توضح هذه المقالة طريقة لتحليل محتوى الخلية المناعية من الأنسجة الدهنية بعزل الخلايا المناعية من الأنسجة الدهنية وتحليله باستخدام التدفق الخلوي.
تسلل خلايا المناعة في الأنسجة الدهنية تحت الجلد والحشوي (في) الودائع يؤدي إلى التهاب درجة منخفضة المساهمة في تنمية المضاعفات المرتبطة بالبدانة مثل السكري من النوع 2. كما وكيفا التحقيق في المجموعات الخلايا المناعية البشرية في الودائع، قمنا بتطوير نهج قياس تدفق. كسر الأوعية الدموية stromal (SVF)، الذي يحتوي على الخلايا المناعية، ومعزولة من تحت الجلد والأحشاء في الخزعات بالهضم كولاجيناز. تتم إزالة adipocytes بعد الطرد المركزي. الخلايا صندوق التبرعات الخاص ملطخة لعدة علامات ربط الغشاء المحدد للتمييز بين مجموعات فرعية الخلايا المناعية وتحليلها باستخدام التدفق الخلوي. ونتيجة لهذا النهج، برو ومكافحة inflammatory بلعم مجموعات فرعية، الخلايا الجذعية (DCs)، ب-الخلايا CD4+ و CD8+ خلايا تي، ويمكن الكشف عن خلايا ناغورني-كاراباخ وتقديرها كمياً. هذا الأسلوب يعطي معلومات تفصيلية حول الخلايا المناعية في تي ومقدار كل مجموعة فرعية محددة. حيث توجد العديد من الأجسام المضادة الفلورسنت، يمكن تعديل نهجنا التدفق الخلوي لقياس مختلف علامات الخلوية وداخل الخلايا الأخرى ذات الاهتمام.
السمنة وتتميز بدرجة منخفضة في التهاب1 وتسلل الخلايا المناعية برو-التهابات في البطن وتحت الجلد في (ضريبة القيمة المضافة، جلس). تراكم الخلايا المناعية برو التحريضية في الضريبة على القيمة المضافة يؤدي إلى مقاومة الأنسولين وعامل خطر أساسي لتطوير نوع 2 مرض السكري2. تم العثور على الخلايا المناعية لنظام المناعة الفطرية والتكيف في السمنة، مثل الضامة، والخلايا الصاري، العَدلات، CD4+ و CD8+ الخلايا التائية والخلايا البائية3،،من45،6 ،7. وتشكل التبرعات8 هذه الخلايا المناعية، جنبا إلى جنب مع خلايا بطانية والخلايا اللحمية وفروعه adipocyte، الليفية وبيريسيتيس، وهي المصدر الرئيسي للمواد التحريضية للمحترفين في في9.
هو حالة التهاب في عادة التحقيق في تقنيات بما في ذلك لطخة غربية10وقبكر11إيمونوهيستوتشيميستري11. ومع ذلك، عند استخدام هذه التقنيات، في جميع أنحاء، adipocytes وصندوق التبرعات الخاص، يتم استخدام. وهذا يجعل من الصعب تحديد المبلغ ومجموعات فرعية من الخلايا المناعية الموجودة في AT. الخلايا المناعية لها علامات خلية مختلفة لتعريف وتصنيف لهم، مثل الضامة. إظهار الضامة تغايرية مهمة في وظيفة وخلية التعبير علامة السطحية12. ولذلك، أنها تصنف غالباً إلى اثنين بلعم السكان: M1 و M2. عادة ما تسمى الضامة تفعيلها بدلاً من12،13 الضامة M2 ويقيمون في عند البشر العادي أيضي، الهزيل14. ومع ذلك، أثناء السمنة، يحدث تبديل المظهرية من الضامة M2 إلى الضامة M1. تنشيط هذه كلاسيكي M1 الضامة إكسبريس CD11C12 وتتراكم حولها adipocytes ميتا لتشكيل هياكل تشبه التاج13. وقد ثبت أن CD11C+ الضامة في عند تعطل عمل الأنسولين وترتبط بمقاومة الأنسولين في15من البشر يعانون من السمنة المفرطة. تحديد الضامة M1 و M2 في AT، إيمونوهيستوتشيميستري خيار. هذا الأسلوب يعطي معلومات حول موقع الضامة في الأنسجة. ومع ذلك، أنها ستحد من عدد العلامات التي يمكن استخدامها في تلوين واحد. وعلاوة على ذلك، فإنه أيضا يصعب قياسها كمياً. ولذلك، للتحقيق في المجموعات الخلايا المناعية المختلفة في ضريبة القيمة المضافة وسبت الودائع، قمنا بتطوير نهج قياس تدفق. وهذا النهج يتيح لنا الفرصة لاستخدام عدة علامات كل خلية مع تحليل تدفق واحد الخلوي لتحديد الخلية مجموعات فرعية وحساب الأرقام لكل مجموعة فرعية موجودة في الودائع لدى.
هذه الأساليب تصف كيفية عزل صندوق التبرعات الخاص من ضريبة القيمة المضافة وسبت وقياس الكميات النسبية للخلايا المناعية داخل هذه الأنسجة. وعلاوة على ذلك، الدولة الأساليب كيفية تحديد التعبير عن علامات على أنواع محددة من الخلايا.
التدفق الخلوي للخلايا المناعية الأنسجة تقنية قوية للنمط الظاهري حالة الأنسجة المناعية. التقدير الكمي للخلايا المناعية الأنسجة يمكن أن يكون العديد من التطبيقات. كما هو موضح في النتائج، فمن الممكن مقارنة وجود الخلايا المناعية المحددة بين مجموعات من المرضى (مثلاً، الهزيل مقابل السمنة). وبالإضافة إلى ذلك، خلال أداء التدفق الخلوي أيضا على دم المرضى نفسه، يمكن أن يحقق الرابطات بين تعميم خلايا الأنسجة والخلايا. مع هذا التطبيق، تمكنا من تحديد أن مجموعة فرعية معينة من تعميم وحيدات يرتبط مع CD11C برو–التهابات+ الأنسجة الدهنية الضامة16.
تعديلات على بروتوكول وصف ستوسع تطبيقاتها العديدة المتاحة أضداد الفلورسنت جعل التدفق الخلوي تنوعاً للغاية. مع الأجسام المضادة المختلفة يمكن التمييز بين ما يقرب من جميع أنواع الخلايا ويمكن الكشف عنها بالتعبير عن علامات كثيرة. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن وصمة عار علامات إينتراسيلولارلي من بيرميبيليزينج غشاء الخلية للسماح الربط داخل الخلايا من الأجسام المضادة الفلورسنت. تسمح هذه الخصائص تمييز السكان بلعم متنوعة جداً خارج المخططات بلعم M1 و M2 مبسطة أكثر من اللازم. وإلى جانب قياس التعبير علامة السطحية، يمكن الملون البروتينات (أي، السيتوكينات) إينتراسيلولارلي توفير معلومات حول وظيفة بلعم. وبالإضافة إلى ذلك، تستخدم علامات انتشار مثل Ki67 لقياس معدلات الانتشار. كما هو موضح، يستند التمييز بين وحدات تحكم المجال Dc والضامة مستويات مؤسسة مونتانيار علامات DC. علامة بلعم عامة، مثل CD68 يمكن إدراجها في لوحة بلعم (الفريق 1 من نظام مراقبة الأصول الميدانية). ومع ذلك، CD68 يحتاج إلى أن الملون بيرميبيليزيشن إينتراسيلولارلي التي تتطلب من غشاء الخلية التي ليست الأفضل، وأن تمديد البروتوكول. علامات بلعم الأخرى علامات فرعية مثل CD163 و CD206 أو CD11c، هذا الأخير يجري إدماجها في لوحة بلعم المعروضة هنا.
في لجاننا نظام مراقبة الأصول الميدانية، لم يدرج، علامة لتمييز الخلايا الحية والميتة التي سيكون من الأفضل لأنها تسمح استبعاد الخلايا الميتة أكثر دقة من استخدام منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب. وكثيراً ما يستخدم الحمض النووي تلطيخ صلاحية الأصباغ يوديد propidium (PI) أو 4 ‘, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، فضلا عن أمين الحرة رد فعل الأصباغ مثل لايف/الميت”يمكن حلها الميت خلية وصمة عار مجموعة”، ومتاح في ألوان صبغة مختلفة. ومع ذلك، لا يمكن استخدام PI و DAPI عند تحديد الخلايا. كما ورد في البروتوكول، تلطيخ البقاء حية/ميتة “يمكن حلها الأحمر الميت خلية” يمكن دمجها في كلا الفريقين دون التأثير على نظام مراقبة الأصول الميدانية الشاملة النابضة الاستراتيجية.
وبالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من الخلايا الحية يعني جميع البيانات النسبية. فقط عن طريق إدخال الضبط، يعرف عدد الخلايا في سيتوميتير التدفق، سيكون من الممكن لتحديد العدد الدقيق لكل نوع من الخلايا. يمكن أن تحسب عدد تقريبي للخلايا بعد عد الخلايا في كسر صندوق التبرعات الخاص باستخدام غرفة لعد الأصوات. ومع ذلك، سوف يكون هذا العدد إلى تعديل كمية الأنسجة خزعة المستخدمة لعزل صندوق التبرعات الخاص، لكن هذا القيود عند مقارنة الهزيل للسمنة في. كتلة مماثلة من السمنة لدى يتكون من أقل adipocytes أنها مليئة بالدهون وقد توسعت إلى حد كبير. يمكن أن يؤدي هذا إلى التقليل عدد الخلايا المناعية إذا قدمت كعدد الخلايا المناعية كل غرام من الساعة أو لكل adipocyte.
وعادة ما يتم إدراج المرضى في الدراسات الإنسانية، على مدى فترة أطول من الزمن مما يجعل توحيد الإجراءات التجريبية ذات أهمية كبيرة. للمقارنة بين بيانات التدفق الخلوي بين المرضى، وهناك العديد من الخيارات. كما هو موضح في هذا البروتوكول، يمكن أن تكون ثابتة الخلايا قبل القياس السماح بتحليل عدة عينات في نفس اليوم. يمكن أن يتحقق هذا أيضا بتجميد صندوق التبرعات الخاص قبل تلطيخ لهم، مما يسمح للإجراء المصبوغة بتكون متساوية بين جميع العينات، ولكن يمكن أن تتأثر صلاحية الخلايا. وأخيراً، كما استخدمت في هذه الدراسة، الخرز الفلورسنت لتثبيت مستويات التعويض، واستخدمت cytometer تتبع الخرز مرتين أسبوعيا لتوحيد القياسات اليومية سيتوميتير. هذا الخيار الأخير هو الأكثر فعالية عندما قياس العينات المأخوذة من دراسة تمتد فترة طويلة من الزمن.
عاملاً مقيداً للتدفق الخلوي بشكل عام هو استخدام الفلورية. عدد التسميات الفلورسنت يمكن الكشف عنها في وقت واحد محدودة بسبب التداخل في أطياف الانبعاث. ومع ذلك، مع التنمية لوحة نظام مراقبة الأصول الميدانية الذكية واستخدام عدة زجاجات جسم كل ضريبة القيمة المضافة أو عينة جلس، هذه المسألة يمكن التغلب عليها كما هو موضح في هذا البروتوكول. هو جانبا مهما من نظام مراقبة الأصول الميدانية فريق التنمية FMO عناصر التحكم. باستخدام جميع الأجسام المضادة للفريق باستثناء واحدة، يمكن تقدير مستويات أوتوفلوريسسينسي المحتملة عند مقارنة FMO مع الفريق كامل. يسمح هذا النابضة دقيقة من السكان، وينبغي أن يقوم هذه الإجراءات عند إعداد لوحة نظام مراقبة الأصول الميدانية جديدة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اكتشاف الأجيال الجديدة من أجهزة نظام مراقبة الأصول الميدانية المعلمات يصل إلى 50 السماح الكشف المتزامن للعديد من الخصائص لكل خلية. هناك مسألة أخرى تتصل بالجانب المتعلق بالأسفار هو أوتوفلوريسسينسي الخلايا، ولا سيما الضامة. بعد الإثارة للخلايا مع الليزر نظام مراقبة الأصول الميدانية (أساسا مع الإثارة الطول الموجي نانومتر 488)، تنبعث هذه الخلايا إشارة فلورسنت (أساسا < 640 nm) الذي يمكن تسميتها التداخل مع أطياف الانبعاث من الجسم17،18. لحساب هذا، ينبغي قياس الخلايا أونستينيد لتحديد أوتوفلوريسسينسي في كل قناة. مع هذه المعرفة، ينبغي اختيار فلوروتشروميس التي تعرض قوة إشارة التي يتجاوز إشارة أوتوفلوريسسينت. وينبغي مراعاة هذه الإشارات الخلفية أوتوفلوريسسينت عند تحديد استراتيجية النابضة للسكان. لذلك، قبل تطبيق هذا البروتوكول ونظام مراقبة الأصول الميدانية فريق التصميم الذكي الممكن في عمق النمط الظاهري بلعم الأنواع الفرعية. لدى متميزة جديدة يمكن أن توصف بالضامة ووظيفتها.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر J. van de جار وفرومين م. (جامعة ماستريخت، هولندا) لتقديم الدعم التقني لهم. وبالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر ك. فيربوفين، “دال هانسن”، J. جوكين، وبلاك هاء-توفير عينة الدم والأنسجة المستخدمة لإعداد هذا البروتوكول والتجارب اللاحقة.
Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |