本文介绍了一种用流式细胞仪从脂肪组织中分离免疫细胞来分析脂肪组织免疫细胞含量的方法和后续分析。
在皮下和内脏脂肪组织中的免疫细胞浸润会导致低级别炎症, 导致肥胖相关并发症 (如2型糖尿病) 的发展。为了定量和定性地研究人体内的免疫细胞亚群, 我们开发了一种流式细胞仪方法。基质血管分数 (SVF), 含有免疫细胞, 从皮下和内脏在活检的胶原酶消化分离。脂肪细胞在离心后被除去。用流式细胞仪对 SVF 细胞进行染色, 筛选出多种膜结合标记, 以区分免疫细胞亚群和分析。由于这种方法, 可以检测和量化抗炎巨噬细胞亚群、树突状体细胞 (DCs)、B 细胞、CD4+和 CD8+ T 细胞以及 NK 细胞。此方法提供有关免疫细胞的详细信息, 以及每个特定子集的数量。由于有许多荧光抗体可用, 我们的流式细胞术方法可以调整, 以测量各种其他细胞和细胞内的标记感兴趣。
肥胖的特点是低品位的炎症1和浸润炎症免疫细胞在内脏和皮下 (增值税, sAT)。在增值税中积累的亲炎症免疫细胞导致胰岛素抵抗, 这是发展2型糖尿病的主要危险因素2。免疫细胞的先天和自适应免疫系统是发现在肥胖的, 如巨噬细胞, 肥大单元格, 中性白细胞, CD4+和 CD8+ T 细胞, B 细胞3,4,5,6 ,7。这些免疫细胞, 连同内皮细胞, 基质细胞, 脂肪胞祖, 成纤维细胞, 和毛细血管, 构成了 SVF8 , 是在9的促炎物质的主要来源。
通常由西方印迹10、qPCR11和免疫组化11等技术对 AT 的炎症状态进行调查。然而, 当使用这些技术时, 整个在, 脂肪细胞和 SVF, 使用。这使得很难确定在中存在的免疫细胞的数量和子集。免疫细胞有各种细胞标记来定义和分类它们, 如巨噬细胞。巨噬细胞在功能和细胞表面标记表达式12中显示显著的异质性。因此, 它们通常被归类为两个巨噬细胞群: M1 和 M2。M2 巨噬细胞通常被称为交替激活的巨噬细胞12,13并且居住在稀薄, 新陈代谢的正常人14。然而, 在肥胖期间, 一个表型开关发生从 M2 巨噬细胞到 M1 巨噬细胞。这些经典活化 M1 巨噬细胞表达 CD11C12和堆积在死脂肪体形成冠状结构13。它已经表明, CD11C+巨噬细胞在损害胰岛素的作用, 并与胰岛素抵抗在肥胖的人15。为了识别 M1 和 M2 巨噬细胞, 免疫组化是一种选择。该技术提供了有关组织中巨噬细胞位置的信息。但是, 它将限制可用于一个染色的标记的数量。此外, 也难以量化。因此, 为了研究不同的免疫细胞亚群在增值税和 sAT 存款, 我们开发了流式细胞术的方法。这种方法使我们有机会使用多个标记每个细胞与一个流式细胞分析, 以定义细胞子集和计数的每个子集存在的在存款。
这些方法描述如何分离 SVF 从增值税和 sAT 和量化的相对数量的免疫细胞在这些组织。此外, 这些方法还说明了如何确定特定单元格类型上标记的表达式。
组织免疫细胞的流式细胞术是一种有效的方法, 用于表型免疫状态的组织。组织免疫细胞的量化可以有许多应用。如结果所述, 有可能比较特定免疫细胞在患者组 (例如、瘦肉型与肥胖症) 之间的存在。此外, 通过对同一患者的血液进行流式细胞术, 可以研究循环细胞与组织细胞之间的关联。通过这个应用, 我们能够确定循环单核细胞的特定子集与亲炎性 CD11C+脂肪组织巨噬细胞16有关。
对所描述的协议的调整将扩展其应用, 因为许多可用的荧光抗体使流式细胞仪非常多才多艺。与不同的抗体几乎所有细胞类型可以区分和许多标记的表示可以被发现。此外, 还可以通过 permeabilizing 细胞膜来染色标记 intracellularly, 以允许荧光抗体的细胞内结合。这些特征允许不同的巨噬细胞种群以外的过度简化 M1 和 M2 巨噬细胞亚型。除了测量表面标记的表达, 蛋白质 (即, 细胞因子) 可以被染色 intracellularly 提供有关巨噬细胞功能的信息。此外, Ki67 等扩散标记用于量化扩散率。如所述, 巨噬细胞与 DCs 之间的区别是基于多边居民的 DC 标记水平。一般的巨噬细胞标记, 如 CD68 可以并入巨噬细胞面板 (1)。然而, CD68 需要染色 intracellularly 需要通透的细胞膜, 这是不可取的, 并将延长议定书。其他巨噬细胞标记是子集标记例如 CD163 和 CD206 或 CD11c, 后者被集成在这里提出的巨噬细胞小组。
