektion kommer underlätta gen överföring och arteriotomin reparation. Dock under dissektion, ska direkt manipulation av halspulsådern minimeras för att förhindra vasospasm. Dessutom någon blödning intill artären avbrytas av lätt tryck med en kompress och extravasering blod ska rensas omedelbart genom att skölja området med fysiologisk koksaltlösning. Det ?…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar AdVec, Inc. för tillstånd att använda HDAd reagens, Julia Feyk för administrativt stöd och Institutionen för Komparativ medicin veterinärmyndigheterna för kirurgiska råd och stöd. Detta arbete stöds av HL114541 och John L. Locke, Jr. Charitable Trust.
Disposables | |||
3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
Surgical Instruments | |||
Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
Surgical Suite Equipment | |||
Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |