Summary
توضح هذه المقالة طريقة لتحليل محتوى الخلية المناعية من الأنسجة الدهنية بعزل الخلايا المناعية من الأنسجة الدهنية وتحليله باستخدام التدفق الخلوي.
Abstract
تسلل خلايا المناعة في الأنسجة الدهنية تحت الجلد والحشوي (في) الودائع يؤدي إلى التهاب درجة منخفضة المساهمة في تنمية المضاعفات المرتبطة بالبدانة مثل السكري من النوع 2. كما وكيفا التحقيق في المجموعات الخلايا المناعية البشرية في الودائع، قمنا بتطوير نهج قياس تدفق. كسر الأوعية الدموية stromal (SVF)، الذي يحتوي على الخلايا المناعية، ومعزولة من تحت الجلد والأحشاء في الخزعات بالهضم كولاجيناز. تتم إزالة adipocytes بعد الطرد المركزي. الخلايا صندوق التبرعات الخاص ملطخة لعدة علامات ربط الغشاء المحدد للتمييز بين مجموعات فرعية الخلايا المناعية وتحليلها باستخدام التدفق الخلوي. ونتيجة لهذا النهج، برو ومكافحة inflammatory بلعم مجموعات فرعية، الخلايا الجذعية (DCs)، ب-الخلايا CD4+ و CD8+ خلايا تي، ويمكن الكشف عن خلايا ناغورني-كاراباخ وتقديرها كمياً. هذا الأسلوب يعطي معلومات تفصيلية حول الخلايا المناعية في تي ومقدار كل مجموعة فرعية محددة. حيث توجد العديد من الأجسام المضادة الفلورسنت، يمكن تعديل نهجنا التدفق الخلوي لقياس مختلف علامات الخلوية وداخل الخلايا الأخرى ذات الاهتمام.
Introduction
السمنة وتتميز بدرجة منخفضة في التهاب1 وتسلل الخلايا المناعية برو-التهابات في البطن وتحت الجلد في (ضريبة القيمة المضافة، جلس). تراكم الخلايا المناعية برو التحريضية في الضريبة على القيمة المضافة يؤدي إلى مقاومة الأنسولين وعامل خطر أساسي لتطوير نوع 2 مرض السكري2. تم العثور على الخلايا المناعية لنظام المناعة الفطرية والتكيف في السمنة، مثل الضامة، والخلايا الصاري، العَدلات، CD4+ و CD8+ الخلايا التائية والخلايا البائية3،،من45،6 ،7. وتشكل التبرعات8 هذه الخلايا المناعية، جنبا إلى جنب مع خلايا بطانية والخلايا اللحمية وفروعه adipocyte، الليفية وبيريسيتيس، وهي المصدر الرئيسي للمواد التحريضية للمحترفين في في9.
هو حالة التهاب في عادة التحقيق في تقنيات بما في ذلك لطخة غربية10وقبكر11إيمونوهيستوتشيميستري11. ومع ذلك، عند استخدام هذه التقنيات، في جميع أنحاء، adipocytes وصندوق التبرعات الخاص، يتم استخدام. وهذا يجعل من الصعب تحديد المبلغ ومجموعات فرعية من الخلايا المناعية الموجودة في AT. الخلايا المناعية لها علامات خلية مختلفة لتعريف وتصنيف لهم، مثل الضامة. إظهار الضامة تغايرية مهمة في وظيفة وخلية التعبير علامة السطحية12. ولذلك، أنها تصنف غالباً إلى اثنين بلعم السكان: M1 و M2. عادة ما تسمى الضامة تفعيلها بدلاً من12،13 الضامة M2 ويقيمون في عند البشر العادي أيضي، الهزيل14. ومع ذلك، أثناء السمنة، يحدث تبديل المظهرية من الضامة M2 إلى الضامة M1. تنشيط هذه كلاسيكي M1 الضامة إكسبريس CD11C12 وتتراكم حولها adipocytes ميتا لتشكيل هياكل تشبه التاج13. وقد ثبت أن CD11C+ الضامة في عند تعطل عمل الأنسولين وترتبط بمقاومة الأنسولين في15من البشر يعانون من السمنة المفرطة. تحديد الضامة M1 و M2 في AT، إيمونوهيستوتشيميستري خيار. هذا الأسلوب يعطي معلومات حول موقع الضامة في الأنسجة. ومع ذلك، أنها ستحد من عدد العلامات التي يمكن استخدامها في تلوين واحد. وعلاوة على ذلك، فإنه أيضا يصعب قياسها كمياً. ولذلك، للتحقيق في المجموعات الخلايا المناعية المختلفة في ضريبة القيمة المضافة وسبت الودائع، قمنا بتطوير نهج قياس تدفق. وهذا النهج يتيح لنا الفرصة لاستخدام عدة علامات كل خلية مع تحليل تدفق واحد الخلوي لتحديد الخلية مجموعات فرعية وحساب الأرقام لكل مجموعة فرعية موجودة في الودائع لدى.
Protocol
الأحشاء وتحت الجلد في عينات أخذت من مواضيع الملتحقين بالدراسة أقرتها اللجنة "الأخلاقية الطبية" جايسا المستشفى، Hasselt، وجامعة Hasselt، بلجيكا، وفقا "إعلان هلسنكي".
1-إعداد الكواشف
- الحل كولاجيناز
- حل ز 1 من كولاجيناز في 10 مل فوسفات مخزنة المالحة (PBS، دون الكالسيوم والمغنيسيوم) لجعل حل أسهم 100 ملغ/مل. إعداد 200 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- حل ز 1 كولاجيناز الحادي عشر في 10 مل من برنامج تلفزيوني لجعل حل أسهم 100 ملغ/مل. إعداد 200 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- حل 10 مغ الدناز أنا في 10 مل من برنامج تلفزيوني لجعل حل أسهم 10 ملغ/مل. إعداد 180 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إضافة 100 ميليلتر كولاجيناز الأول (100 مغ/مل)، 100 ميليلتر كولاجيناز الحادي عشر (100 مغ/مل) و 90 ميليلتر الدناز أنا (10 مغ/مل) إلى 10 مل من F12 دميم حم. جعل الحل كولاجيناز طازجة لكل عزلة.
- المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء
- حل ز 0.84 NH4Cl في 100 مل الماء عالي النقاوة.
- تعيين درجة الحموضة 7.4 قبل الاستخدام. تخزين في قارورة زجاج في 4 درجات مئوية.
- وضع المخزن المؤقت تحلل كرات الدم الحمراء على الجليد قبل الاستخدام.
- المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية
- حل ز 0.5 ألبومين المصل البقري (BSA) في 100 مل من برنامج تلفزيوني للحصول على برنامج تلفزيوني جيش صرب البوسنة 0.5%.
- حل 65 ملغ نان3 في 100 مل 0.5% برنامج تلفزيوني جيش صرب البوسنة للحصول على برنامج تلفزيوني 10 ملم نان3 0.5% جيش صرب البوسنة. حل مخزن في قارورة زجاج في 4 درجات مئوية.
- نظام مراقبة الأصول الميدانية مكان المخزن المؤقت على الجليد قبل الاستخدام.
تنبيه: نان3 شديد السمية. العمل في غطاء دخان وارتداء نظارات السلامة وقفازات للحماية أثناء التعامل مع نان3.
- البشرية مفتش كتلة
- حل 10 مغ مفتش البشرية في 10 مل برنامج تلفزيوني للحصول على 1 ملغ/مل. إعداد 100 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- وضع كتلة مفتش البشرية في الثلج قبل الاستخدام.
2-العزل من صندوق التبرعات الخاص من AT
- قطع ز 1 من خزعة إلى قطع صغيرة (± 2 مم2) بدون مشرط ونقل إلى أنبوب 50 مل الطرد مركزي (مثلاً، الأنبوب فالكون). بإضافة 10 مل من محلول كولاجيناز إلى كل في العينة.
ملاحظة: أغلق غطاء الأنبوبة تماما وتدوير الغطاء ¼ دورة مرة أخرى. - احتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي تحت تهز لطيف (60 دورة/دقيقة).
- تصفية تعليق الناتجة مع عامل تصفية 200 ميكرومتر وجمع العينة في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي جديدة. إضافة 7 مل برنامج تلفزيوني على رأس عامل التصفية شطف عامل التصفية والحصول على كافة الخلايا.
- الطرد المركزي العينة في 280 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة الكسر adipocyte العائمة بواسطة بيبيتينج. بيليه الخلية من صندوق التبرعات الخاص.
ملاحظة: إزالة الكسر adipocyte للحصول على التبرعات. تجنب غمر طرف كامل في العينة لأن هذا سيزيل فقط في برنامج تلفزيوني ولا في adipocytes العائمة. - ريسوسبيند صندوق التبرعات الخاص في 5 مل من برنامج تلفزيوني إزالة كولاجيناز وتصفية التعليق مع عامل تصفية 70 ميكرومتر وشطف عامل التصفية مع 5 مل برنامج تلفزيوني والطرد المركزي العينة في 280 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 3 مل من المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء.
- احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد. إضافة مل 7 من برنامج تلفزيوني بعد الحضانة.
- الطرد المركزي العينة في 280 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
3-تلوين لصندوق التبرعات الخاص لتحليل التدفق الخلوي
- حل بيليه الخلية في نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت 4 درجات مئوية ميليلتر 90 وإضافة 10 ميليلتر من كتلة مفتش البشرية 1 ملغ/مل. تقسيم تعليق خلية في الآبار 2 من لوحة الشكل الخامس 96 جيدا. وضع اللوحة على الجليد وترك كتلة مفتش البشرية احتضانها لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 100 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة لكل عينة لغسل والطرد المركزي لوحة لمدة 5 دقائق مع 280 x ز في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية بترجيح كفة اللوحة رأسا على عقب في حركة واحدة سلسة دون التنصت على اللوحة.
ملاحظة: تأكد من إزالة أي سائل المتبقية من الجزء العلوي من اللوحة مع أنسجة أثناء حفظ اللوحة رأسا على عقب. - إعداد زجاجات جسم بلعم والعاصمة مجموعات فرعية (الفريق 1 من نظام مراقبة الأصول الميدانية) وخلية تي وب مجموعات فرعية (نظام مراقبة الأصول الميدانية الفريق 2) كما هو موضح في الجدول 1 و الجدول 2. الكميات المبينة في الجدول 1 و الجدول 2 يتم تحديد بعد تحسين تركيزات الأجسام المضادة وكافية لواحد ضريبة القيمة المضافة أو عينة سبت.
ملاحظة: في لوحة 1 من نظام مراقبة الأصول الميدانية، استخدام علامات CD303 و CD141 للتأكد من أن CD11C+ CD11B الخلايامنخفضة هي وحدات تحكم المجال Dc. ومع ذلك، من المستحسن لاستبعاد هذه العلامات من الفريق تشمل تلطيخ يعيش الميت. يمكن الجمع بين كل لوحة نظام مراقبة الأصول الميدانية 1 و 2 مع استمرارية حية/ميتة "يمكن حلها الأحمر الميت خلية وصمة عار طقم" تلطيخ عند استثناء CD303 في لوحة 1 كقناة PE سوف تكون غير مستخدمة. أداء السلامة تلطيخ وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. - ريسوسبيند بيليه في جسم ميليلتر 29.5 كوكتيل للفريق 1 من نظام مراقبة الأصول الميدانية، وجسم ميليلتر 23 كوكتيل لنظام مراقبة الأصول الميدانية الفريق 2. احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام على الجليد.
- إضافة 150 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة لكل بئر وريسوسبيند بيليه الخلية القيام بخطوة ثانية في المياه والصرف الصحي. الطرد المركزي في اللوحة لمدة 5 دقائق في 280 x ز و 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية بترجيح كفة اللوحة رأسا على عقب.
- إضافة 150 ميليلتر 1% فورمالدهايد الحل لكل بئر إصلاح الخلايا. نقل تعليق خلية من كل بئر للأنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية المناظرة التي بيبيتينج مع ماصة P200. تخزين أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 7 أيام.
ملاحظة: القياس المباشر أيضا الممكنة. إضافة 150 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة لكل بئر بدلاً من 1% فورمالدهايد ونقل الخلايا من بيبيتينج مع ماصة P200 لأنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية المناظرة، وتحليل الخلايا.
تنبيه: فورمالدهايد سامة جداً. إعداد الحلول فورمالدهايد بينما كان يعمل في غطاء دخان تجنب استنشاق وارتداء القفازات ونظارات السلامة للحماية.
4-التدفق الخلوي التحليل
- قبل القياس الأولى، استخدام عنصر تحكم سلبية أونستينيد لتعيين الأمام مبعثر (FSC) والجانب مبعثر (SSC). ضبط الفولتية cytometer التدفق وفقا لإرشادات الشركة المصنعة بحيث أن جميع السكان لمصلحة مرئية في الرسم البياني منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب، ويمكن إجراء تمييز بين الحطام والخلايا الحية.
- إجراء تحليل لتعويض متعدد الألوان مع جسم التقاط الخرز يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- إعداد fluorescence ناقص واحد (FMO) يتحكم بجعل مزيج الأجسام المضادة ولكن يستبعد جسم واحد من هذا المزيج. تنفيذ هذا الإجراء لكل جسم، خلق خلطات جسم 8 للفريق 1 من نظام مراقبة الأصول الميدانية، ويمزج جسم 6 لنظام مراقبة الأصول الميدانية الفريق 2. وتستخدم هذه خلطات جسم FMO لوصمة عار صندوق التبرعات الخاص كما هو موضح سابقا في هذا البروتوكول.
- قياس جميع عناصر التحكم FMO وتعيين الاستراتيجية النابضة استناداً إلى عناصر التحكم FMO. استخدام عناصر تحكم FMO للكشف عن السيارات-الأسفار ممكن من الخلايا.
ملاحظة: عن طريق إزالة جسم واحد من هذا المزيج، أي مستوى الأسفار التي اكتشفت في هذه القناة إشارة خلفية/أوتوفلوريسسينت. ومن ثم، بمقارنة FMO مختلفة التحكم في نتائج نظام مراقبة الأصول الميدانية، يمكن استخلاص غيتس في فئات سكانية محددة تكفل استناداً إلى الخلايا إيجابية جاتينجس ولا تستند إلى صف السيارات. - دوامة نظام مراقبة الأصول الميدانية أنابيب 800 لفة في الدقيقة قبل وضعها في سيتوميتير تدفق وبدء القياس.
ملاحظة: يوصي بالحد ني أحداث 50,000 في بوابة حية لضمان ما يكفي من خلايا تقاس من كل يتدنى.
Representative Results
وكان صندوق التبرعات الخاص معزولة عن ضريبة القيمة المضافة وجلس تقاس باستخدام التدفق الخلوي. قياس التدفق الخلوي توليد قطع عرض السكان خلية مختلفة استناداً إلى علامات الخلوية (الشكل 1A و 1B). أولاً، برسم الأمام مبعثر العرض (منتدى التعاون الأمني-W) وإلى الأمام منطقة مبعثر (منتدى التعاون الأمني-أ)، الخلية يمكن القضاء على مجاميع من مزيد من التحليل النابضة الخلايا المفردة كوكر FSC منخفضة يتم تحديد الخلايا التالية، ويعيش، واستبعاد الحطام الخلوية النابضة الخلايا الصحيح حجم وتعقيد استخدام منتدى التعاون الأمني-الجانب ومبعثر منطقة (SSC-أ)، على التوالي. الخلايا الميتة صغيرة وواضحة لذلك كمجموعة متميزة من سكان مع صغيرة منتدى التعاون الأمني-ألف. واختيرت الخلايا التالية، ومحصنة باستخدام علامة الكريات البيض عموم CD45 (الفريق 1 و 2، الشكل 1A). لتحليل الضامة، الخلايا المناعية الأخرى مثل تي-الخلايا (CD3)، ب-الخلايا (CD19)، العَدلات (CD66b+ CD11b+)، واستبعدت ناغورني كاراباخ-الخلايا (CD56) من إجراء مزيد من التحليل باستخدام الأجسام المضادة متميزة لاستهداف هذه الخلايا، ولكن مع نفس فلوروتشرومي. تقسيم المزيد من الخلايا المتبقية يستند التعبير CD11b و CD11c. وادي هذا إلى السكان التالية: CD11b+ CD11c+ الضامة، CD11b+ CD11c الضامة– ، و CD11bمنخفضة/- CD11c+ DCs (لوحة نظام مراقبة الأصول الميدانية 1، الشكل 1B). قياس كثافة fluorescence يعني (MFI) يسمح بالتحديد الكمي للتعبير عن CD303 (العلامة بلاسماسيتويد DC) و CD141 (العلامة DC)، في CD11b+ CD11c+ الضامة و CD11bمنخفضة/- CD11c+ وحدات تحكم المجال Dc. التعبير عن كل هذه العلامات كانت أعلى في CD11bمنخفضة/- CD11c+ الخلايا مؤكدا أن CD11bمنخفضة/- CD11c+ وكانت الزنزانات DCs (الشكل 1).
CD45+ الخلايا (الشكل 1A) قسمت إلى الخلايا التائية والخلايا البائية استخدام CD3 و CD19، على التوالي. خلايا تي كانت مقسمة إلى خلايا T-مساعد (CD4+) والخلايا التائية السامة للخلايا (CD8+). وأخيراً، CD3–CD19 الخلايا–قد تآمروا لقياس ناغورني كاراباخ-الخلايا باستخدام علامة CD56 (لوحة نظام مراقبة الأصول الميدانية 2، الشكل 1). عدد الخلايا في كل بوابة يتم تحديده كمياً، ويمكن استخدامها لحساب النسبة المئوية لهذا النوع الخلية من جميع الخلايا الحية (الجدول 3).
يمكن حساب النسبة المئوية للخلايا الحية لكل موضوع السماح بحساب المتوسط لجميع المواضيع في مجموعة على سبيل المثال الرجل الهزيل أو السمنة عرض وفرة محصنة خلية معينة، أي، CD11b برو--التهابات+ CD11c+ بلعم في لدى الحشوي (الشكل 2).
رقم 1. نظام مراقبة الأصول الميدانية النابضة استراتيجية أنسجة الدهنية الحشوية. مؤامرة (أ) نظام مراقبة الأصول الميدانية لكافة الأحداث (أسود) مع كثافة العرض المبعثر إلى الأمام (منتدى التعاون الأمني-W) وكثافة منطقة المبعثر إلى الأمام (منتدى التعاون الأمني-أ) الذي يحتوي على بوابة لتحديد فقط الخلايا المفردة (أحمر) متبوعاً بمؤامرة نظام مراقبة الأصول الميدانية استناداً إلى كثافة منطقة مبعثر بمنتدى التعاون الأمني والجانب (SSC-أ) يحتوي على بوابة تحديد الخلايا الحية (الضوء الأخضر). القادم مؤامرة بالتعاون بين بلدان الجنوب، وكثافة fluorescence CD45 يحتوي على بوابة اختيار CD45 جميع+ (المناعة) خلايا (أزرق). (ب) نظام مراقبة الأصول الميدانية الأرض من شدة الأسفار CD19, CD3, CD66b، و CD56 مقابل كثافة الأسفار CD11b، وبوابة تحديد كافة الخلايا التي هي CD19، CD3، CD66b و CD56 السلبية (براون) لمزيد من تقسيم إلى السكان. كذلك التقسيم في المؤامرة القادمة استناداً إلى كثافة الأسفار CD11b و CD11c. يتم عرض البوابات التي تحتوي على CD11b+ CD11c+ الضامة (أخضر داكن)، CD11b+ CD11c– الضامة (الأرجواني)، و CD11bمنخفضة/- CD11c+ الخلايا الجذعية (أزرق). (ج) مبلغ CD11b+، CD11c+، أو CD11bمنخفضة/- CD11c+ الخلايا المحور (ص) عرض مستويات شدة الأسفار محور (س) ل CD303 و CD141، والتقدير الكمي المقابلة للوسط كثافة الفلورية (MFI). (د) نظام مراقبة الأصول الميدانية الأرض عرض CD45 السابقة+ السكان (أزرق) استناداً إلى كثافة fluorescence CD3 و CD19 التي تحتوي على أبواب تحديد خلايا تي (أرجواني) والخلايا البائية (أخضر داكن)، والخلايا غير أوتوفلوريسسينت (الأخضر) السلبية لكلا CD3 و CD19. الأرض التالية يستند fluorescence CD4 و CD8 مع بوابات تحديد خلايا CD4+ (أخضر فاتح) و CD8+ (أرجواني) خلايا تي. وتستخدم استراتيجية النابضة متطابقة للأنسجة الدهنية تحت الجلد. وتستخدم استراتيجية النابضة متطابقة للأنسجة الدهنية تحت الجلد. وقد تم تعديل هذا الرقم من ووترز et al. 16 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. يحتوي البدانة ضريبة القيمة المضافة على الضامة برو-التهابات أكثر. مقدار CD11b+ CD11c+ الضامة تعرض كنسبة مئوية من جميع الخلايا الحية في ضريبة القيمة المضافة للرجل الهزيل والسمنة المفرطة. هي جميع البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة؛ n = 20 العجاف و n = 31 للسمنة. p ≤ 0.01 مقابل العجاف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الهدف | تعريف الهدف | يقدم على | فلوروتشرومي | الكمية | استنساخ |
| CD11B | علامة إنتغرين النقوي | المحببة، حيدات/الضامة، والخلايا الجذعيةمنخفضة والخلايا القاتلة الطبيعية | BV421 | ميليلتر 2.5 | ICRF44 |
| CD19 | مستضد بالخليه المشتركة | التنمية بالخليه من الخلية برو-ب بلاستويد بالخليه والخلية بالبلازما | فيتك | 3 ميليلتر | HIB19 |
| CD3 | مستضد T الخلية المشتركة | اللمفاويات T والخلايا T القاتلة الطبيعية ونمو | فيتك | 3 ميليلتر | UCHT1 |
| CD66B | عضو مستضد carcinoembryonic (سيا)-مثل الأسرة بروتين سكري | المحببة | فيتك | 5 ميليلتر | G10F5 |
| CD56 | الغليكوزيلاتي التصاق البروتين بشكل كبير | الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا T القاتلة الطبيعية | فيتك | 5 ميليلتر | B159 |
| CD303 | النوع الثاني ترانسميمبراني بروتين سكري | بلاسماسيتويد الخلايا الجذعية | PE | 1 ميليلتر | 201A |
| CD141 | ثرومبومودولين | حيدات/الضامةمنخفضة، ويتدنى للخلايا الجذعية | آسيا والمحيط الهادئ | 1 ميليلتر | طراز M80 |
| CD11C | النوع الأول من بروتين سكري transmembrane؛ αx إنتغرين | حيدات/الضامة، والخلايا الجذعية، المحببة، والخلايا القاتلة الطبيعية، مجموعة فرعية من الخلايا B و T | آسيا والمحيط الهادئ--Cy7 | 0.5 ميليلتر | Bu15 |
| CD45 | مستضد الكريات البيض شيوعاً | الكريات البيضاء البشرية كافة بما في ذلك الخلايا الليمفاوية ووحيدات، المحببة، الحمضات والثيموسيه | PE Cy7 | 1 ميليلتر | HI30 |
| المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية | - | - | - | ميليلتر 7.5 | - |
الجدول 1. كوكتيل لجسم ف نظام مراقبة الأصول الميدانيةأن 1 لتحديد مجموعات فرعية بلعم والسكان الخلايا الجذعية. كمية من الأجسام المضادة ووصف لتحليل عينة واحدة.
| الهدف | تعريف الهدف | يقدم على | فلوروتشرومي | الكمية | استنساخ |
| CD19 | مستضد بالخليه المشتركة | التنمية بالخليه من الخلية برو-ب بلاستويد بالخليه والخلية بالبلازما | BV421 | 1 ميليلتر | HIB19 |
| CD3 | مستضد T الخلية المشتركة | اللمفاويات T والخلايا T القاتلة الطبيعية ونمو | V500 | 3 ميليلتر | UCHT1 |
| CD56 | الغليكوزيلاتي التصاق البروتين بشكل كبير | الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا T القاتلة الطبيعية | آسيا والمحيط الهادئ | 5 ميليلتر | HCD56 |
| خلايا CD4 | فوق عائلة Ig، النوع الأول بروتين سكري ترانسميمبراني | T الخلية مساعد، الثيموسيه، حيدات/الضامة، اكتب الخلايا T القاتلة الطبيعية ثانيا | Cy5.5 بيركب | 1 ميليلتر | الجيش الوطني الرواندي-T4 |
| CD8 | Α-وحدة فرعية مجمع بيموليكولار المرتبطة بثنائي كبريتيد | خلايا T سيتوتوكسيك، الثيموسيه، مجموعة فرعية من الخلايا القاتلة الطبيعية | آسيا والمحيط الهادئ-H7 | 2 ميليلتر | SK1 |
| CD45 | مستضد الكريات البيض شيوعاً | الكريات البيضاء البشرية كافة بما في ذلك الخلايا الليمفاوية ووحيدات، المحببة، الحمضات والثيموسيه | PE Cy7 | 1 ميليلتر | HI30 |
| المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية | - | - | - | 10 ميليلتر | - |
الجدول 2. كوكتيل لجسم نظام مراقبة الأصول الميدانية الفريق 2تحديد السكان خلية تي وب. كمية من الأجسام المضادة ووصف لتحليل عينة واحدة.
| لوحة بلعم | ||
| اسم البوابة | # الخلايا | % للعيش |
| خلايا مفردة | 183054 | |
| ويعيش | 10477 | 100 |
| CD45 | 4100 | 39.13 |
| تفريغ– | 771 | 7.36 |
| CD11C CD11B– + | 430 | 4.1 |
| CD11C+ CD11B+ | 104 | 0.99 |
| CD11C+ CD11Bمنخفضة/-- | 15 | 0.14 |
| تي خلية، ب-الخلية، الخلية ناغورني كاراباخ الفريق | ||
| اسم البوابة | #Cells | % للعيش |
| خلايا مفردة | 34616 | |
| ويعيش | 3728 | 100 |
| CD45+ | 1589 | 42.62 |
| ناغورني كاراباخ-الخلايا | 29 | 0.78 |
| CD3+ | 953 | 25.56 |
| خلايا CD4+ | 601 | 16.12 |
| CD8+ | 328 | 8.8 |
| CD19+ | 20 | 0.54 |
الجدول 3. الخلايا المناعية وفرة من أنواع مختلفة من الخلايا في ضريبة القيمة المضافة. عدد من الخلايا في كل باب، والنسبة المئوية لأنواع خلايا مختلفة استناداً إلى المبلغ الإجمالي للخلايا الحية.
Discussion
هذه الأساليب تصف كيفية عزل صندوق التبرعات الخاص من ضريبة القيمة المضافة وسبت وقياس الكميات النسبية للخلايا المناعية داخل هذه الأنسجة. وعلاوة على ذلك، الدولة الأساليب كيفية تحديد التعبير عن علامات على أنواع محددة من الخلايا.
التدفق الخلوي للخلايا المناعية الأنسجة تقنية قوية للنمط الظاهري حالة الأنسجة المناعية. التقدير الكمي للخلايا المناعية الأنسجة يمكن أن يكون العديد من التطبيقات. كما هو موضح في النتائج، فمن الممكن مقارنة وجود الخلايا المناعية المحددة بين مجموعات من المرضى (مثلاً، الهزيل مقابل السمنة). وبالإضافة إلى ذلك، خلال أداء التدفق الخلوي أيضا على دم المرضى نفسه، يمكن أن يحقق الرابطات بين تعميم خلايا الأنسجة والخلايا. مع هذا التطبيق، تمكنا من تحديد أن مجموعة فرعية معينة من تعميم وحيدات يرتبط مع CD11C برو--التهابات+ الأنسجة الدهنية الضامة16.
تعديلات على بروتوكول وصف ستوسع تطبيقاتها العديدة المتاحة أضداد الفلورسنت جعل التدفق الخلوي تنوعاً للغاية. مع الأجسام المضادة المختلفة يمكن التمييز بين ما يقرب من جميع أنواع الخلايا ويمكن الكشف عنها بالتعبير عن علامات كثيرة. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن وصمة عار علامات إينتراسيلولارلي من بيرميبيليزينج غشاء الخلية للسماح الربط داخل الخلايا من الأجسام المضادة الفلورسنت. تسمح هذه الخصائص تمييز السكان بلعم متنوعة جداً خارج المخططات بلعم M1 و M2 مبسطة أكثر من اللازم. وإلى جانب قياس التعبير علامة السطحية، يمكن الملون البروتينات (أي، السيتوكينات) إينتراسيلولارلي توفير معلومات حول وظيفة بلعم. وبالإضافة إلى ذلك، تستخدم علامات انتشار مثل Ki67 لقياس معدلات الانتشار. كما هو موضح، يستند التمييز بين وحدات تحكم المجال Dc والضامة مستويات مؤسسة مونتانيار علامات DC. علامة بلعم عامة، مثل CD68 يمكن إدراجها في لوحة بلعم (الفريق 1 من نظام مراقبة الأصول الميدانية). ومع ذلك، CD68 يحتاج إلى أن الملون بيرميبيليزيشن إينتراسيلولارلي التي تتطلب من غشاء الخلية التي ليست الأفضل، وأن تمديد البروتوكول. علامات بلعم الأخرى علامات فرعية مثل CD163 و CD206 أو CD11c، هذا الأخير يجري إدماجها في لوحة بلعم المعروضة هنا.
في لجاننا نظام مراقبة الأصول الميدانية، لم يدرج، علامة لتمييز الخلايا الحية والميتة التي سيكون من الأفضل لأنها تسمح استبعاد الخلايا الميتة أكثر دقة من استخدام منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب. وكثيراً ما يستخدم الحمض النووي تلطيخ صلاحية الأصباغ يوديد propidium (PI) أو 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، فضلا عن أمين الحرة رد فعل الأصباغ مثل لايف/الميت"يمكن حلها الميت خلية وصمة عار مجموعة"، ومتاح في ألوان صبغة مختلفة. ومع ذلك، لا يمكن استخدام PI و DAPI عند تحديد الخلايا. كما ورد في البروتوكول، تلطيخ البقاء حية/ميتة "يمكن حلها الأحمر الميت خلية" يمكن دمجها في كلا الفريقين دون التأثير على نظام مراقبة الأصول الميدانية الشاملة النابضة الاستراتيجية.
وبالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن البيانات كنسبة مئوية من الخلايا الحية يعني جميع البيانات النسبية. فقط عن طريق إدخال الضبط، يعرف عدد الخلايا في سيتوميتير التدفق، سيكون من الممكن لتحديد العدد الدقيق لكل نوع من الخلايا. يمكن أن تحسب عدد تقريبي للخلايا بعد عد الخلايا في كسر صندوق التبرعات الخاص باستخدام غرفة لعد الأصوات. ومع ذلك، سوف يكون هذا العدد إلى تعديل كمية الأنسجة خزعة المستخدمة لعزل صندوق التبرعات الخاص، لكن هذا القيود عند مقارنة الهزيل للسمنة في. كتلة مماثلة من السمنة لدى يتكون من أقل adipocytes أنها مليئة بالدهون وقد توسعت إلى حد كبير. يمكن أن يؤدي هذا إلى التقليل عدد الخلايا المناعية إذا قدمت كعدد الخلايا المناعية كل غرام من الساعة أو لكل adipocyte.
وعادة ما يتم إدراج المرضى في الدراسات الإنسانية، على مدى فترة أطول من الزمن مما يجعل توحيد الإجراءات التجريبية ذات أهمية كبيرة. للمقارنة بين بيانات التدفق الخلوي بين المرضى، وهناك العديد من الخيارات. كما هو موضح في هذا البروتوكول، يمكن أن تكون ثابتة الخلايا قبل القياس السماح بتحليل عدة عينات في نفس اليوم. يمكن أن يتحقق هذا أيضا بتجميد صندوق التبرعات الخاص قبل تلطيخ لهم، مما يسمح للإجراء المصبوغة بتكون متساوية بين جميع العينات، ولكن يمكن أن تتأثر صلاحية الخلايا. وأخيراً، كما استخدمت في هذه الدراسة، الخرز الفلورسنت لتثبيت مستويات التعويض، واستخدمت cytometer تتبع الخرز مرتين أسبوعيا لتوحيد القياسات اليومية سيتوميتير. هذا الخيار الأخير هو الأكثر فعالية عندما قياس العينات المأخوذة من دراسة تمتد فترة طويلة من الزمن.
عاملاً مقيداً للتدفق الخلوي بشكل عام هو استخدام الفلورية. عدد التسميات الفلورسنت يمكن الكشف عنها في وقت واحد محدودة بسبب التداخل في أطياف الانبعاث. ومع ذلك، مع التنمية لوحة نظام مراقبة الأصول الميدانية الذكية واستخدام عدة زجاجات جسم كل ضريبة القيمة المضافة أو عينة جلس، هذه المسألة يمكن التغلب عليها كما هو موضح في هذا البروتوكول. هو جانبا مهما من نظام مراقبة الأصول الميدانية فريق التنمية FMO عناصر التحكم. باستخدام جميع الأجسام المضادة للفريق باستثناء واحدة، يمكن تقدير مستويات أوتوفلوريسسينسي المحتملة عند مقارنة FMO مع الفريق كامل. يسمح هذا النابضة دقيقة من السكان، وينبغي أن يقوم هذه الإجراءات عند إعداد لوحة نظام مراقبة الأصول الميدانية جديدة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اكتشاف الأجيال الجديدة من أجهزة نظام مراقبة الأصول الميدانية المعلمات يصل إلى 50 السماح الكشف المتزامن للعديد من الخصائص لكل خلية. هناك مسألة أخرى تتصل بالجانب المتعلق بالأسفار هو أوتوفلوريسسينسي الخلايا، ولا سيما الضامة. بعد الإثارة للخلايا مع الليزر نظام مراقبة الأصول الميدانية (أساسا مع الإثارة الطول الموجي نانومتر 488)، تنبعث هذه الخلايا إشارة فلورسنت (أساسا < 640 nm) الذي يمكن تسميتها التداخل مع أطياف الانبعاث من الجسم17،18. لحساب هذا، ينبغي قياس الخلايا أونستينيد لتحديد أوتوفلوريسسينسي في كل قناة. مع هذه المعرفة، ينبغي اختيار فلوروتشروميس التي تعرض قوة إشارة التي يتجاوز إشارة أوتوفلوريسسينت. وينبغي مراعاة هذه الإشارات الخلفية أوتوفلوريسسينت عند تحديد استراتيجية النابضة للسكان. لذلك، قبل تطبيق هذا البروتوكول ونظام مراقبة الأصول الميدانية فريق التصميم الذكي الممكن في عمق النمط الظاهري بلعم الأنواع الفرعية. لدى متميزة جديدة يمكن أن توصف بالضامة ووظيفتها.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر J. van de جار وفرومين م. (جامعة ماستريخت، هولندا) لتقديم الدعم التقني لهم. وبالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر ك. فيربوفين، "دال هانسن"، J. جوكين، وبلاك هاء-توفير عينة الدم والأنسجة المستخدمة لإعداد هذا البروتوكول والتجارب اللاحقة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
| Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
| Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
| DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
| NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
| NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
| 200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
| 70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
| Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
| Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
| CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
| CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
| CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
| CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
| CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
| CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
| CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
| CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
| CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
| CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
| CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
| CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
| CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
| CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
| FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
| 96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
| PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
| FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
| IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
| Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
| LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
| IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |
References
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, immunity, and metabolic disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines. ISRN Inflamm. 2013, 139239 (2013).
- DeFuria, J., et al. B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).
- Han, J. M., Levings, M. K. Immune regulation in obesity-associated adipose inflammation. J Immunol. 191 (2), 527-532 (2013).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nat Med. 15 (8), 940-945 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nat Med. 15 (8), 914-920 (2009).
- Koh, Y. J., et al. Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (5), 1141-1150 (2011).
- Peinado, J. R., et al. The stromal-vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots. Proteomics. 10 (18), 3356-3366 (2010).
- Leggate, M., et al. Determination of inflammatory and prominent proteomic changes in plasma and adipose tissue after high-intensity intermittent training in overweight and obese males. Journal of Applied Physiology. 112 (8), 1353-1360 (2012).
- Divoux, A., et al. Mast cells in human adipose tissue: link with morbid obesity, inflammatory status, and diabetes. J Clin Endocrinol Metab. 97 (9), E1677-E1685 (2012).
- Harford, K. A., Reynolds, C. M., McGillicuddy, F. C., Roche, H. M. Fats, inflammation and insulin resistance: insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue. Proc Nutr Soc. 70 (4), 408-417 (2011).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
- Morris, D. L., Singer, K., Lumeng, C. N. Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14 (4), 341-346 (2011).
- Wentworth, J. M., et al. Pro-inflammatory CD11c+CD206+ adipose tissue macrophages are associated with insulin resistance in human obesity. Diabetes. 59 (7), 1648-1656 (2010).
- Wouters, K., et al. Circulating classical monocytes are associated with CD11c+ macrophages in human visceral adipose tissue. Sci Rep. 7, 42665 (2017).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. J Immunol. 189 (2), 946-955 (2012).
- Li, F., et al. Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry. J Immunol Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).