在我们的外地管制小组中, 没有包括一个区分活细胞和死体细胞的标记, 这是可取的, 因为它允许比使用 FSC 和 SSC 更准确地排除死细胞。经常使用的是脱氧核糖核酸染色活性染料碘碘化物 (PI) 或 4 ‘, 6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI) 并且自由胺反应染料例如活/死可修复的死细胞染色套件, 在不同的染料颜色可以使用。但是, 在修复单元格时不能使用 PI 和 DAPI。如《议定书》所述, 活/死可修复的红死细胞生存能力染色可以集成到两个面板中, 而不影响总的外地方案的门控策略。
此外, 数据表示为活细胞的百分比, 这意味着所有数据都是相对的。只有在流式细胞仪中输入确切的已知数目的单元格, 才能确定每个细胞类型的确切数字。在用计数室计算 SVF 分数中的细胞数后, 可以计算出细胞的近似数目。然而, 这个数字将不得不调整, 以用于隔离 SVF 的活检组织的数量, 但这有限制, 当比较瘦与肥胖。类似的肥胖人群中含有较少的脂肪细胞, 因为它们充满了脂质, 并大大扩大。这可能导致对免疫细胞数的低估, 如果提出作为免疫细胞的数量每克的在或每个脂肪。
在人类研究中, 纳入患者通常是在较长时间内进行标准化实验程序的重要意义。为比较患者之间的流式细胞仪数据, 有多种选择。如本协议所述, 在测量前可以对单元格进行固定, 以便在同一天对多个样本进行分析。这也可以通过冷冻 SVF 之前的染色, 这使得染色程序是平等的所有样本, 但细胞的生存能力可能受到影响。最后, 在本研究中, 还使用了荧光珠来安装补偿水平, 并采用了双周细胞仪跟踪珠来规范细胞仪的日常测量。这最后一个选择是最有效的测量样本从一项研究跨越了很长一段时间。
流式细胞术的限制因素一般是荧光的使用。可同时检测到的荧光标签数量因发射谱重叠而受到限制。然而, 通过智能化的流式仪表板开发和使用每个增值税或 sAT 样本的几个抗体鸡尾酒, 这个问题可以解决, 如本议定书所述。FMO 控制是资产管制系统面板开发的一个重要方面。通过使用该面板的所有抗体, 除了一个, 可以欣赏的潜在的自发荧光水平, 当比较 FMO 与整个面板。这样就可以精确地对人群进行浇口, 在设置新的 “流控流” 面板时应执行这些步骤。此外, 新一代的资产管制装置可以检测多达50个参数, 允许同时检测每个单元格的许多特性。另一个与荧光方面有关的问题是细胞的自体荧光, 特别是巨细胞。在细胞的励磁作用下激光 (主要与488毫微米波长励磁), 这些细胞发出一个荧光信号 (主要 < 640 毫微米) 可以重叠与抗体标签的发射光谱17,18。为此, 应测量无瑕细胞, 以确定每个通道中的自发荧光。有了这些知识, 荧光应该被选中, 显示超过 autofluorescent 信号的信号强度。在确定人群的门控策略时, 应考虑到 autofluorescent 的背景信号。因此, 通过本协议的应用和智能化的资产管制面板设计, 可以深入研究表型巨噬细胞子类型。新的不同在巨噬细胞和他们的作用可以描绘。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢 J. Gaar 和 m. Vroomen (荷兰马斯特里赫特大学) 的技术支持。此外, 我们还要感谢 k. Verboven、汉森、j. Jocken 和 e Blaak 提供用于建立本议定书和随后的实验的血液和组织活检。
Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |