프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.
조 혈 줄기 세포 (HSCs) 분야에서 진보는 동물 모델 뿐 아니라 주 조상 세포를 유전자 방법으로 주 었 되었습니다. HSCs에서 완전 한 유전자 제거 녹아웃 쥐에서 HSCs 고립 된, 수 및 기본 인간의 HSCs에서 유전자 제거 불가능 했다 생성이 필요 합니다. 바이러스 성 변환 노크 다운 방법, 사용 될 수 있지만 이러한 변수 효능에서 고통. 인간의 일반적인, 유전자 조작 및 마우스 조 혈 모 세포에서 낮은 효율 및 광범위 한 시간 및 비용 투입에 의해 방해 되었다. 최근, CRISPR/Cas9 포유류 세포의 DNA를 능력을 극적으로 확장 했다. 그러나, 조 혈 모 세포에 CRISPR/Cas9의 응용 프로그램은 도전, 그들의 낮은 transfection 효율 때문에 주로 플라스 미드-기반 접근의 독성과 바이러스 기반 프로토콜의 느린 처리 시간.
CRISPR/Cas9-중재 유전자 murine 인간과 조 혈 줄기와 뿌리에서 최대 90%의 녹아웃 효율성과 셀 편집을 수행 하는 빠른 방법은이 문서에서 제공 됩니다. 이 이렇게는 간소화 된 3 일 워크플로 ribonucleoprotein (RNP) 배달 전략을 이용 한다. Cas9-sgRNA RNP 사용 히트 한 접근 방식, 편집 된 세포의 게놈에 없는 외 인 DNA 시퀀스를 소개 하 고 대상에서 효과 감소 수 있습니다. RNP-기반 방법은 빠르고 간단: sgRNAs, 바이러스 준비 또는 특정 sgRNA 화학 수정의 복제는 필요 하지 않습니다. 이 프로토콜 과학자 성공적으로 oligonucleotide 종합을 위한 가동을 포함 하 여 1 주일 이내 주 조 혈 모 세포의 유전자의 녹아웃을 생성할 수 있어야 합니다. 이 방법은 훨씬 광범위 한 사용자 그룹에 맞게 그들의 필요를 위해이 프로토콜을 허용할 것 이다.
CRISPR/Cas9의 출현은 근본적으로 포유류 세포에서 유전자 편집을 단순화. 초기 CRISPR/Cas9 프로토콜 활용 플라스 미드 또는 Cas9 단백질 및 sgRNA,12,3의 바이러스 기반 배달. 이러한 방법을 세포 및 동물 모델의 개발을 위한 혁신적인 입증 하 고 또한 성공적으로 기본 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs)4,5에 적용 된. 그러나, 이러한 방법은 다양 한 단점이 있다. 첫째, 유전자 장애 효율 504,5종종 남아 있다. 셀 라인에 녹아웃 (KO) 클론을 생성 하기 위한 충분 한 동안, 단기 문화에 대 한 필요성은 HSPCs 같은 전략에 의무가 없습니다. 둘째, 복제에 대 한 요구 사항은 단일 실험에서 시험 될 수 있다 고 생성 구문을 transfect 하기 어려운, 큰 sgRNAs의 양을 제한 합니다. 셋째, 이러한 접근 강제 처리 시간을 느리게 하는 과학자.
이러한 한계를 극복, 우리의 그룹 개발 하 고 최근 HSPCs Cas9 sgRNA ribonucleoproteins (RNPs)를 사용 하 여 다른 CRISPR/Cas9 접근 출판-배달6을 기반으로. 이 전략에서 CRISPR의 원시 구성 요소 (Cas9 단백질 및 생체 외에서 복사할 sgRNA) 사전 complexed와 electroporation (그림 1)를 통해 대상 세포에 직접 전달. Cas9-sgRNA RNP 복잡의 반감기는 시간 보다 짧은 그 플라스 미드 또는 바이러스 성 핵 산 베 꼈 다, 오프 대상 속도 초기 접근7에 비해 낮은. 또한, RNP 접근 세포 변환에 지도 대상 세포 게놈으로 통합 임의로 수 외 인 DNA의 모든 소스를 제거의 혜택을 추가 합니다.
이 프로토콜 기반으로 RNP 기반 유전자 장애 실험에 대 한 간소화 된 워크플로우도 그림 1에 표시 합니다. 첫 번째 단계는 설계 하 고 각 sgRNA에 대 한 프라이 머를 주문. 이 프라이 머는 sgRNAs를 생체 외에서 전송 (IVT)에 사용 되는 sgRNA DNA 서식 파일을 만들기 위해 활용 됩니다. 순화 sgRNAs 다음 양식 Cas9 sgRNA RNP 복합물에 이전에 구입한 Cas9 단백질, 알을 품는. 마지막으로, 사전 complexed Cas9 sgRNA RNPs electroporated 세포로는. Electroporation, 다음 편집 효율 시험 될 수 있다 생체 외에서하 고 /vivo에서 실험, 필요에 따라 시작할 수 있습니다. 이 혁신적인 실험 방법의 자세한 내용은 아래 찾을 수 있습니다.
이 상세한 프로토콜에서 설명 RNP 접근 효율적인 유전자 녹아웃을 마우스 및 인간의 기본 조 혈 모 세포 또한 현 탁 액 셀 라인에서 수 있습니다. 매우 높은 코 효율성 자주 얻을 수 있습니다, 하지만 몇 가지 중요 한 변수 고려 될 필요가 있다. 첫째, 적절 한 exon 선택 효율적인 indel 법인 유전자 녹아웃을 해당 보장의 핵심 이다. Exon 선택에 관련 된 두 가지 중요 한 요소는 성적표 내 isoforms 및 exon 위치에 걸쳐 보존 있습니다. Isoform 식 패턴 세포 유형 변수는, 종류를 표적으로 한다 exons 사이 변형 되지 않은 셀 셀에 걸쳐 진 코를 바란다면 그래서. Isoform 패턴 q PCR 또는 RNA 시퀀싱 데이터를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. Exon 성적표 내 위치, 터미널에서 frameshift 돌연변이로 초기 exons를 대상 하는 것이 좋습니다 또는 penultimate exon 난센스 중재 붕괴10, 소설 또는 알 수 없는 기능 보다는 진정한 null 단백질 생산을 탈출 수 있습니다.
결정은 indel 주파수 코 효율성을 예측 하 고 실험의 생물 학적 결과 제대로 해석 하는 중요 한 단계입니다. Endonucleases 분석 (예: 측량 분석 결과) 상대적으로 쉽고 빠르게 수행 되 고의 이점이 있다. 그러나, 그들은 중요 한 배경 신호 때문에 정확 하지 않을 수 경향이 및 결과 재현 하기 어려운 경우가 많습니다. 또한, 그들은 indels 생성 (예: 삽입 및 삭제의 길이) 실험에서의 품질 정보를 제공 하지 않습니다. 생어 시퀀싱 endonuclease 분석에 유용한 대안을 제공 합니다. 조 수11 (https://tide.nki.nl/) 같은 플랫폼 도움이 생어 흔적을 분해 하 고 또한 개별 indels의 주파수를 제공 하면서 유전자 장애 효율의 정확한 견적을 생성. 주요 단점은 높은-품질 생어 시퀀싱 추적에 절대 의존입니다. 높은 처리량 amplicon 시퀀싱 이러한 문제의 대부분을 극복 했다. Amplicon 라이브러리는 매우 낮은 DNA 입력 시작 준비 될 수 있다 그리고 높은 범위 신뢰할 수 있는 결과 보장 합니다. Amplicon 시퀀싱 비용을 줄이기 위해, 우리가 일반적으로 스파이크 amplicon 라이브러리에 큰 시퀀싱 실행 (예: RNA 시퀀싱)의 전체 읽기 1-1.5%만을 사용 하 여에. 마지막으로, 확인 하 고 성공적인 녹아웃, 우리 강하게 서쪽 오 점 하 여 단백질 수준을 평가 하는 것이 좋습니다 또는 flow cytometry, 가능 하면.
앞에서 설명한 대로 여기에 제시 된 방법을 빠르고 간단 이며 유전자 쥐와 인간 HSPCs에 노크를 공부 하는 새로운 도구를 나타냅니다. 우리의 프로토콜 유전자 녹아웃 electroporation 팁 기반 시스템에 대 한 지침을 제공 한다, 다른 시스템 매우 효과적인12,13하 설명 되 있다.
두 가지 주요 제한 RNP 접근에 대해 인정을 해야 합니다. 첫째, 우리의 그룹에 의해 설명 된 대로 시험관으로 HSPCs electroporated의 sgRNAs를 복사할 손상 될 수 있습니다 크게 electroporation에 의해 조건에 최적의6하는 경우에 특히. 필요한 경우, 상업적으로 합성된 sgRNAs (즉 제거 생체 외에서 전사)이이 문제를 극복할 수 있습니다. 이러한 시간 덜 비싼 되고있다 고 여러 공급 업체에서 구입할 수 있습니다. 이 시나리오에서 녹음 방송 생체 외에서 효능, 화면에 sgRNA의 풀을 생성 하는 데 사용할 수 하 고 가장 효율적인 sgRNA(s) 합성에 대 한 선택할 수 있습니다. RNP 접근의 두 번째 주요 한계는 바이러스-기반 접근에서 성공적으로 transfected 세포를 추적 하는 무 능력. 그러나, 높은 고 효율과 빠른 편집 Cas9 sgRNA RNPs와 함께 얻은 많은 실험 시나리오에서 이러한 단점을 보다 큽니다 수 있습니다. 높은 처리량 amplicon 시퀀싱을 사용 하 여 정확 하 게 각 실험에서 중단 효율성을 결정 하는 것이 좋습니다. 관심사의 유전자의 녹아웃 증식 형 (즉 감소 하거나 확산 야생-타입 셀에 비해 증가)을 부여 하는 것으로 예상 된다, 만약 여러 시간 점에서 indel 빈도 결정 수 있도록 평가 여부 코 셀 농축 (즉 indel 빈도 증가 시간이 지남에) 수술 또는 outcompeted는 (즉. indel 주파수는 시간이 지나면서 감소).
유전자 기능의 손실의 생물 학적 효과 이해 하는 vivo에서 또는 생체 외에서 실험을 수행 하려면 적절 한 컨트롤을 필요 합니다. 앞서 언급 했 듯이, 생체 외에서 복사할 sgRNAs 세포에 독성이 있을 수 있습니다, 특히 주 조상 세포6. 또한, Cas9 단백질에 의해 발생 하는 DNA 이중 가닥 나누기 유전자 독립적인 안티 증식 응답14를 발생할 수 있습니다. 따라서, 우리 자주 CRISPR 실험에서 다양 한 제어 sgRNAs 사용 하 고 세포 유형으로 표현 되는 두 번째 대상 유전자에 세포 표면 마커는 것이 좋습니다.
Cytokines의 존재 인간 HSPCs의 단기 문화 유전자 장애 효율성6 증가 하 고 코 높은 효율을 달성 하는 데 필요한. 우리 문화의 electroporation6전에 이상적인 기간이 될 36-48 시간을 발견 했다. Electroporation, 다음 셀이 될 수 있습니다 더 교양 마음에 유지는 더 이상 문화 multilineage engraftment 용량 손실의 위험이 높은. 따라서, 우리가 일반적으로 수행 이식 6 후 시간 electroporation 결코 electroporation 후 24 시간 이후에.
CRISPR/Cas9는 극적으로 과학자의 편집 기능을 성공적으로 포유류 세포의 게놈을 향상 했다. 주 조 혈 조상 세포에서 유전자 장애를 더 실현 가능한 만들기 신속 하 게 HSPCs 및 혈액 질환 분야에서 과학적 지식을 강화 전망 이다. 중요 한 것은, 여기에 설명 된 프로토콜은 또한 동시에 높은 효율, 복잡 한 유전 풍경, leukemic 질병에서 자주 볼 수의 모델링에 대 한 수 있도록 여러 개의 녹아웃을 생성할 수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜 유전자 장애에 초점을 맞추고 있다, 하지만 그들은 쉽게 유전자 노크에서 실험에 대 한 적응 수 있습니다. 이 수행할 수 있습니다 단일 가닥 oligonucleotide 템플릿 homology 감독 수리6,13 (HDR)의 공동 배달을 통해 또는 셀 게시물 electroporation 변환 AAV6 벡터를 포함 하는 homology 템플릿12. 복구 또는 HSPCs에 있는 특정 돌연변이 소개 하는 기능 유전자 치료와 암 드라이버 돌연변이 AML 및 기타 혈액 질환에서의 확장 된 연구에 대 한 새로운 치료 전략을 촉진 한다. 동안에 인간 HSPCs HDR 성공적인6,,1213, 마우스 HSPCs이 전략6을 사용 하 여 편집 하기 어려운 되었습니다. 인간의에 고 마우스 HSPCs에 특히 HDR 프로토콜의 최적화에는 보다 구체적인 편집 및 생 태그를 사용 하 여 편집 된 셀을 추적 하는 도구 개발 수 있게 된다.
