Denna artikel beskriver en metod att analysera immunceller innehåll av fettvävnad genom isolering av immunceller från fettvävnad och efterföljande analys med flödescytometri.
Infiltration av immunceller i subkutan och visceral fettvävnad (AT) insättningar leder till en låggradig inflammation som bidrar till utvecklingen av fetma-relaterade komplikationer såsom typ 2-diabetes. För att kvantitativt och kvalitativt undersöka immunceller delmängder i mänskliga på insättningar, har vi utvecklat ett flöde flödescytometri tillvägagångssätt. Stromaceller vaskulär fraktionen (SVF), som innehåller de immuna cellerna, är isolerad från underhudsfett och visceralt på biopsier av kollagenas matsmältning. Adipocyter avlägsnas efter centrifugering. SVF cellerna färgas för flera membran-bundna markörer valt att skilja mellan immunceller delmängder och analyseras med flödescytometri. Till följd av detta synsätt, pro – och anti – Anti-Inflammatory makrofag delmängder, dendritiska celler (DCs), B-celler, CD4+ och CD8+ T-celler och NK-celler kan identifieras och kvantifieras. Denna metod ger detaljerad information om immunceller i AT och beloppet för varje specifik delmängd. Eftersom det finns många fluorescerande antikroppar finns, kan vårt flöde flödescytometri tillvägagångssätt justeras för att mäta olika andra cellulära och intracellulära markörer av intresse.
Fetma kännetecknas med låggradig AT inflammation1 och infiltration av pro-inflammatoriska immunceller i både visceral och subkutant på (moms, satt). Ansamling av pro-inflammatoriska immunceller i mervärdesskatt leder till insulinresistens vilket är en primär riskfaktor för att utveckla typ 2-diabetes2. Immuna celler av både medfödd och adaptiv immunförsvaret finns i feta AT, såsom makrofager, mastceller, neutrofiler, CD4+ och CD8+ T-celler och B-celler3,4,5,6 ,7. Dessa immunceller, tillsammans med endotelceller, stromaceller, fettceller stamfäder, fibroblaster och pericyter, utgör den SVF8 och är den huvudsakliga källan av pro-inflammatoriska ämnen i AT9.
VID inflammatoriska status utreds vanligen av tekniker inklusive Western blot10, qPCR11och immunohistokemi11. När du använder dessa tekniker, hela AT, adipocyter och SVF, används dock. Detta gör det svårt att avgöra mängden och delmängder av immunceller i AT. Immunceller har olika cell markörer att definiera och kategorisera dem, såsom makrofager. Makrofager visar betydande heterogenitet i både funktion och cell surface markör uttryck12. Därför är de ofta kategoriseras i två makrofag populationer: M1 och M2. M2 makrofager kallas brukar alternativt aktiverade makrofager12,13 och bor i AT lean, metaboliskt normala människor14. Men under fetma uppstår en fenotypisk switch från M2 makrofager till M1 makrofager. Dessa aktiveras klassiskt M1 makrofager express CD11C12 och ackumuleras runt döda fettceller att bilda kronan-liknande strukturer13. Det har visats att CD11C+ makrofager i AT försämra insulinets verkan och är associerade med insulinresistens i feta människor15. För att identifiera M1 och M2 makrofager i AT, är immunohistokemi ett alternativ. Denna teknik ger information om placeringen av makrofager i vävnaden. Dock begränsas antalet markörer som kan användas i en färgning. Dessutom är det också svårt att kvantifiera. Därför, för att undersöka olika immunceller delmängder i moms och lör insättningar, har vi utvecklat ett flöde flödescytometri tillvägagångssätt. Detta tillvägagångssätt ger oss möjlighet att använda flera markörer per cell med en Flödesanalys flödescytometri att definiera cell delmängder och räkna antalet varje delmängd i AT insättningar.
Dessa metoder beskriva hur man isolera SVF från mervärdesskatt och satt och kvantifiera de relativa mängder immunceller inom dessa vävnader. Dessutom ange metoderna så avgör uttrycket av markörer på specifika celltyper.
Flödescytometri av vävnad immunceller är en kraftfull teknik till fenotypen vävnader immunologiska tillstånd. Kvantifiering av vävnad immunceller kan ha många program. Som beskrivs i resultatet, är det möjligt att jämföra förekomsten av specifika immunceller mellan patientgrupper (t.ex., lean vs. överviktiga). Dessutom, genom att också utföra flödescytometri på blod av samma patienter, kan associationer mellan cirkulerande celler och vävnadsceller undersökas. Med det här programmet kunde vi fastställa att en viss delmängd av cirkulerande monocyter är associerade med pro-inflammatoriska CD11C+ adipose vävnad makrofager16.
Justeringar av beskrivna protokollet kommer att utöka dess tillämpningar som många tillgängliga fluorescerande antikroppar gör flödescytometri mycket mångsidig. Med olika antikroppar nästan alla celltyper kan urskiljas och uttrycket av många markörer kan upptäckas. Dessutom är det möjligt att färga markörer intracellulärt av permeabilizing cellmembranet för att tillåta intracellulära bindning av fluorescerande antikroppar. Dessa egenskaper gör det möjligt för skillnaden av de mycket varierande makrofag populationerna bortom de alltför förenklad M1 och M2 makrofag undertyperna. Förutom mätning av surface markör uttryck, kan proteiner (dvs, cytokiner) färgas intracellulärt ger information om makrofag funktionalitet. Dessutom används spridning markörer såsom Ki67 att kvantifiera spridning priser. Som beskrivits, bygger åtskillnad mellan makrofager och DCs på MFI nivåer av DC markörer. En allmän makrofag markör, såsom CD68 kan införlivas i panelen makrofag (FACS panel 1). CD68 behöver dock färgas intracellulärt som kräver permeabilisering av cellmembranet som inte är att föredra och vill utöka protokollet. Andra makrofag markörer är delmängd markörer såsom CD163 och CD206 eller CD11c, den senare integreras i panelen makrofag presenteras här.
I våra FACS paneler, en markör för att skilja mellan levande och döda celler ingick inte, vilket skulle vara att föredra eftersom det ger en mer exakt uteslutning av döda celler än användning av FSC och SSC. Ofta används är DNA färgning livskraft färgämnen propidium jodid (PI) eller 4′, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) samt fria aminen reagerar färgämnen som LIVE/DEAD fastställbara döda cellen Stain Kit, som finns i olika färg färger. PI och DAPI inte kan dock användas vid fastställande av cellerna. Som beskrivs i protokollet, kan LIVE/DEAD fastställbara Red Dead Cell livskraft färgningen integreras i både paneler utan att det påverkar den övergripande FACS gating strategi.
Dessutom uttrycks data som en procentandel av levande celler vilket innebär att alla data är relativa. Endast genom att ange en exakt, skulle känt antal celler i i flödescytometer, det vara möjligt att fastställa det exakta antalet varje celltyp. Ett ungefärligt antal celler kunde beräknas efter räknar cellerna i SVF fraktionen med hjälp av en räknande kammare. Detta antal skulle behöva justeras för biopsi vävnad används för att isolera SVF, men detta har begränsningar när man jämför lean till överviktiga på. En liknande massa feta AT består av mindre adipocyter eftersom de är fyllda med lipider och har expanderat kraftigt. Detta kan leda till en underskattning av immunceller nummer om presenteras som antalet immunceller per gram på eller fettceller.
I humanstudier görs inklusion av patienterna vanligen under en längre tid att göra standardisering av experimentella rutiner av stor betydelse. För jämförelse av flödescytometri flödesdata mellan patienter finns det flera alternativ. Som beskrivs i detta protokoll, kan cellerna fastställas före mätningen möjliggör analys av flera prover på samma dag. Detta kan även uppnås genom att frysa SVF innan färgning dem, vilket gör den färgningsproceduren ska vara lika mellan alla prover, men lönsamheten för celler kan påverkas. Slutligen också anställd i denna studie, är fluorescerande pärlor att installera kompensationsnivåer och cytometer spårning pärlor användes varannan vecka för att standardisera dagliga mätningar av cytometer. Det sista alternativet är mest effektiv vid mätning av prover från en studie som spänner över en lång tidsperiod.
En begränsande faktor för flödescytometri är i allmänhet användningen av fluorescens. Antalet fluorescerande etiketter som kan identifieras samtidigt är begränsad på grund av överlappning i utsläpp spectra. Men med smart FACS panel utveckling och användning av flera antikropp cocktails per moms eller lör prov, kan problemet lösas som beskrivs i detta protokoll. En viktig aspekt av FACS panel utveckling är FMO kontroller. Med hjälp av alla antikroppar av panelen utom en, kan potentiella autofluorescens nivåer uppskattas när man jämför FMO med hela panelen. Detta tillåter korrekt gating av populationer och dessa bör utföras när du konfigurerar en ny FACS-panel. Nya generationer av FACS enheter kan dessutom upptäcka upp till 50 parametrar som möjliggör samtidig identifiering av många egenskaper per cell. En annan fråga som rör fluorescens aspekten är autofluorescens av celler, särskilt makrofager. Efter magnetisering av cellerna med FACS laser (främst med 488 nm våglängd excitation), dessa celler avger en fluorescerande signal (främst < 640 nm) att kan överlappning med utsläpp spektra av antikropp etiketter17,18. För att beakta detta, bör ofärgade celler mätas för att bestämma autofluorescens i varje kanal. Med denna kunskap bör det väljas fluorokromer som visar en signalstyrka som överskrider autofluorescent signalen. Denna autofluorescent bakgrund signal bör beaktas vid fastställandet av den portande strategin av befolkningarna. Därför, genom tillämpning av detta protokoll och intelligent FACS panel design är det möjligt att i djup fenotyp makrofag undertyper. Ny distinkt AT makrofager och deras funktion kan karakteriseras.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka J. van de gåår och M. Vroomen (universitetet i Maastricht, Nederländerna) för deras tekniska support. Dessutom vill vi tacka K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, och E. Blaak för att tillhandahålla de blod- och vävnadsprover biopsier används för att ställa in detta protokoll och de efterföljande experiment.
Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |