En protokoll for rask CRISPR/Cas9-mediert genet avbrudd i musen og menneskelige primære blodkreft cellene er beskrevet i denne artikkelen. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins blir introdusert via electroporation sgRNAs generert gjennom i vitro transkripsjon og kommersielle Cas9. Høy redigering effektivitet oppnås med begrenset tid og finansielle kostnader.
Fremskritt innen blodkreft stamcelletransplantasjon (HSCs) har blitt hjulpet av metoder å genetisk primære progenitor celler som dyremodeller. Komplett genet ablasjon i HSCs nødvendig generering av knockout mus som HSCs kan være isolert, og gene ablasjon i primære menneskelige HSCs ikke var mulig. Viral signaltransduksjon kan brukes for sammenleggbare tilnærminger, men disse led av variabel effekt. Generelt, genetisk manipulasjon av human og mus blodkreft cellene ble hindret av lav effektivitet og omfattende tid og kostnader forpliktelser. Nylig har CRISPR/Cas9 dramatisk utvidet muligheten til å ingeniør DNA av pattedyrceller. Men har anvendelsen av CRISPR/Cas9 til blodkreft cellene vært utfordrende, hovedsakelig på grunn av deres lave transfection effektivitet, toksisitet av plasmider tilnærminger og langsom tiden av virus-baserte protokoller.
En rask metode for å utføre CRISPR/Cas9-mediert genet redigering i murine og menneskelig blodkreft stilk og stamfar celler med knockout effektivitet på opptil 90% tilbys i denne artikkelen. Denne tilnærmingen benytter en ribonucleoprotein (RNP) levering strategi med en strømlinjeformet arbeidsflyt for tre dager. Bruk av Cas9-sgRNA RNP gir en hit-and-run tilnærming, introduserer ingen eksogene DNA-sekvenser i genomet redigerte celler og redusere off-målet effekter. Metoden RNP-baserte er rask og enkel: det krever ikke kloning av sgRNAs, virus forberedelse eller bestemte sgRNA kjemisk endring. Med denne protokollen kunne forskere kunne generere knockouts av en genet av interesse i primære blodkreft cellene innen en uke, inkludert nedetid for oligonucleotide syntese. Denne tilnærmingen gjør en mye bredere gruppe av brukere å tilpasse denne protokollen for deres behov.
Bruk av CRISPR/Cas9 har radikalt forenklet genet redigering i pattedyrceller. Tidlig CRISPR/Cas9-protokoller brukes plasmider eller virus-basert levering Cas9 protein og sgRNA1,2,3. Disse viste revolusjonerende for utvikling av mobilnettet og dyr og er også vellykket brukt til primære blodkreft stilk og stamfar celler (HSPCs)4,5. Disse metodene har imidlertid en rekke ulemper. Først fortsatt gen avbrudd effektivitet ofte under 50%4,5. Mens dette er tilstrekkelig for å generere knockout (KO) kloner i cellelinjer, gjør behovet for kortsiktige kultur HSPCs ikke mottakelig for slik strategi. Det andre begrenser kravet for kloning mengden av sgRNAs som kan testes i enkelt eksperimenter og genererer stor, vanskelig å transfect konstruksjoner. Tredje tvinge disse tilnærmingene forskere å bremse behandlingstid.
For å overvinne disse begrensningene, vår gruppe utviklet og nylig publisert en alternativ CRISPR/Cas9-tilnærming i HSPCs med Cas9-sgRNA ribonucleoproteins (RNPs)-baserte levering6. I denne strategien, rå komponenter i CRISPR (Cas9 protein og i vitro transkribert sgRNA) er pre-kompleksbundet og direkte levert til målet celler via electroporation (figur 1). Halveringstiden av Cas9-sgRNA RNP komplekset er kortere enn det plasmider eller viral nukleinsyre er transkribert, off-målet prisen er lavere sammenlignet med tidlig tilnærminger7. Videre legger RNP tilnærming til fordel for å eliminere alle kilder til eksogene DNA, som tilfeldig kan integrere i målet cellen genomet førte til mobilnettet transformasjon.
Denne protokollen er basert på en strømlinjeformet arbeidsflyt for RNP-basert genet avbrudd eksperimenter, som vist i figur 1. Det første trinnet er å designe og bestilling primere for hver sgRNA. Disse veiledningene benyttes for å gjøre sgRNA DNA maler som brukes for i vitro transkripsjon (PES) til å få sgRNAs. Renset sgRNAs er deretter inkubert med tidligere kjøpt Cas9 protein, til skjemaet Cas9-sgRNA RNP komplekser. Endelig er pre-kompleksbundet Cas9-sgRNA RNPs electroporated i celler. Etter electroporation, redigere effektivitet kan testes og i vitro/i vivo eksperimenter kan startes, avhengig av behov. Under en detaljert beskrivelse av denne nyskapende eksperimentelle tilnærming kan bli funnet.
RNP-tilnærming som er beskrevet i denne detaljert protokollen kan effektiv genet knockout i både mus og primære blodkreft menneskeceller så vel som i suspensjon linjer. Selv om svært høy KO effektivitet er ofte oppnådd, må flere viktige variabler vurderes. Først riktig ekson valg er nøkkelen garantere at effektiv indel innlemmelse tilsvarer genet knockout. To viktige faktorer knyttet til ekson valg er bevaring over isoformene og ekson posisjon innenfor transkripsjoner. Isoformen uttrykk mønstre er variable over celletyper, så hvis genet KO over celletyper, exons som er konstant mellom cellen typer bør rettes. Isoformen mønstre kan verifiseres ved hjelp av q PCR eller RNA-sekvensering data. Ekson posisjon i transkripsjoner, er det best å målrette tidlig exons som frameshift mutasjoner i terminalen eller nest siste ekson kan unnslippe nonsense formidlet decay10, produserer proteiner med roman eller ukjente funksjoner i stedet for sann nullverdier.
Bestemme indel er frekvensen en avgjørende skritt å anslå KO effektiviteten og å tolke riktig biologiske resultatet av eksperimentet. Endonucleases analyser (f.eks landmåler analysen) har fordelen av å være relativt rask og lett å utføre. Men de pleier å være unøyaktig på grunn av betydelig bakgrunn signaler og resultatene er ofte vanskelig å gjengi. Dessuten, de ikke gir informasjon om kvaliteten på indeler generert (f.eks lengden på innsettinger og slettinger) i eksperimentet. Sanger sekvensering er et nyttig alternativ til endonuclease analyser. Plattformer som TIDEVANNET11 (https://tide.nki.nl/) hjelpe bryte ned sanger spor og produsere nøyaktig anslag allel avbrudd effektivitet, samtidig gir frekvenser av personlige indeler. Den store ulempen er en absolutt avhengighet av høy kvalitet Sanger sekvensering spor. Høy gjennomstrømming amplicon sekvensering overvinner disse problemstillingene. Amplicon biblioteker kan tilberedes med svært lav DNA innganger og den høye dekningen sikrer pålitelige resultater. For å redusere kostnadene ved amplicon sekvensering, spiker vi vanligvis i amplicon biblioteker i større sekvensering kjører (f.eks RNA-sekvensering) med bare 1-1,5% av den totale lest. Til slutt, for å bekrefte vellykket knockout, vi sterkt anbefale vurdere protein nivå av vestlige blots eller flow cytometri, når det er mulig.
Som beskrevet tidligere, metoden som presenteres her er rask og enkel og representerer et nytt verktøy for å studere genet slå ut i musen og menneskelige HSPCs. Mens våre protokollen gir instruksjoner for genet knockout med en tips-baserte electroporation, har andre systemer vist seg for å være svært effektiv12,13.
To store begrensninger må anerkjennes når det gjelder RNP tilnærming. Først som beskrevet av vår gruppe, levedyktigheten til HSPCs electroporated med in vitro transkribert sgRNAs kan bli betydelig svekket av electroporation, særlig når forholdene ikke er optimale6. Hvis nødvendig, kan kommersielt syntetisk sgRNAs (dvs. eliminere i vitro transkripsjon) overvinne dette problemet. Disse blir billigere med tiden og kan kjøpes fra flere leverandører. I dette scenariet i vitro transkripsjon kan brukes til å generere en pool av sgRNA til skjermen for effekt, og den mest effektive sgRNA(s) kan velges for syntese. Andre store begrensning av RNP tilnærming er manglende evne til å spore vellykket transfekterte celler, som viral tilnærminger. Men kan høy KO effektivitet og rask redigering med Cas9-sgRNA RNPs oppveie disse ulempene i mange eksperimentelle scenarier. Vi anbefaler å bruke høy gjennomstrømming amplicon sekvensering å nøyaktig bestemme avbrudd effektiviteten i hvert eksperiment. Hvis knock-out av genet av interesse er forventet å tildele en proliferativ fenotypen (dvs. en redusert eller økt spredning sammenlignet med vill-type celler), bestemme indel frekvensen på flere tidspunkt tillater en å vurdere om KO celler gjennomgå berikelse (dvs. indel frekvens øker over tid) eller er outcompeted (dvs. indel frekvens reduseres over tid).
Utfører i vivo eller i vitro eksperimenter for å forstå de biologiske virkningene av tap av gen funksjon krever riktige kontroller. Som tidligere nevnt, i vitro transkribert sgRNAs kan være giftig for celler, spesielt primære stamfar celler6. I tillegg kan DNA dobbel-strand bryter forårsaket av Cas9 protein forårsake genet uavhengige anti-proliferativ svar14. Derfor vi ofte bruker en rekke kontroll sgRNAs CRISPR eksperimenter og anbefaler en celle overflaten markør på din celle type som et andre mål gen som ikke er uttrykt.
Kortsiktige kultur for menneskelig HSPCs i nærvær av cytokiner øker genet avbrudd effektivitet6 og er nødvendig for å oppnå høy virkningsgrad KO. Vi har funnet 36-48 timer å være den ideelle perioden kultur før electroporation-6. Etter electroporation, cellene kan være mer kultivert holde i tankene at jo lenger kulturen jo høyere risiko for å miste multilineage engraftment kapasitet. Derfor utføre vi vanligvis transplantasjoner 6 timer etter electroporation og aldri senere enn 24 timer etter electroporation.
CRISPR/Cas9 har forbedret evne til forskere for å kunne redigere genomet av pattedyrceller. Gjør genet avbrudd mer gjennomførbart i primære blodkreft stamfar celler er spådd å raskt forbedre vitenskapelig kunnskap innen HSPCs og hematologic sykdommer. Viktigere, gjør protokollen beskrevet her det også mulig samtidig generere flere fortrenging med høy effektivitet, tillater modellering av komplekse genetiske landskap, ofte sett i leukemic sykdommer.
Selv om protokollene beskrevet her er fokusert på genet avbrudd, kan de lett tilpasses for genet banke i eksperimenter. Dette kan gjøres via co levering av enkelt-strandet oligonucleotide maler for homologi-rettet reparasjon6,13 (HDR) eller Albin på celler innlegg-electroporation med AAV6 vektorer som inneholder den homologi mal12. Evnen til å reparere eller introdusere spesifikke mutasjoner i genet HSPCs vil lette nye strategier for genterapi og utvidet studiet av kreft driveren mutasjoner i AML og andre hematologic sykdommer. Mens HDR i menneskelig HSPCs har vært vellykket6,12,13, mus HSPCs vært vanskelig å redigere bruker denne strategien6. Optimalisering av HDR protokoller menneskelig og spesielt musen HSPCs vil muliggjøre mer redigering og utvikling av verktøy for å spore redigerte celler ved hjelp av endogene merking.
Til slutt, det er også tenkt at forstyrrelse av mutant gevinst-av-funksjon alleler kan representere en potensiell terapeutisk tilnærming til medfødt og ervervet blodkreft lidelser. I dette scenariet anbefales en DNA-fri tilnærming for å unngå mulig integrasjoner som kan fremme transformasjon. Videre reduserer “hit og løpe” tilnærmingen muligheten for uønsket off-målet virkninger. Mer innsats er nødvendig for å utvikle bestemte leveringssystemer som åpner nye muligheter for behandling av ondsinnethet og ikke-ondartet hematologic sykdommer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av kreftforebygging og forskning Institutt for Texas (RP160283, RP140001 og R1201), Gabrielle Angel Foundation for kreftforskning, Edward P. Evans grunnlaget og NIH (DK092883, CA183252, CA125123, P50CA126752, CA193235, og DK107413). M.C.G. støttes av Baylor forskning talsmenn for Student forskere. Flowcytometri ble delvis støttet av NIH (National Center for forskning tilskudd S10RR024574, National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer AI036211, og National Cancer Institute P30CA125123) for Baylor College of Medicine Cytometri og sortering Core-cellen.
Tissue culture plates according to cell numbers | |||
1.5 ml Eppendorf microtubes | Sigma | Z606340-1000EA | |
50ml Falcon tubes | Corning | 352070 | |
Nuclease Free Water – DEPC treated | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2600 | |
MinElute PCR purification Kit | Qiagen | 28004 | |
RNAse Zap RNAse Decontamination Solution | ThermoFisher Scientific | AM9780 | |
RNA Clean and Concentrator-25 | Zymo | R1017 | |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 100 µg | IDT | 1074181 | |
40 mm Cell Strainers | VWR | 352340 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | GenDEPOT | CA008-050 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Regular | Corning | 35010CV | |
AutoMACS Pro Separator or MACS manual Cell Separation columns | Miltenyi | ||
Neon Transfection System Device | ThermoFisher Scientific | ||
Neon Transfection System 10mL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | For larger numbers of cells (see protocol) Neon Transfection System 100 mL kit (# MPK10025) can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575020 | For human experiments only |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | 7851 | For human experiments only |
CD34 MicroBead Kit UltraPure human | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | For human experiments only |
Stem Span SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | For human experiments only |
Recombinant Human SCF | Miltenyi Biotec | 130-096-695 | For human experiments only |
Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | For human experiments only |
Recombinant Human FLT3L | Miltenyi Biotec | 130-096-479 | For human experiments only |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mouse dissection tools | For mouse experiments only | ||
Mortar and Pestle | For mouse experiments only | ||
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170112 | For mouse experiments only |
Biotin-conjugated anti c-kit antibody | eBioscience | 13-1171-82 | For mouse experiments only |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | For mouse experiments only |
X VIVO-15, with L-Glutamine, Genatmycin and Phenol Red | Lonza | 04-418Q | For mouse experiments only |
Mouse IL-6 | Peprotech | 216-16 | For mouse experiments only |
Mouse TPO | Peprotech | 315-14 | For mouse experiments only |
Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | For mouse experiments only |
Mouse SCF | Peprotech | 250-03 | For mouse experiments only |