Laboratoriet boliger af turkis killifish kan skaleres op til huset og effektivt øge tusindvis af individuelle fisk i en centraliseret vand filtreringssystem, anvender den samme infrastruktur, der anvendes til standard zebrafisk faciliteter. Vi detalje her en liste over standardiserede procedurer, der giver effektiv killifish vedligeholdelse.
Udviklingen af opdrætsmetoderne i ikke-model laboratorium fisk, der anvendes til forsøgsformål høj grad har nydt godt af etableringen af reference fisk modelsystemer, såsom zebrafisk og medaka. I de seneste år, er blevet vedtaget en nye fisk – den turkis killifish (Nothobranchius furzeri) – af en voksende række forskergrupper inden for biologi af aldring og økologi. Med en fangenskab levetid på 4-8 måneder, denne art er den yngstlevende hvirveldyr rejst i fangenskab og giver mulighed for det videnskabelige samfund til test – på kort tid – eksperimenterende indgreb, der kan føre til ændringer af den aldrende sats og levetid. I betragtning af denne art, kendetegnet ved embryonale diapause unikke biologi, markeret eksplosive seksuelle modning, morfologiske og adfærdsmæssige seksuelle dimorphism- og deres forholdsvis korte voksen levetid – ad hoc- dyrehold praksis er i akut efterspørgsel. Denne protokol rapporterer en række centrale dyrehold foranstaltninger, der giver mulighed optimal turkis killifish laboratorium pleje, gør det muligt for det videnskabelige samfund til at vedtage denne art som en kraftfuld laboratorium dyremodel.
I betragtning af deres korte levetid og hurtige livscyklus, vokser turkis killifish hurtigt som en lovende nye model organisme i biologi1,2,3. Denne art kendetegnes ved en unik livscyklus for en teleost, bestående af embryonale diapause, hurtig seksuel modning og en udvidet post-reproductive liv fase4,5. Seneste arbejde har bidraget til at belyse biologi af denne art, såvel i fangenskab i vilde6,7. Turkis killifish live i årstidens friske vand organer at form i løbet af regntiden i den afrikanske savanne i Zimbabwe og Mozambique. I den tørre sæson overleve embryoner i den tørre mudder i mangel af vand i kraft af en stress-resistente livsstadium kaldet diapause.
Genetiske kort for denne art har været genererede8,9, og for nylig deres genom er blevet sekventeret og samlet10,11. Flere indavlede laboratorium fisk stammer er blevet udviklet, og transgenese og genom-redigering via CRISPR/Cas9 er blevet tilgængelige i denne art, de facto fremme turkis killifish som en konkurrencedygtig laboratorium hvirveldyr model organisme 12,13,14.
Selv om en laboratorium protokol er allerede blevet offentliggjort for denne art15, i denne protokol, vi udvikler en omfattende liste over forsøgslaboratorium retningslinjer, der er specifikt rettet mod undersøgelser, at undersøger aldring og overlevelse. Denne protokol giver mulighed for forskere allerede bekendt med zebrafisk og medaka dyrehold at blive velbevandret i turkis killifish dyrehold ved at vedtage et minimum antal centrale justeringer. På samme tid giver denne protokol forskere uden forudgående erfaring i fisk dyrehold med de afgørende værktøjer for at hæve en blomstrende turkis killifish koloni.
Vi beskriver en protokol for laboratoriet dyrkning af turkis killifish, herunder indsamlingsstedet, inkubation, såvel som voksne fisk boliger, avl og fodring. Vores protokol er specifikt målrettet til laboratorier, der udfører forskning fokuseret på voksne fisk, især til eksperimentelle undersøgelser af befolkningens aldring og levetid. Turkis killifish kan hæves på en standard zebrafisk facilitet; vigtige aspekter af killifish dyrehold varierer dog fra standard zebrafisk pleje16. Disse tilpasninger omfatter tidlige overgangen fra en artemia eneste kost til en kost suppleret med protein-rige blod orm, samt konkrete skridt i embryo inkubation, bestående af en flydende og tør inkubation fase.
Kritiske trin i protokollen omfatter shipping embryoner inden for 8-30 ° C temperaturinterval. Ved avl afhænger frugtbarhed fodring frekvens og fødevarekvalitet; Vi anbefaler derfor, mindst to opfodring en dag pr. avl tank for at øge embryoner udbytte (Se afsnit 5.6.). I løbet af embryo blegning, ikke Udvid embryo inkubation i blegning løsning. Dette kan medføre skader på æg chorion og øget embryo dødelighed. Når inkubere embryoner med methylenblåt, ikke forlænge inkubation af klar-til-lugen embryoner i mere end 2 uger som deres levedygtighed reduceres dramatisk. Til udrugning turkis killifish, lav temperatur af humusfraktionerne syre forbedrer rugeæg og fuldstændig nedsænkning af embryoner i løsningen giver synkroniserede rugeæg. Ikke tilstrækkelig udluftning under inkubation resulterer i høje priser af Forbundsrepublikken Jugoslavien ikke i stand til at udfylde gas blæren (“belly-skyderen” fænotype, se bemærkninger i afsnit 5.1).
Begrænsning af protokollen til avl omfatter brug af sand underlaget som udgør udfordringer for centraliseret vandfiltrering systemer og bør erstattes af alternative metoder i fremtiden. Mulige alternativer kunne være anvendelsen af zebrafisk opdræt tanke. Embryo blegning kan forårsage større fysisk-kemiske ændringer i ægget chorion, der kan medføre ændret chorion fysiologi og rugeæg succes. Konstant eksponering af embryoner til methylenblåt kan fremkalde langsigtede ændringer i voksne fisk fysiologi. At hæve voksne fisk i individuelle tanke for overlevelse kohorteundersøgelser kan påvirke fisk adfærd og sundhed negativt. Gruppe bolig for overlevelse kohorteundersøgelser tilføjer imidlertid betydelig konfunderende faktorer på grund af etablering af sociale dominans og mandlige territorier, fører til strenge sociale hierarkier. Derfor, vi bedømme, isolation af mandlige fisk for overlevelse undersøgelser er et fornuftigt kompromis. Fodring laboratorium killifish kolonier med levende foder fra un-kontrollerede kilder tilføje en risiko for eksterne forureninger fra parasitter og potentielt patogene mikrobielle samfund. I fremtiden bør der udvikles en ad hoc-sterile fiskefoder.
Fremtidige forbedringer af denne protokol vil fokusere på en kontrolleret, ikke-levende kost, der stadig fører til at færdiggøre seksuelle modning inden for 3-4 uger. I Resumé tilbyder vores protokol tilgængelighed til turkis killifish laboratorium dyrkning en bred forskersamfund.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Alessandro Cellerino, Tyrone Genade, Anne Brunet, Sabrina Sharp, Mickie Powell, Simone Keil, Yumi Kim, Patrick Smith, Kai Mathar og alle medlemmer af Valenzano lab på Max Planck Institute for biologi for aldring for at bidrage til forskellige aspekter af den nuværende killifish dyrehold protokollen gennem årene.
Probe calibration buffer solution pH=7.0 | Roth | A518.1 | 1L buffer solution pH=7.0 to calibrate water system pH-electrode |
Probe calibration buffer solution pH=4.0 | Roth | P712.1 | 1L buffer solution pH=4.0 to calibrate water system pH-electrode |
Conductivity standard | VWR | 83607.260 | 500 mL Conductivity standard 1,413 uS/cm to calibrate water system conductivity-electrode |
Easy Strips Test 6in1 | JBL | 2533900 | Test strips for determination chlorine values of system water |
Ammonia Test | JBL | 2536500 | Test to determine ammonia content of system water |
Red Sea Salt | Red Sea | 22 kg bucket | |
Sodium hydrogen carbonate | VWR | 27780.360 | |
Humic acid | Sigma- Aldrich | 53680-50G | |
New HUFA Artemia enrichment | ZM Systems UK | 75g bottle | |
Methylene blue | Roth | AE64.1 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma- Aldrich | 31642-1L | 30% (w/w) |
Cononut fiber | Dragon | ZCS010 | |
Whatman paper | GE healthcare | 3030-690 | |
Ethanol pure | VWR | 20821.467 | 100% |
Silica sand | local pet shop | ||
Artemia Eggs Premium Grade | Sanders | ||
Bloodworm | local distributor | Poseidon Aquakultur Germany | |
dNTPs solution mix | Biolabs | N04472 | 10mM |
Taq DNA polymerase | Invitrogen | 18038-042 | 5U/uL |
PCR 10x Buffer | Invitrogen | 18038-042 | |
MgCl2 | Invitrogen | 18038-042 | 50mM |
NaOH | Sigma- Aldrich | S8045-500g | 50mM |
Tris-HCl, pH=8.0 solution | Sigma- Aldrich | T2694-1L | 1M |
HCl 37% | Sigma- Aldrich | H1758-500mL | |
Aquatic housing system | Aquaneering | Central filtration equipped aquatic system | |
Fish tanks | Aquaneering | volume: 0.8L, 2.8L, 9.5L; equipped with baffles, fry mesh and lids | |
Orbital shaker | VWR | 89032-100 | model 5000 |
Microbiological incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 50125882 | model IMC18; for storage embryos in the liquid phase, set to t=27-28°C |
Cooling Incubator | Binder | 9020-0209 | model KT115; for storage embryos in the solid phase, set to t=27-28°C |
Hatching incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 51028114 | model OGS180; for embryos hatching, set to t=27-28°C |
Stereomicroscope | Leica | model M80 | |
Breeding sand/hatching boxes | Roth | 1598.1 | 1000mL |
Petri dish | Sarstedt | 82.1473 | 92x16mm |
50mL Conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
15mL Conical tube | Sarstedt | 62.554.002 | |
Disposable Plastic Pasteur pipette | Roth | EA71.1 | 2mL; For fish feeding with bloodworms, or embryos selection cut off the tip to open 3-4mm diameter |
Serological pipette | Sarstedt | 86.1689.001 | 50mL |
Syringe | Henke Sass Wolf | 4100-000V0 | 10mL |
Metal strainer | fineness <1mm; for embryos collection | ||
Tweezers | Dumont | 0508-5/45-PO | type5/45; for embryos transfer |
25L Brine shrimps hatcher | Aquaneering | ZHBS25 | main hatcher |
500mL Brine shrimps hatcher | JBL | 6106100 | model Artemio 1; backuo hatcher |
Narrow-mesh fish nets | JBL | ||
Sand beaker | VWR | BURK7102-5000 | 5000mL |
Brine shrimps separation beaker | VWR | BURK7102-2000 | 2000mL |
Plastic zipper bag | Roth | P279.2 | for dead fish storage |
Pipetboy | Integra | 155000 | model Pipetboy acu2 |
Parafilm | P-Lab | P701605 | |
Air tubing | www.zajac.de | AQ380 | 4-6 mm diameter |
1L Glass bottle | VWR | 215-1595 | |
2L Glass bottle | VWR | 215-1596 | |
500mL Squeeze bottle | Roth | K665.1 | for fish feeding with brine shrimps |
120 micron brine shrimps strainer | Florida Aqua Farms | BB-PC2 | for brine shrimps/bloodworm collection |
Finish filter socks | Aquaneering | MFVB025C | 25 micron |
Central filtration fish housing system | Aquaneering, Techniplast, Aquatic Habitats, Aqua Schwarz |