Denne artikkelen beskriver en metode for å analysere immun celleinnholdet av fettvev av isolering av immunceller fra fettvev og påfølgende analyse ved hjelp av flowcytometri.
Infiltrasjon av immunceller i fettvev subkutan og visceral (AT) innskudd fører til en lav-grade betennelse bidra til utviklingen av fedme-assosiert komplikasjoner som type 2 diabetes. Kvalitativt og kvantitativt undersøke immun celle undergrupper i menneskelig på innskudd, har vi utviklet en flyt cytometri tilnærming. Den pancreatic (sendinger), som inneholder immunceller, er isolert fra subkutan og visceral på biopsies av collagenase fordøyelse. Adipocytter er fjernet etter sentrifugering. Sendinger cellene er farget for flere membran-bundet markører valgt å skille mellom immun celle undergrupper og analysert ved hjelp av flowcytometri. Som følge av denne pro – og anti – inflammatory macrophage undergrupper, dendrittiske celler (DCer), B-celler, CD4+ og CD8+ T-celler, og NK celler kan oppdages og kvantifisert. Denne metoden gir detaljert informasjon om immunceller i AT og hvor mye hver bestemt delsett. Siden det finnes mange fluorescerende antistoffer, kan vår flyt cytometri tilnærming justeres for å måle ulike andre cellulære og intracellulær markører av interesse.
Fedme er preget med lav kvalitet AT betennelse1 og infiltrasjon av pro-inflammatoriske immunceller i både visceral og underhud på (moms, satt). Akkumulering av pro-inflammatoriske immunceller i karet fører til insulinresistens som er en primær risikofaktor for å utvikle type 2 diabetes2. Immunceller i begge medfødte og adaptive immunsystemet finnes i overvektige AT, som makrofager, mastceller, nøytrofile, CD4+ og CD8+ T-celler og B-celler3,4,5,6 ,7. Disse immunceller, sammen med endotelceller, stromal celler, adipocyte progenitors, fibroblaster og pericytes, utgjør den sendinger8 og er den viktigste kilden til pro-inflammatoriske stoffer i på9.
Inflammatorisk status på er vanligvis undersøkt av teknikker som Western blot10, qPCR11og immunohistochemistry11. Men når du bruker disse teknikkene, hele på, adipocytter og sendinger, brukes. Dette gjør det vanskelig å avgjøre beløpet og delsett av immunceller i AT. Immunceller har ulike celle indikatorer som definerer og kategorisere dem som makrofager. Makrofager viser betydelig heterogenitet i både funksjonen og celle overflaten markør uttrykk12. Derfor de er ofte delt inn i to macrophage bestander: M1 og M2. M2 makrofager kalles vanligvis også aktivert makrofager12,13 og bor i AT magre, metabolically normale mennesker14. Men under fedme oppstår en fenotypiske bryter fra M2 makrofager til M1 makrofager. Dette klassisk aktivert M1 makrofager express CD11C12 og samle seg rundt døde adipocytter til crown-lignende strukturer13. Det har vist at CD11C+ makrofager i AT svekke insulin handling og er assosiert med insulinresistens i overvektige mennesker15. Finn M1 og M2 makrofager i AT ved er immunohistochemistry et alternativ. Denne teknikken gir informasjon om plasseringen av makrofagene vev. Det vil imidlertid begrense antall indikatorer som kan brukes i en flekker. Videre er det også vanskelig å kvantifisere. Derfor, for å undersøke ulike immun celle delsett i mva- og lør innskudd, har vi utviklet en flyt cytometri tilnærming. Denne tilnærmingen gir oss mulighet til å bruke flere markører per celle med en flyt cytometri analyse å definere celle undergrupper og telle antall hver delsett i på innskudd.
Disse metodene beskriver hvordan å isolere sendinger fra mva og satt og kvantifisere de relative mengdene av immunceller i disse vev. Videre staten metodene fastslå uttrykk for markører på spesifikke celletyper.
Flowcytometri av vev immunceller er en kraftfull teknikk fenotypen tissues immunologiske staten. Kvantifisering av vev immunceller kan ha mange programmer. Som beskrevet i resultatene, er det mulig å sammenligne tilstedeværelse av bestemte immunceller mellom grupper av pasienter (f.eksmager vs overvektige). I tillegg av også utfører flowcytometri på blod av samme pasienter, kan tilknytninger mellom sirkulerende celler og vev celler undersøkes. Med dette programmet kunne vi fastslå at et bestemt delsett av sirkulerende monocytter er forbundet med pro-inflammatoriske CD11C+ fettvev makrofager16.
Justeringer av beskrevet protokollen vil utvide sine programmer som mange tilgjengelige fluorescerende antistoffer gjør flowcytometri meget allsidig. Nesten alle celletyper kan skilles med forskjellige antistoffer og uttrykk for mange indikatorer kan oppdages. Det er mulig å flekken markører intracellulært av permeabilizing cellemembranen å tillate intracellulær binding av fluorescerende antistoffer. Disse egenskapene kan skille mellom de svært mangfoldig macrophage utover altfor forenklet M1 og M2 macrophage subtyper. Foruten måling av overflaten markør uttrykk, kan proteiner (dvs., cytokiner) være farget intracellulært gir informasjon om macrophage funksjonalitet. I tillegg er spredning markører som Ki67 brukt om å kvantifisere spredning priser. Som beskrevet, var skille mellom makrofager og DCs basert på MFI nivåer av DC markører. En generell macrophage markør, som CD68 kan bli innlemmet i macrophage panelet (FACS panel 1). Men trenger CD68 å bli farget intracellulært krever permeabilization i cellemembranen som er ikke å foretrekke, og ville utvide protokollen. Andre macrophage markører er delsett markører som CD163 og CD206 eller CD11c, det sistnevnte blir integrert i macrophage-panelet som presenteres her.
Våre FACS paneler, merketråd å skille mellom levende og døde celler var ikke inkludert, som ville være å foretrekke fordi det gir en mer nøyaktig utelukkelse av døde celler enn bruk av FSC og SSC. Brukte er DNA flekker levedyktighet fargestoffer propidium iodide (PI) eller 4′ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) samt gratis Amin reagerer fargestoffer som LIVE/DEAD Fixable døde celle flekken Kit, som er tilgjengelig i forskjellig farge farger. Imidlertid PI og DAPI kan ikke brukes når bestemmer cellene. Som beskrevet i protokollen, kan den LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell levedyktighet flekker integreres i både panelene uten å påvirke den generelle FACS gating strategi.
I tillegg er dataene uttrykt i prosent av levende celler betyr at alle data er relativ. Bare ved å angi en nøyaktig, ville kjent antall celler i flyt cytometer, det være mulig å fastslå den nøyaktige tall av hver celle. En omtrentlig antall celler kan beregnes etter teller cellene i sendinger fraksjonen ved å bruke en telling kammer. Dette nummeret må justeres for biopsi vev brukes til å isolere sendinger, men dette har begrensninger når man sammenligner magert å overvektige på. En lignende masse overvektige på består av mindre adipocytter som de er fylt med lipider og har utvidet betydelig. Dette kan føre til en undervurdering av immun celle nummer hvis presentert som antall immunceller per gram på eller per adipocyte.
I menneskelige studier gjøres inkludering av pasienter vanligvis over lengre tid på å lage standardisering av eksperimentelle prosedyrer av stor betydning. For sammenligning med flow cytometri data mellom pasienter finnes det flere alternativer. Som beskrevet i denne protokollen, kan cellene løses før måling slik at analyse av flere prøver på samme dag. Dette kan også oppnås ved å fryse sendinger før flekker dem, som tillater flekker prosedyren for å være likt mellom alle prøver, men levedyktigheten til cellene kan bli påvirket. Til slutt, også ansatt i denne studien, er fluorescerende perler å installere kompensasjonsnivåer og cytometer sporing perler ble brukt behandlinger for å standardisere daglige målinger av cytometer. Dette siste alternativet er det mest effektivt når måle prøver fra en studie som spenner over en lang periode.
En begrensende faktor for flowcytometri er generelt bruk av fluorescens. Antall fluorescerende etiketter som kan oppdages samtidig er begrenset på grunn av overlapping i utslipp spectra. Men med smart FACS panelet utvikling og bruk av flere antistoff cocktailer per mva eller satt eksempel, kan problemet overvinnes som beskrevet i denne protokollen. En viktig del av FACS panelet utvikling er FMO kontrollene. Ved alle antistoffer i panelet med unntak av en kan potensiell autofluorescence nivåer være verdsatt sammenlignet FMO med full panel. Dette gjør nøyaktig gating befolkninger, og disse prosedyrene skal utføres når du definerer en ny FACS panel. I tillegg kan nye generasjoner av FACS enheter gjenkjenne opptil 50 parametere tillater samtidig deteksjon av mange egenskaper per celle. Et annet problem relatert til fluorescens aspektet er autofluorescence av celler, spesielt makrofager. Etter magnetisering av cellene med FACS laser (hovedsakelig med 488 nm wavelength eksitasjon), disse cellene avgir et fluorescerende signal (hovedsakelig < 640 nm) at kan overlapping med utslipp spektra av antistoffer etiketter17,18. Kontoen for dette, bør unstained kvinne celler bli målt for å fastsette autofluorescence i hver enkelt kanal. Med denne kunnskapen, skal fluorochromes være merket som viser en signalstyrke som overstiger autofluorescent signalet. Autofluorescent bakgrunn signalet bør tas hensyn til ved fastsettelse gating strategi befolkningen. Derfor ved denne protokollen og intelligent FACS panel design er det mulig å i dybden fenotypen macrophage undertyper. Nye tydelig AT makrofager og deres funksjon kan være preget.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke J. van de Gaar og M. Vroomen (Universitetet i Maastricht, Nederland) for deres teknisk støtte. Dessuten, vi ønsker å takke K. Verboven, D. Hansen J. Jocken, og E. Blaak for å gi blod og vev biopsier brukes for denne protokollen og påfølgende eksperimenter.
Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |