Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Immunzelle Inhalt des Fettgewebes durch Isolierung der Immunzellen aus Fettgewebe und anschließende Analyse mit Durchflusszytometrie zu analysieren.
Infiltration von Immunzellen in das subkutane und viszeralen Fettgewebe (AT) Ablagerungen führt zu einer minderwertigen Entzündung einen Beitrag zur Entwicklung der Adipositas-assoziierten Komplikationen wie Typ-2-Diabetes. Um quantitativ und qualitativ die Immunzelle Teilmengen in menschlichen auf Einlagen zu untersuchen, haben wir einen Flow Cytometry Ansatz entwickelt. Die stromale vaskuläre Fraktion (SVF), mit der Immunzellen ist von subkutanem und viszeralem bei Biopsien von Kollagenase Verdauung isoliert. Fettzellen werden nach der Zentrifugierung entfernt. Die SVF-Zellen sind für mehrere Membrane-springen-Marker zur Unterscheidung zwischen Immunzellen Teilmengen ausgewählt und mittels Durchflusszytometrie analysiert gefärbt. Als Ergebnis dieses Ansatzes pro- und antiinflammatorische Makrophagen Teilmengen, dendritische Zellen (DCs), B-Zellen, CD4+ und CD8+ T-Zellen und NK-Zellen erkannt und quantifiziert werden können. Diese Methode gibt detaillierte Informationen über Immunzellen im AT und die Höhe der jeweils spezifischen Teilmenge. Da gibt es zahlreiche fluoreszierende Antikörper zur Verfügung, kann unser Flow Cytometry Ansatz zur Messung der verschiedenen anderen zellulären und intrazellulären Marker von Interesse eingestellt werden.
Adipositas ist gekennzeichnet mit Low-Grade AT Entzündung1 und Infiltration von Pro-inflammatorischen Immunzellen im viszeralen und subkutanen an (MwSt., saß). Ansammlung von Pro-inflammatorischen Immunzellen in den Bottich führt zu einer Insulinresistenz ist ein primärer Risikofaktor für die Entwicklung von Typ-2-Diabetes-2. Immunzellen der angeborenen und der adaptiven Immunsystems befinden sich in der übergewichtige, wie Makrophagen, Mastzellen, Neutrophile, CD4+ und CD8+ T-Zellen und B-Zellen3,4,5,6 ,7. Diese Immunzellen zusammen mit Endothelzellen, stromale Zellen Adipocyte Stammväter, Fibroblasten und Perizyten, bilden die SVF-8 und sind die wichtigste Quelle von Pro-inflammatorischen Substanzen im AT9.
Der Entzündungsstatus AT wird häufig durch Techniken einschließlich Western-Blot10, qPCR11und Immunohistochemistry11untersucht. Jedoch ist bei der Verwendung dieser Techniken, die gesamte AT, Adipozyten und SVF verwendet. Dies macht es schwierig zu bestimmen, die Menge und Teilmengen von Immunzellen in der AT vorhanden. Immunzellen haben verschiedene Zelle Marker zu definieren und zu kategorisieren, wie z. B. Makrophagen. Makrophagen zeigen erhebliche Heterogenität in Funktion und Zelle Oberfläche Marker Ausdruck12. Daher sind sie oft in zwei Populationen von Makrophagen kategorisiert: M1 und M2. M2-Makrophagen nennt man in der Regel Alternativ aktivierten Makrophagen12,13 und befinden sich in der schlanken, metabolisch normale Menschen14. Tritt jedoch bei Übergewicht, ein phänotypische Schalter von M2-Makrophagen, M1 Makrophagen. Diese aktiviert klassisch M1 Makrophagen express CD11C12 und reichern sich um tote Adipozyten, Krone-artige Strukturen13zu bilden. Es hat sich gezeigt, dass CD11C+ Makrophagen in der Insulinwirkung beeinträchtigen und Insulinresistenz bei adipösen Menschen15zugeordnet sind. Immunohistochemistry ist zur Erkennung von M1 und M2-Makrophagen im AT eine Option. Diese Technik bietet Informationen über den Standort von den Makrophagen im Gewebe. Allerdings schränkt es die Anzahl der Markierungen, die in einer Färbung verwendet werden können. Darüber hinaus ist es auch schwierig zu quantifizieren. Um die verschiedenen Immunzellen Teilmengen in der Mehrwertsteuer und sAT Einlagen zu untersuchen, haben wir daher einen Flow Cytometry Ansatz entwickelt. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, mehrere Markierungen pro Zelle mit einem Flow-Zytometrie-Analyse zu Zelle Teilmengen zu definieren und zählen die Anzahl der einzelnen Untergruppen in den AT-Ablagerungen vorhanden.
Diese Methoden beschreiben, wie die SVF von der Mehrwertsteuer zu isolieren und saß und die relativen Mengen von Immunzellen in diesen Geweben zu quantifizieren. Darüber hinaus geben die Methoden wie die Expression von Markern auf bestimmte Zelltypen zu bestimmen.
Durchflusszytometrie von Immunzellen Gewebe ist eine leistungsfähige Technik für Phänotyp der immunologischen Zustand der Gewebe. Die Quantifizierung der Gewebe Immunzellen kann viele Anwendungen haben. Wie in den Ergebnissen beschrieben, ist es möglich, das Vorhandensein von bestimmten Immunzellen zwischen Gruppen von Patienten (z.B.mageres vs. fettleibig) zu vergleichen. Darüber hinaus können indem auch die Durchflusszytometrie auf Blut von den gleichen Patienten, Assoziationen zwischen zirkulierenden Zellen und Gewebe untersucht werden. Mit dieser Anwendung konnten wir feststellen, dass eine bestimmte Teilmenge der zirkulierenden Monozyten mit Pro-inflammatorischen CD11C verbunden ist+ Fettgewebe Makrophagen16.
Anpassungen des beschriebenen Protokolls werden ihre Anwendungen erweitern, wie zahlreiche verfügbare fluoreszierende Antikörper Durchflusszytometrie sehr vielseitig machen. Mit verschiedenen Antikörpern lassen sich fast alle Zelltypen unterscheiden und der Ausdruck der vielen Marker detektiert werden. Darüber hinaus ist es möglich, Marker intrazellulär zu beflecken, durch permeabilizing der Zellmembran intrazelluläre Bindung von fluoreszierenden Antikörpern zu ermöglichen. Diese Eigenschaften erlauben Unterscheidung der unterschiedlichsten Makrophagen Bevölkerungen über die übermäßig vereinfachten M1 und M2-Makrophagen-Subtypen. Neben der Messung der Oberfläche Marker Ausdruck können Proteine (z.B. Zytokine) intrazellulär mit Informationen über Makrophagen Funktionalität befleckt werden. Darüber hinaus werden Proliferationsmarker wie Ki67 zur Verbreitung Preise zu quantifizieren. Wie beschrieben, basierte Unterscheidung zwischen Makrophagen und DCs auf MFI Ebenen der DC-Marker. Ein allgemeine Makrophagen Marker, wie CD68 kann die Makrophagen-Panel (FACS-Panel 1) integriert werden. CD68 muss jedoch intrazellulär erfordern Permeabilisierung der Zellmembran befleckt werden, das ist nicht besser und das Protokoll erweitern würde. Weitere Makrophagen-Marker sind Teilmenge Markierungen wie CD163 und CD206 oder CD11c, letztere in der hier vorgestellten Makrophagen-Panel integriert.
In unseren FACS-Panels, ein Marker, lebende und tote Zellen zu unterscheiden wurde nicht aufgenommen, was wäre vorzuziehen, weil es einen genauere Ausschluss von abgestorbenen Zellen als die Verwendung von FSC und SSC ermöglicht. Häufig sind die DNA Färbung, Lebensfähigkeit Farbstoffe Propidium Jodid (PI) oder 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) sowie freie Amin reagiert Farbstoffe wie die LIVE/DEAD fixierbar tote Zelle färben Kit, die in verschiedenen Dye Farben erhältlich. Jedoch kann nicht PI und DAPI verwendet werden, wenn die Zellen zu fixieren. Wie im Protokoll beschrieben, die LIVE/DEAD fixierbar Red Dead Cell Lebensfähigkeit Färbung in beide Platten integrierbar ohne Auswirkungen auf die gesamte FACS Anspritzung Strategie.
Darüber hinaus werden die Daten ausgedrückt als Prozentsatz der lebenden Zellen, was bedeutet, dass alle Daten sind relativ. Nur durch Eingabe einer genauen, wäre bekannt, Anzahl der Zellen in das Durchflusszytometer es möglich die genauen Zahlen der einzelnen Zelle bestimmen. Eine ungefähre Anzahl von Zellen konnte nach dem zählen der Zellen in der SVF-Fraktion mithilfe einer Zählkammer berechnet werden. Diese Zahl müsste für die Höhe der Biopsie Gewebe verwendet, um die SVF isolieren angepasst werden, aber dies hat Einschränkungen beim lehnen zu fettleibig zu vergleichen. Eine ähnliche Masse von adipösen AT besteht aus weniger Fettzellen, wie sie mit Lipiden gefüllt sind und stark erweitert haben. Dies führe zu einer Unterschätzung der Immunzelle Zahl wenn als Anzahl der Immunzellen pro Gramm bei oder Adipocyte dargestellt.
In Humanstudien erfolgt Einbeziehung von Patienten in der Regel über einen längeren Zeitraum hinweg machen Standardisierung von experimentellen Verfahren von großer Bedeutung. Für den Vergleich von Flow Cytometry Daten zwischen Patienten gibt es mehrere Möglichkeiten. Wie in diesem Protokoll beschrieben, können Zellen vor der Messung erlaubt die Analyse von mehreren Proben am gleichen Tag behoben werden. Dies kann auch erreicht werden, durch das Einfrieren der SVF, bevor sie beflecken, wodurch das Färbeverfahren zwischen allen Proben gleich sein, aber die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt werden könnte. Zu guter Letzt auch in dieser Studie beschäftigt, fluoreszierende Perlen Vergütungsstufen zu installieren sind und Cytometer Tracking Perlen wurden zweimal wöchentlich verwendet, um tägliche Messungen der Cytometer standardisieren. Diese letzte Option ist die effizienteste beim Ausmessen von Proben aus einer Studie, die über einen langen Zeitraum hinweg.
Ein limitierender Faktor für Durchflusszytometrie ist im Allgemeinen die Verwendung der Fluoreszenz. Die Anzahl der Fluoreszenzmarkierungen, die gleichzeitig erkannt werden können ist begrenzt durch Überlappung in Emissionsspektren. Jedoch kann mit smart FACS-Panel-Entwicklung und den Einsatz von mehrere Antikörper Cocktails pro MwSt oder sAT Probe, dieses Problem überwinden, wie in diesem Protokoll beschrieben. Ein wichtiger Aspekt der FACS-Panel-Entwicklung ist FMO Kontrollen. Mithilfe des Fensters mit einer Ausnahme alle Antikörper können potenzielle Autofluoreszenz Ebenen beim Vergleich der FMO mit Vollelement geschätzt werden. Dies ermöglicht genaue Anspritzung von Populationen und diese Verfahren durchgeführt werden, wenn Sie ein neues FACS-Panel einrichten. Darüber hinaus können neue Generationen von FACS-Geräte bis zu 50 Parameter ermöglicht simultane Detektion von vielen Merkmalen pro Zelle erkennen. Ein weiteres Problem im Zusammenhang mit der Fluoreszenz-Aspekt ist die Autofluoreszenz der Zellen, insbesondere Makrophagen. Nach Anregung der Zellen mit dem FACS-Laser (vor allem mit 488 nm Wellenlänge Anregung), diese Zellen emittieren ein Fluoreszenzsignal (hauptsächlich < 640 nm), dass können Überschneidungen mit den Emissions-Spektren des Antikörpers Etiketten17,18. Um dies zu berücksichtigen, sollte ungefärbte Zellen gemessen werden, um festzustellen, die Autofluoreszenz in jedem Kanal. Mit diesem wissen sollten Fluorochromes ausgewählt werden, in denen eine Signalstärke angezeigt, die das Autofluorescent Signal. Diese Autofluorescent Hintergrundsignal sollte bei der Festlegung die gating-Strategie der Bevölkerung berücksichtigt werden. Durch Anwendung dieses Protokolls und intelligente FACS-Panel-Design ist es deshalb möglich, in Tiefe Phänotyp Makrophagen Subtypen. Neue eindeutige AT Makrophagen und deren Funktion charakterisiert werden können.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten danken J. van de Steuervermeidung und M. Vroomen (Universität Maastricht, Niederlande), für die technische Unterstützung. Darüber hinaus möchten wir K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, danken und E. Blaak für die Bereitstellung von Blut und Gewebe-Biopsien zum Einrichten dieses Protokolls und der nachfolgenden Experimente verwendet.
Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |