כאן, אנו מציגים פרוטוקול זיהוי, כימות של מולקולות בשפע נמוך פתרונות מורכבים באמצעות מולקולרית החתמה בשילוב ביוסנסור קיבול.
היכולת לזהות quantitate מולקולות בפתרונות מורכבים תמיד היה מאוד מבוקש בתוך מדעי הטבע; בשימוש עבור זיהוי סמנים ביולוגיים, מזהמים, מולקולות אחרות של עניין. טכניקה נפוץ למטרה זו הוא מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay (אליסה), שבו סוג נוגדן אחד לעיתים קרובות מכוונת מולקולה יעד ספציפיות, נוגדן שכותרתו השני משמש לאיתור נוגדן ראשוני, המאפשר כימות מוחלטת של biomolecule במחקר. עם זאת, השימוש של נוגדנים כרכיבים זיהוי מגביל את היציבות של השיטה; כמו גם הצורך של שימוש בתווית מולקולות. כדי להתגבר על מגבלות אלה, הטבעה מולקולרית יושם, ביצירת אתרים מלאכותי זיהוי משלים המולקולה תבנית ולאחר obsoleting את נחיצות באמצעות נוגדנים עבור איגוד הראשונית. עוד יותר, רגישות גבוהה יותר, הנוגדן שכותרתו משני יכול להיות מוחלף על ידי ביולוגיים להסתמך על קיבול עבור כימות של מולקולת המטרה. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לשם במהירות, ללא תווית זיהוי של quantitate מולקולות נמוך-בשפע (חלבונים ווירוסים) בדגימות מורכבים, עם רגישות באופן משמעותי יותר. מערכות הזיהוי בשימוש נפוץ, כגון אליסה. זה כל מתווך על ידי הטבעה מולקולרית בשילוב ביוסנסור קיבוליות.
כימות של מולקולות משמש בתחומים שונים מחקר רבים בתוך המדע, באמצעים כמו רדיו אימונולוגי (RIA) או אליסה1. חלק שיטות אלו דורשות שכותרתו מגיב כמו radioisotope או אנזים הנקרא נוגדן/אנטיגן, מה שהופך אותם מהגידולים ולגזול עם הליכים מורכבים2. עוד יותר, החוסן, סלקטיביות ורגישות של שיטות אלה אינן מספיקות עבור כל ניתוח; בפרט הם לא מספיק כאשר כמויות attogram צריך להיות מנותח, ולא pictogram כמויות3. למטרה זו, ביולוגיים השיגו עניין רב4,5, במיוחד בשילוב עם הטבעה מולקולרית עבור חוסן מוגברת.
הטבעה מולקולרית מסתמך על יצירת חללים על-ידי polymerizing מונומרים פונקציונלי סביב התבנית6, ביצירת אתרים מלאכותי זיהוי הדומים באופן מושלם את תבנית7. טכניקה זו שימש עבור מספר יישומים, כולל מערכות והפרדה אנליטית, אלא גם biorecognition אלמנטים ביולוגיים8,9,10. עם זאת, יש עדיין קשיים בעיצוב של פולימרים הדומיננטיות מולקולרי (מיליוני הוראות בשניה) עבור תבניות macromolecular11,של חלבונים ותאים –12. בגלל זה, חוקרים רבים התמקדו החתמה החלבון תבנית ישירות על גבי מצע, ובכך ליצור משטח תוכר על ידי חלבון המטרה12. טכניקה זו ציפוי פני השטח המשמש עבור העסקת זיהוי חללים עבור מולקולות גדולות וההרכבות כולל חלבונים נקראת החתמה13,14microcontact. ההליך הכללית של השיטה תלויה הפילמור בין משטחים שני – חותמת תבנית, תמיכה פולימר – שעליו התבנית הספוחה על פני15,אחד16, והוא הביא במגע פני השטח שטופלו מונומר. על ידי כך נוצר סרט פולימרי דק על התמיכה באמצעות UV-הפילמור. לבסוף, התבנית מוסר, כשמאחוריו תבנית חללים מסוימים על פני השטח של האלקטרודה הדומיננטיות. בשיטה זו יש כמה יתרונות כולל אובדן פעילות מופחתת של המולקולה הדומיננטיות, כמו גם דרישת גם בכמויות קטנות מאוד של תבנית מולקולות של החתמה לעבד16,17. לפיכך, משטחים אלה חסכונית, יציבה, רגיש, סלקטיבי יכולים להיווצר על משטחים חיישן, מיקוד כל תבנית לבחירה של המשתמש.
זיהוי חלבונים יחיד, הרבה יותר גדול ובמקרו-מולקולות ביולוגיות, כולל וירוסים יכול לשמש את החיישן. קבוצה מסוימת של וירוסים צובר ריבית האחרונות הוא bacteriophage, אשר הוא וירוס שמדביק חיידקים. זיהוי מהיר ורגיש bacteriophages חשוב במהלך ביוטכנולוגי ותהליכים ביולוגיות על מנת לקבוע זיהומים חיידקיים תרבויות עם bacteriophages18. וזמינותו הביולוגית הנפוצות ביותר לגילוי bacteriophage היא שכבה כפולה אגר שיטת19, שהיא מייגעת וצורכת זמן. נעשו מספר נסיונות לפתח הרומן כלי אבחון לאיתור וירוסים (bacteriophages כולל) כגון כוח אטומי (AFM) מיקרוסקופיה20, אינטרפרומטריה21, אלקטרוכימיה22חיישן מערכת23, 24. הרבה עבודה התמקדו ביולוגיים בשל יתרונות כמו להיות קלה לתפעול, רגישה מאוד, מסוגל בזמן אמת מידה15,25. סוג מסוים של ביוסנסור מבוסס על שינויים קיבול. אלה ביולוגיים קיבולי הם החיישנים אלקטרוכימי למדוד שינויים במאפייני מבודד כאשר analyte אינטראקציה עם רכיב biorecognition על פני חיישן, גרימת ירידה קיבול2,4 . ביולוגיים קיבולי שימשו איתור analytes שונים כמו אנטיגנים, נוגדנים, חלבונים ו מטאל יונים6,26,27,28. סוגים אלה של ביולוגיים יש יתרונות רבים כמו במהירות הטבועה, רגישות גבוהה, פשטות, עלות נמוכה, קל מניפולציה מדידה בזמן אמת ללא תיוג29.
השיטה המתוארת במסמך זה נועד לאפשר זיהוי, כימות של מולקולות נמוך-שופע בדגימות מאוד מורכבים, ללא הצורך בשימוש כל תיוג. בפרט, הטכניקה שימושית ביותר בטווח אטו-picogram של מולקולות, איפה מסחרית קיימים כלים אחרים להיכשל באופן מדויק quantitate היעד שלהם.
כאשר שיטה זו מתבצעת, ישנם כמה צעדים קריטי כי יש לקחת בחשבון בעת בעקבות הפרוטוקול. צעד קריטי הוא הצעד ניקוי עם פתרון פיראניה חומצי. שלב 2.1 אינו יכול להיות יותר מ- 10 דקות. הפתרון תבנית עבור שלב 1.4 יחרוג מ- 0.1 מ”ג/מ”ל, מאז ערכים אלה מוטבו בעבר. Voltametric מחזורית סריקות אינו יכול לחרוג 15 מחזורים על מנת לקבל את העובי האופטימלי. עבור שלב 3.1.3, 1.5 µL הוא ערך מיטבי. ערך זה אינו יכול להיות גבוה יותר עבור הסוג המסוים הזה של האלקטרודה. אם UV לריפוי מערכת יש כוח של 400 W, ואז הפילמור יש לבצע לכל היותר 10-15 דקות. ברגע APS (היוזם) מתווסף הפתרון לאחר TEMED, השלב שלאחר מכן חייב להתבצע מהר מאוד להימנע הפילמור מיידית (שלב 3.2.5).
אחד השלבים הקריטיים ביותר הוא הסרת תבנית החותמת מפני השטח לאחר הפילמור UV. אם שלב זה לא מתבצע כהלכה, קיים סיכון כי הסרט פולימריים על פני האלקטרודה ניתן להסיר עם החותמת. לכן, מומלץ לטבול האלקטרודה ואת החותמת חלבון על גבי בתמיסה של מים לאחר הפילמור, ולאחר מכן להסיר את החותמת באיטיות ובזהירות מפני השטח (שלב 3.1.6).
מבוסס על התבנית המשמשת, שינויים ב ‘ סוג ‘ יחס של מונומרים בשימוש (מונומר תפקודית ו מחדש) עשויים להידרש, מבחינת יצירת רגישות גבוהה יותר. זה חייב להיקבע מדעית. עוד יותר, הכריכה זיקה של המולקולה תבנית בדרך כלל כרוך במספר אינטראקציות שונות בו זמנית. לכן, זה עלול להוביל לבעיות במהלך השלבים התחדשות. אם התבנית מאוגד אינו משתחרר מפני השטח כראוי, זה עשוי להשפיע על שימושית של האלקטרודה לצורך ניתוח נוסף. אלה הזיקות רב-נקודתי עלול לגרום גם מ מחייב דרך האינטראקציות החלשות. במערכות כאלה, שאינם ספציפיים האיגוד יכול להתרחש, אשר יכולים להשפיע באופן שלילי על סלקטיביות של מערכת ה-16. אלו הם נפוצים, גנרל, מגבלות של השיטה.
מלבד אלה מגבלות מסוימות, יש המון יתרונות השיטה דנו על פני שיטות קיימות. בעוד RIAs ELISAs, מדידות fluorometric רגישים מאוד, הם דורשים השימוש של חומר עם תוויות (תבנית או גלאי), בעוד החיישן הוא לחלוטין ללא תווית. שיטות אלה הם גם יותר יקרים ולגזול. בגישה ביוסנסור מאפשר מהירה, במקביל סינתזה של מיליוני הוראות בשניה בקומפוזיציות שונות בה זמן זהה16. מאז רק כמה microliters של מונומר פתרון נדרשת הכנה, השיטה היא נוחה בעת שימוש מונומרים מוגבל יקר או אחרת. אלקטרודות MIP עוד, יחיד יכול לשמש כ- 80 ניתוחים ללא ירידה משמעותית הביצועים, אשר גבוה משמעותית מאשר אחרים בשיטות הקיימות30. שיטות קיימות גם סובל, בדרגות שונות, של רגישות נמוכה, סלקטיביות, בעוד השיטה המתוארת מאפשר זיהוי, כימות של מולקולות בטווח pM עם סלקטיביות גבוהה.
בשל עלות-תועלת, להקל על הפעלת המכשיר, זיהוי רגיש בזמן אמת תוך זמן קצר לעומת שיטות קיימות, ביולוגיים הם מאוד מבטיח נקודת-של טיפוח מערכות זיהוי בתנאי שדה; למשל, עבור ניטור סביבתי, יישומים במדינות מתפתחות. ביישומים רבים בתוך האבחון של המחלה, זיהוי בזמן אמת, רגיש, סלקטיבי, מהירה של סמן בתערובת מורכבת כגון סרום הוא נדרש15,25. כאן, ביולוגיים נעלים על שיטות קיימות, בפרט, בשל החוסן ואת הרגישות שלהם. במיוחד עבור זיהוי מדבקים, bacteriophages נחשבים לאחרונה רכיב biorecognition חלופי עבור ביולוגיים עקב שלהם מארח חיידקים ירידה לפרטים33,34,35. החלפת נוגדנים עם bacteriophages הוא מבטיח מאוד על מנת להפחית את העלות, להגדיל עוד יותר את יציבות36. מערכת כזו גם יאפשר זיהוי, כימות מסוים phages הסביבה, מדגימות קליניים. בשל השכיחות של bacteriophages, ואת יכולתם מגלי חיידקים עמידות לאנטיביוטיקה גנים37,38, השיטה עשוי להיות יקר ללמוד את התפשטות בקטריאלי עמיד.
The authors have nothing to disclose.
מריה באומגרטן (IQ ביוטכנולוגיה פלטפורמה, זיהום ברפואה, אוניברסיטת לונד) הוא הודה עבור ביצוע ואספקת סריקה micrographs אלקטרון. עבודה זו נתמך על ידי מענקים שוודית המחקר המועצה Formas (2017-00100) במסגרת האירופית השלישית משותפת תכנות היוזמה בשיחה ההתנגדות מיקרוביאלית (JPIAMR) “דינמיקה שידור”. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, פרשנות, כתיבה, הכנה של כתב היד, ההחלטה להגיש, או ההחלטה לפרסם את עבודותיהם.
Glass Cover slips | ThermoFisher | 102222 | protein stamp |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758-500ML | cleaning |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068-100ML | cleaning |
Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonic | BRANSONIC M1800- E | cleaning |
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648-100ML | modification |
EtOH | Sigma-Aldrich | 1009836010 | rinsing/cleaning |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882-100ML | cross-linker |
acetone | Sigma-Aldrich | 34850-1L-M | cleaning |
H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741-100ML | piranha solution |
H2O2 | Sigma-Aldrich | H1009-500ML | piranha solution |
tyramine | Sigma-Aldrich | T90344-5G | modification |
CompactStat | Ivium Technologies | CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz | potentiostat |
Platinum Counter Electrode Kit | Equilabrium | AFCTR5 | potentiostat |
Reference Electrode | Equilabrium | RREF0021 | potentiostat |
acryloyl chloride | EMD Millipore | 8.00826.0100 | modification |
triethylamine | EMD Millipore | 8.08352.0100 | modification |
toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | modification |
N-hydroxymethyl acrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
poly ethylene glycol-400-dimethacrylate | Sigma-Aldrich | 409510-250ML | cross-linker |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma-Aldrich | 410896-50G | functional monomer |
UV polymerizator | Dymax | Dymax 5000ECE | UV-polymerization |
forceps | Sigma-Aldrich | Z168777-1EA | consumable |
1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364-100ML | blocking agent |
acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553-100G | functional monomer |
N-hydroxymethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 245801-100G | functional monomer |
N-isopropylacrylamide | Sigma-Aldrich | 415324-50G | functional monomer |
methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072-500G | cross-linking monomer |
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | catalyst |
ammonium persulphate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | initiator |
Capacitive biosensor | CapSenze | Equipment | |
Glycine | Merck | 1042011000 | regeneration buffer |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | regeneration buffer |
Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352-1KG | running buffer |
Na2HPO4 • 2H2O | Calbiochem | 567547-1KG | running buffer |
NaH2PO4 • 2H2O | Calbiochem | 567549-1KG | running buffer |
DELPHI correlative light and electron microscope | Phenom-World | equipment | |
Capacitive gold electrodes | CapSenze Biosystems | consumables | |
2,2'-azobis(2-methypropionitrile) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | photo-initiator |
CapSenze Smart Software | CapSenze Biosystems | software program |