마지막으로, 그것 또한 돌연변이 이득의 기능 대립 유전자의 선 천 성 및 인수 조 혈 장애에 대 한 잠재적인 치료 접근을 대표할 수 있었다 구상입니다. 이 시나리오에서는 DNA 무료로 접근 가능한 통합 변환을 홍보할 수 있는 피하기 위하여 조언 된다. 또한, “치고 실행” 접근 원치 않는 오프 대상 효과의 가능성을 감소 시킨다. 악성 및 비 악성 혈액 질환의 치료에 새로운 길을 열 것 이라고 특정 전달 시스템을 개발 하기 위해서는 더 많은 노력이 필요 합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 암 예방에 의해 지원 되었다 및 암 연구, 에드워드 P. 에반스 재단 및 NIH (DK092883, CA183252, CA125123, P50CA126752, 가브리엘의 천사 재단 (RP160283, RP140001, 및 R1201), 텍사스의 연구소 연구 CA193235, 그리고 DK107413)입니다. M.C.G.는 학생 과학자에 대 한 베일 러를 지지 하는 연구에 의해 지원 됩니다. Cytometry 베일 러의과 대학에 NIH (연구 자원을 부여 알레르기 및 전염 성 질병 AI036211, 및 국립 암 연구소 P30CA125123의 S10RR024574, 국립 연구소에 대 한 국립 센터)에 의해 부분적으로 지원 되었다 Cytometry 고 셀 코어 정렬입니다.
Tissue culture plates according to cell numbers | |||
1.5 ml Eppendorf microtubes | Sigma | Z606340-1000EA | |
50ml Falcon tubes | Corning | 352070 | |
Nuclease Free Water – DEPC treated | ThermoFisher Scientific | AM9915G | |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2600 | |
MinElute PCR purification Kit | Qiagen | 28004 | |
RNAse Zap RNAse Decontamination Solution | ThermoFisher Scientific | AM9780 | |
RNA Clean and Concentrator-25 | Zymo | R1017 | |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 100 µg | IDT | 1074181 | |
40 mm Cell Strainers | VWR | 352340 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | GenDEPOT | CA008-050 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Regular | Corning | 35010CV | |
AutoMACS Pro Separator or MACS manual Cell Separation columns | Miltenyi | ||
Neon Transfection System Device | ThermoFisher Scientific | ||
Neon Transfection System 10mL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | For larger numbers of cells (see protocol) Neon Transfection System 100 mL kit (# MPK10025) can be used |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575020 | For human experiments only |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | 7851 | For human experiments only |
CD34 MicroBead Kit UltraPure human | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | For human experiments only |
Stem Span SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | For human experiments only |
Recombinant Human SCF | Miltenyi Biotec | 130-096-695 | For human experiments only |
Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | For human experiments only |
Recombinant Human FLT3L | Miltenyi Biotec | 130-096-479 | For human experiments only |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mouse dissection tools | For mouse experiments only | ||
Mortar and Pestle | For mouse experiments only | ||
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170112 | For mouse experiments only |
Biotin-conjugated anti c-kit antibody | eBioscience | 13-1171-82 | For mouse experiments only |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | For mouse experiments only |
X VIVO-15, with L-Glutamine, Genatmycin and Phenol Red | Lonza | 04-418Q | For mouse experiments only |
Mouse IL-6 | Peprotech | 216-16 | For mouse experiments only |
Mouse TPO | Peprotech | 315-14 | For mouse experiments only |
Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | For mouse experiments only |
Mouse SCF | Peprotech | 250-03 | For mouse experiments only |