Canalostomy som en kirurgisk metod att lokala Drug Delivery i Inner örat på vuxna och neonatala möss
Summary
Här beskriver vi canalostomy förfarande som tillåter lokala drogen leverans i inner örat på vuxna och neonatala möss genom den halvcirkelformade kanalen med minimal skada till hörsel och vestibulär funktion. Denna metod kan användas för att Inokulera virala vektorer, läkemedel och små molekyler in i musen inre öra.
Abstract
Lokal leverans av terapeutiska läkemedel in i inre öra är en lovande behandling för innerörat sjukdomar. Injektion genom båggångarna (canalostomy) har visat sig vara en användbar strategi för lokal drog leverans till innerörat. Målet med denna artikel är att beskriva, i detalj, de kirurgiska teknikerna som är inblandade i canalostomy i både vuxen och neonatala möss. Som framgår av snabb-grön dye och adeno-associerade virus serotyp 8 med grönt fluorescerande protein genen, canalostomy underlättas bred distribution av injicerade reagenser i hörselsnäckan och vestibulära slutet-organ med minimala skador på hörseln och vestibulär funktion. Operationen genomfördes framgångsrikt i både vuxen och neonatala möss; flera operationer kan faktiskt utföras om det behövs. Avslutningsvis canalostomy är en effektiv och säker metod att drogen leverans i inner örat på vuxna och neonatala möss och kan användas för att behandla mänskliga innerörat sjukdomar i framtiden.
Introduction
Sensorineural hörselnedsättning och vestibulär dysfunktion påverkar ett betydande antal patienter och är nära associerade med innerörat störningar. Leverans av terapeutiska läkemedel in i inre öra visar löfte för behandling av innerörat störningar. En systemisk eller lokal strategi kan användas för att leverera läkemedel in i inre öra. Vissa innerörat sjukdomar behandlas framgångsrikt med systemisk drug administration, till exempel idiopatisk plötslig hörselnedsättning, som behandlas vanligtvis med systemisk steroid1. Lentz et al. visade dessutom att systemisk administrering av antisense oligonukleotiden kunde förbättra hörsel och balans funktioner i Ush1c mutant mouse modell2. Men en stor del av innerörat sjukdomar inte effektivt behandlas av systemisk drug administration på grund av den blod-labyrint barriären, vilket begränsar drog tillgång till innerörat3,4. Däremot kan lokala narkotikastrategier leverans behandla inre öronsjukdomar mer effektivt. Innerörat är faktiskt potentiellt ett perfekt mål för lokal drog leverans. den är fylld med vätska, vilket underlättar spridning av läkemedlet efter en-plats diffusion eller injektion, och det är relativt isolerade från närliggande organ, vilket begränsar biverkningar5,6.
Lokala narkotikastrategier leverans omfattar intratympanic och intralabyrinthine metoder. Effektiviteten av intratympanic rutten är till stor del beroende av drogen permeabilitet genom det runda fönstret membranet (RWM) och uppehållstid av drogen på RWM3,4,7,8. Det passar således inte för leverans av droger eller reagenser som inte kan tränga igenom RWM. Intralabyrinthine metoder innebär inokulering av läkemedel direkt in i inre öra, vilket resulterar i en hög dos och omfattande distribution. Dock intralabyrinthine metoder kräver känsliga operationer och är invasiv, leder till skador på innerörat funktion. Intralabyrinthine injektion av läkemedel används för närvarande, endast i djurstudier som det inte har visats vara tillräckligt säkra för användning i människor9. Därför kirurgiska förfaranden måste förenklas, och minskar risken för skada för att översätta intralabyrinthine förhållningssätt till kliniken.
Flera intralabyrinthine metoder har utvärderats hos djur av injektion genom RWM5,10,11 och in scala media12,13,14, scala tympani 15 , 16, scala absid17, båggångarna16,18,19,20och den endolymphatic sac21. Alla dessa metoder har fördelar och nackdelar6. Leverans via RWM är atraumatiska i neonatala möss5,22. Dock är en lindrig hörselnedsättning hos vuxna möss efter RWM injektion23, möjligen på grund av mellanörat utgjutning efter kirurgi24. Scala media injektion, vilket innebär injektion av reagens direkt till endolymphatic utrymme som innehåller sensoriska epitelet, uppnår en hög reagens koncentration i målet slutet-organ12,14, 25 , 26. men detta tillvägagångssätt kräver en komplex procedur och resulterar i betydande höjning av tröskeln för förhandlingen om utförs senare än postnatal dag 5 (P5)25,27, vilket begränsar dess tillämpning.
Jämfört med de ovan nämnda intralabyrinthine tillvägagångssätt, orsakar canalostomy minimal skada innerörat, särskilt i vuxna möss16,18,28,29,30, vilket är viktigt för bedömning av skyddande effekter och translationella aspekter. Dessutom på gnagare ligger båggångarna bortom den bulla, vilket underlättar kirurgiska ingrepp och undviker störningar i mellanörat under operation. Kliniken används halvcirkelformade kanalen operationer för svårbemästrade benign paroxysmal positionell vertigo31,32,33, vilket tyder på kliniska genomförbarheten av canalostomy. Eftersom det beskrevs först av Kawamoto et al. 16 i 2001, canalostomy har använts för att leverera olika reagens, såsom virala vektorer, siRNA, stamceller och aminoglykosid, in i murina innerörat18,19,28,29 ,34,35,36,37. Inokulering av adeno-associerade (AAV) virusvektorer av canalostomy aktivera överuttryck av exogena gener i sensoriska epitelet och primära nervceller i snäckan och vestibulära slutet-organ18,28, 29,30. Whirlin genterapi av canalostomy återställer balans funktion och förbättrar hörseln i en musmodell av mänskliga Usher syndrom19, tyder på att canalostomy är användbar för studier av genterapi för genetisk cochleovestibular sjukdomar. Transplantation av mesenkymala stamceller av canalostomy resulterar i omorganiseringen av cochlear fibrocytes och förhandlingen återhämtning i en råtta modell av akut sensorineural hearing loss35. Dessutom canalostomy kan användas för att införa aminoglykosider i innerörat att upprätta vestibulära lesioner18,34,38och flera injektioner kan utföras om krävs18 , 34.
I denna artikel skall beskriva vi, i detalj, canalostomy tekniker i vuxen och neonatala möss. Vi inokuleras olika reagenser, inklusive snabb-grön dye och AAV serotyp 8 (AAV8), tillsammans med grönt fluorescerande protein (GFP) genen (AAV8-GFP) och streptomycin, i mus innerörat att utvärdera de omedelbara och långsiktiga resultaten efter canalostomy.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie visade vi att drogen leverans av canalostomy resulterade i omfattande distribution av reagens i hela snäckan och vestibulära slutet-organ. Som en innerörat gen leveransmetod resulterade canalostomy i GFP uttryck i inre öronen för vuxna och neonatala möss med minimal skada till hörsel och vestibulär funktion. Dessutom kan flera injektioner utföras enkelt på samma djur.
En av de största styrkorna i canalostomy är att det orsakar minimal skada innerörat funktion, särs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (grant nummer 81570912, 81771016, 81100717).
Materials
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
References
- Stachler, R. J., et al. Clinical practice guideline: sudden hearing loss. Otolaryngol Head Neck Surg. 146 (3 Suppl), S1-S35 (2012).
- Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19 (3), 345-350 (2013).
- Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
- El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
- Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane. J Vis Exp. (97), e52187 (2015).
- Ahmed, H., Shubina-Oleinik, O., Holt, J. R. Emerging Gene Therapies for Genetic Hearing Loss. J Assoc Res Otolaryngol. 18 (5), 649-670 (2017).
- Murillo-Cuesta, S., et al. A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection. J Vis Exp. (121), e54951 (2017).
- Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, P. C., Lang, H. The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration. J Vis Exp. (105), e53131 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Principles of local drug delivery to the inner ear. Audiol Neurootol. 14 (6), 350-360 (2009).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35 (3), 264-272 (2017).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Mol Med. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. J Neurosci Methods. 150 (1), 67-73 (2006).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice. Mol Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Bowers, W. J., et al. Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea. Mol Ther. 6 (1), 12-18 (2002).
- Wang, G. P., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer targeting normal and traumatized mouse utricle. Gene Ther. 21 (11), 958-966 (2014).
- Isgrig, K., et al. Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25 (3), 780-791 (2017).
- Gassner, D., Durham, D., Pfannenstiel, S. C., Brough, D. E., Staecker, H. Canalostomy as a surgical approach for cochlear gene therapy in the rat. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1830-1836 (2012).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac. Hum Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene transfection in neonatal mice using adeno-associated viral vector: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Chien, W. W., McDougald, D. S., Roy, S., Fitzgerald, T. S., Cunningham, L. L. Cochlear gene transfer mediated by adeno-associated virus: Comparison of two surgical approaches. Laryngoscope. 125 (11), 2557-2564 (2015).
- Zhu, B. Z., Saleh, J., Isgrig, K. T., Cunningham, L. L., Chien, W. W. Hearing Loss after Round Window Surgery in Mice Is due to Middle Ear Effusion. Audiol Neurootol. 21 (6), 356-364 (2017).
- Wang, Y., et al. Early postnatal virus inoculation into the scala media achieved extensive expression of exogenous green fluorescent protein in the inner ear and preserved auditory brainstem response thresholds. J Gene Med. 15 (3-4), 123-133 (2013).
- Lee, M. Y., et al. Survival of human embryonic stem cells implanted in the guinea pig auditory epithelium. Sci Rep. 7, 46058 (2017).
- Ishimoto, S., Kawamoto, K., Kanzaki, S., Raphael, Y. Gene transfer into supporting cells of the organ of Corti. Hear Res. 173 (1-2), 187-197 (2002).
- Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33 (4), 655-659 (2012).
- Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).
- Guo, J. Y., et al. Cochleovestibular gene transfer in neonatal mice by canalostomy. Neuroreport. 28 (11), 682-688 (2017).
- Beyea, J. A., Agrawal, S. K., Parnes, L. S. Transmastoid semicircular canal occlusion: a safe and highly effective treatment for benign paroxysmal positional vertigo and superior canal dehiscence. Laryngoscope. 122 (8), 1862-1866 (2012).
- Naples, J. G., Eisen, M. D. The History and Evolution of Surgery on the Vestibular Labyrinth. Otolaryngol Head Neck Surg. 155 (5), 816-819 (2016).
- Hamilton, L., Keh, S., Spielmann, P. M., Hussain, S. S. How we do it: locating the posterior semicircular canal in occlusion surgery for refractory benign paroxysmal positional vertigo: a cadaveric temporal bone study. Clinical Otolaryngology. 41 (2), 190-193 (2016).
- Jung, J. Y., et al. siRNA targeting Hes5 augments hair cell regeneration in aminoglycoside-damaged mouse utricle. Mol Ther. 21 (4), 834-841 (2013).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. Am J Pathol. 171 (1), 214-226 (2007).
- Pfannenstiel, S. C., Praetorius, M., Plinkert, P. K., Brough, D. E., Staecker, H. Bcl-2 gene therapy prevents aminoglycoside-induced degeneration of auditory and vestibular hair cells. Audiol Neurootol. 14 (4), 254-266 (2009).
- Kawamoto, K., Izumikawa, M., Beyer, L. A., Atkin, G. M., Raphael, Y. Spontaneous hair cell regeneration in the mouse utricle following gentamicin ototoxicity. Hear Res. 247 (1), 17-26 (2009).
- Wang, G. P., et al. Notch signaling and Atoh1 expression during hair cell regeneration in the mouse utricle. Hear Res. 267 (1-2), 61-70 (2010).
- Pietola, L., et al. HOX-GFP and WOX-GFP lentivirus vectors for inner ear gene transfer. Acta Otolaryngol. 128 (6), 613-620 (2008).
- Han, J. J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
