이 문서에서는 지방 조직 및 cytometry 사용 하 여 이후 분석에서 면역 세포의 고립에 의해 지방 조직의 면역 세포 콘텐츠를 분석 하는 방법을 설명 합니다.
(에) 예금 피하와 내장 지방 조직에서 면역 세포의 침투 타입 2 당뇨병과 같은 비만 관련 합병증의 발전에 기여 낮은 학년 염증 이끌어 낸다. 양적 및 질적 조사 예금에서 인간의 면역 세포 부분 집합, 교류 cytometry 방법을 개발 했습니다. Stromal 혈관 분수 (SVF), 면역 세포를 포함 하는 피하와 내장 biopsies에 콜라 소화에 의해 격리 됩니다. Adipocytes 원심 분리 후 제거 됩니다. SVF 세포는 여러 막 바운드 마커 면역 세포 하위 구분을 선택 하 고 cytometry 사용 하 여 분석에 대 한 스테인드. 이 방법은, 프로 및 안티 inflammatory macrophage 하위 결과로 수지상 세포 (DCs), B-세포, CD4+ 와 CD8+ T-세포, NK 세포 수 있습니다 감지 하 고 계량. 이 메서드는 AT에 면역 세포 및 각 특정 하위 집합에 대 한 자세한 정보를 제공합니다. 이후에 사용할 수 있는 수많은 형광 항 체는, 우리의 교류 cytometry 방법은 측정 하는 다양 한 다른 세포와 세포내 표식 관심을 조정할 수 있습니다.
비만 저급에 특징은 염증1 과 (부가 가치세, 토)에 내장 및 피하 프로-염증 성 면역 세포의 침투. 부가 가치세에 프로-염증 성 면역 세포의 축적은 유형 2 당뇨병2개발을 위한 기본 위험 요소는 인슐린 저항 이끌어 낸다. 모두 타고 난 및 적응형 면역 시스템의 면역 세포 CD4 세포, 돛대 세포, 호 중구, 비만 발견 된다+ 와 CD8+ T-세포와 B 세포3,,45,6 ,7. 이러한 면역 세포, 내 피 세포, stromal 세포, 체형 창시자, 섬유 아 세포, 및 pericytes, SVF8 구성 되며 AT9프로-염증 성 물질의 주요 소스.
염증 상태는 일반적으로 서쪽 오 점10, immunohistochemistry11, 정량11, 등 기법에 의해 조사 하 고 있다. 그러나, 이러한 기술을, 전체에, adipocytes, 및 SVF를 사용할 때 사용 됩니다. 이 어렵게 금액 및 면역 세포에는 AT의 하위 집합을 결정 합니다. 면역 세포는 다양 한 세포 마커를 정의 하 고 대 식 세포와 같은 그들을 분류. 대 식 세포 기능 및 세포 표면 마커 식12에 중요 한이 표시합니다. 따라서, 그들은 종종 두 대 식 세포 인구로 분류 됩니다: M1 및 m 2. M2 세포는 일반적으로 또는 활성화 된 대 식 세포12,13 불리고, metabolically 정상적인 인간14AT에. 그러나, 비만, 동안 phenotypic 스위치에 발생 합니다 M2 세포에서 m 1 대 식 세포. 이러한 고전적인 M1 세포 CD11C12 를 표현 하 고 왕관 모양의 구조13를 죽은 adipocytes 주위 축적을 활성화. 그것은 그 CD11C+ AT에서 대 식 세포 인슐린 활동을 손상 하 고 뚱뚱한 인간15에 인슐린 저항와 관련. M1 및 m 2는 AT에서 대 식 세포를 식별 하려면 immunohistochemistry 옵션입니다. 이 기술은 조직의 대 식 세포의 위치에 대 한 정보를 제공합니다. 그러나, 그것은 하나의 얼룩에 사용할 수 있는 표시의 수를 제한 합니다. 또한, 그것은 또한 계량 어렵다입니다. 따라서, 부가 가치세 및 토 예금 다른 면역 세포 하위 집합을 조사 하는 교류 cytometry 방법을 개발 했습니다. 이 이렇게 우리가 하나의 흐름 cytometry 분석 셀 당 여러 개의 마커를 사용 하 여 셀의 하위 집합을 정의 하 고 각 하위 집합에 예금에의 숫자를 계산 하는 기회를 제공 합니다.
이러한 방법을 부가 가치세에서 SVF를 분리 하는 방법을 설명 하 고 앉아서이 조직 내의 면역 세포의 상대적인 양을 계량. 또한, 메서드 상태 마커 특정 세포 유형에의 식을 결정 하는 방법.
Cytometry 조직 면역 세포의 표현 형의 조직 면역 상태에 강력한 기술입니다. 조직 면역 세포의 정량화는 많은 응용 프로그램을 가질 수 있습니다. 결과에 설명 된 대로 (예를 들어, 상체 비만 대) 환자의 그룹 사이 특정 면역 세포의 존재를 비교 가능 하다. 더하여, 또한 동일한 환자의 혈액에서 cytometry 수행, 순환 세포 및 조직 세포 사이 협회를 조사 수 있습니다. 이 응용과 더불어 우리 monocytes 순환의 특정 하위 집합은 연관-프로-염증 성 CD11C 확인할 수 있었다+ 지방 조직 세포16.
설명된 프로토콜을 조정 cytometry 수많은 사용 가능한 형광 항 체에 게 매우 다양 한 응용 프로그램을 확장 됩니다. 다른 항 체와 함께 거의 모든 셀 유형을 구분할 수 있습니다 그리고 많은 마커의 식 검출 될 수 있다. 또한, 형광 항 체의 세포내 바인딩 수 있도록 세포 막 permeabilizing 여 침 마커 얼룩을 가능 하다. 이러한 특성 지나치게 단순화 된 M1 및 M2 macrophage 하위 넘어 매우 다양 한 대 식 세포 인구의 구별 하실 수 있습니다. 표면 마커 식의 측정, 외 단백질 (즉, cytokines) 침 대 식 세포 기능에 정보를 제공 하는 얼룩이 수 있다. 또한, Ki67 같은 확산 마커는 확산 속도 계량 하는 데 사용 됩니다. 설명, 대 식 세포와 Dc 사이 구별 DC 마커의 MFI 수준에 근거 했다. 일반적인 대 식 세포 마커, CD68 등 macrophage 패널 (FACS 패널 1)에 통합할 수 있습니다. 그러나, CD68이 바람직합니다 하 고 프로토콜을 확장할 것 이다 세포 막의 침 필요한 permeabilization 스테인드 될 필요가 있다. 다른 대 식 세포 마커는 CD163 및 CD206 등 CD11c, 여기에 제시 된 macrophage 패널에 후자 되 고 통합 하위 집합 마커.
우리의 FACS 패널에서 라이브 하 고 죽은 세포를 구별 하는 마커는 포함, FSC 그리고 SSC의 사용 보다는 죽은 세포의 더 정확한 배제를 허용 하기 때문에 더 좋을 것 이다. 자주 사용 되는 DNA 얼룩 생존 염료 propidium 요오드 화물 (PI) 또는 4′ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 뿐 아니라, 자유로운 아민 반응 라이브/죽은 고칠 수 죽은 세포 얼룩 키트, 같은 염료는 다른 염료 색상에서 사용할 수 있습니다. 그러나, PI와 DAPI 사용할 수 없습니다 셀을 수정 하는 경우. 프로토콜에 설명 된 대로 라이브/죽은 고칠 수 레드 죽은 세포 생존 얼룩 수 있습니다 통합할 수 두 패널 전략 게이팅 전반적인 FACS를 영향을 주지 않고.
또한, 데이터는 라이브 셀 모든 데이터는 상대적 의미의 백분율로 표현 됩니다. 만 입력 하 여 일치, 교류 cytometer로 셀의 수를 알려진 그것 것입니다 각 세포 종류의 정확한 숫자를 확인할 수 있습니다. 셀의 대략적인 수 세 챔버를 사용 하 여 SVF 분수에 셀 계산 후 계산 수 있습니다. 그러나,이 숫자는 SVF를 격리 하는 데 사용 하는 생 검 조직 양을 조정 해야 했 상체에 비만을 비교할 때이 제한이 있다. 유사한 질량의 비만 덜 adipocytes 지질으로 채워진다 고 크게 확대 구성 되어 있습니다. 이 면역 세포에의 그램 당 또는 당 체형의 수로 제시 하는 경우 면역 세포 수의 과소 발생할 수 있습니다.
인간 연구에서 환자의 포함 매우 중요 실험 절차의 표준화를 만드는 시간의 긴 기간 동안 일반적으로 수행 됩니다. 환자 간에 교류 cytometry 데이터의 비교에 대 한 몇 가지 옵션이 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 된 대로 셀 같은 날에 여러 샘플의 분석을 허용 하는 측정 하기 전에 해결할 수 있습니다. 이 전에 모든 샘플 사이 얼룩 프로시저 수 있습니다 그들을 얼룩, 세포의 생존 능력에 영향을 받을 수는 SVF를 동결 하 여 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 또한이 연구에서 채택, 형광 구슬 보상 수준, 설치 그리고 cytometer 추적 비즈는 cytometer의 매일 측정 표준화 격주 사용 했다. 이 마지막 옵션은 가장 효율적인 때 오랜 기간에 걸친 연구에서 샘플을 측정.
Cytometry에 대 한 제한 요소는 일반적으로 형광의 사용 이다. 동시에 검출 될 수 있는 형광 레이블 수 방출 스펙트럼에 중복으로 인해 제한 됩니다. 그러나, 스마트 FACS 패널 개발 및 부가 가치세 또는 토 샘플 당 여러 항 체 칵테일의 사용이이 문제 극복할 수 있습니다이 프로토콜에서 설명 된 대로. FACS 패널 개발의 중요 한 측면은 FMO 컨트롤. 하나를 제외 하 고 패널의 모든 항 체를 사용 하 여 전체 패널 FMO 비교할 때 잠재적인 autofluorescence 레벨을 감상할 수 있습니다. 이 인구의 정확한 게이팅 있으며 새로운 FACS 패널을 설정할 때이 절차를 수행 해야 합니다. 또한, FACS 장치의 새로운 세대 셀 마다 많은 특성의 동시 탐지를 허용 하는 최대 50 매개 변수를 검색할 수 있습니다. 형광 측면에 관련 된 또 다른 문제는 세포, 특히 세포의 autofluorescence. (488 nm 파장 여기)와 주로 FACS 레이저 셀의 여기, 후이 세포 형광 신호를 방출 (주로 < 640 nm) 그 수는 항 체의 방출 스펙트럼과 중복 레이블17,18. 이 계정, 흠 없는 세포 각 채널에 autofluorescence를 결정 하기 위해 측정 되어야 한다. 이 지식으로 형광 선정 되어야 한다 autofluorescent 신호를 초과 하는 신호 강도 표시 하는. 이 autofluorescent 배경 신호는 인구 제어 전략을 결정할 때 계정에 취해야 한다. 따라서이 프로토콜 및 지능형 FACS 패널 디자인의 응용 프로그램에 의해 그것은 깊이 형 macrophage 하위에 수 있습니다. 새로운 고유에 대 식 세포 및 그들의 기능을 나타낼 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그들의 기술 지원에 대 한 제이 밴 드 Gaar M. Vroomen (마스트리히트 대학, 네덜란드)를 감사 하 고 싶습니다. 또한, 우리는 K. Verboven, D. 한 센, J. Jocken, 감사 하 고 싶습니다 그리고 E. Blaak 제공 하는 혈액과 조직 생 검이이 프로토콜 및 후속 실험 설정에 대 한 사용.
Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |