Summary
Hier beschrijven we canalostomy procedure waarmee lokale drug levering tot de inner oren van volwassen en neonatale muizen door het semicircular kanaal met minimale schade aan gehoorbescherming en vestibulaire functie. Deze methode kan worden gebruikt om te enten virale vectoren, farmaceutische producten en kleine moleculen in het binnenoor muis.
Abstract
Lokale levering van therapeutische drugs in het binnenoor is een veelbelovende therapie voor de ziekten van het binnenoor. Injectie via semicircular grachten (canalostomy) heeft aangetoond dat een nuttige aanpak naar lokale drug delivery in het binnenoor. Het doel van dit artikel is, in detail te beschrijven, de operatietechnieken die betrokken zijn bij canalostomy in zowel volwassen en neonatale muizen. Zoals aangegeven door de snel-groene kleurstof en adeno-associated virus serotype 8 met de groen fluorescente proteïne-gen, vergemakkelijkt de canalostomy brede distributie van ingespoten reagentia in het slakkenhuis en vestibulaire einde-organen met minimale schade aan gehoor en vestibulaire functie. De operatie werd met succes geïmplementeerd in zowel volwassen en neonatale muizen; inderdaad, kunnen veelvoudige chirurgie worden uitgevoerd indien nodig. Kortom, canalostomy is een effectieve en veilige benadering drug levering tot de inner oren van volwassen en neonatale muizen en menselijk binnenoor om ziekten te behandelen in de toekomst kan worden gebruikt.
Introduction
Sensorineural hoorzitting verlies en vestibulaire dysfunctie invloed een aanzienlijk aantal patiënten en zijn nauw verbonden met aandoeningen van het binnenoor. Levering van therapeutische geneesmiddelen in het binnenoor toont belofte voor de behandeling van aandoeningen van het binnenoor. Een systemische of lokale aanpak kan worden gebruikt om drugs te leveren in het binnenoor. Sommige ziekten van het binnenoor zijn succesvol behandeld met systemische drug beheer, zoals idiopathische plotseling gehoorverlies, die vaak met systemische steroïden1is behandeld. Daarnaast toonde Lentz et al. dat systemische toediening van antisense oligonucleotide kon verbeteren gehoord en functies in de Ush1c mutant mouse model2in evenwicht te brengen. Echter een groot deel van het binnenoor ziekten zijn niet effectief behandeld door systemische drug administration vanwege de bloed-labyrint barrière, die beperkt de drug toegang tot het binnenoor3,4. Daarentegen kunnen lokale levering drugsstrategieën behandelen aandoeningen van het binnenoor efficiënter. Inderdaad, het binnenoor is potentieel een ideaal doelwit voor lokale drug delivery; het is gevuld met vloeistof, dat vergemakkelijkt de verspreiding van de drug na een-site diffusie of injectie, en het is relatief geïsoleerd van naburige organen, waardoor bijwerkingen5,6wordt beperkt.
Lokale levering drugsstrategieën omvatten de methoden intratympanic en intralabyrinthine. De doeltreffendheid van de intratympanic route is grotendeels afhankelijk van drugs permeabiliteit door het ronde venster membraan (RWM) en de verblijftijd van de drug op de RWM3,4,7,8. Het is dus niet geschikt voor de levering van drugs of reagentia die niet kunnen in de RWM doordringen. Intralabyrinthine methodes omvatten inoculatie van drugs rechtstreeks in het binnenoor, wat resulteert in een hoge dosis en de wijdverspreide distributie. Echter intralabyrinthine methodes vereisen delicate operaties en zijn invasief, wat leidt tot schade aan binnenoor functie. Op dit moment wordt de intralabyrinthine injectie van drugs alleen gebruikt in dierlijke studies zoals het niet voldoende veilig voor gebruik in mens9is aangetoond. Daarom chirurgische procedures moeten worden vereenvoudigd, en het risico van verwonding beperkt tot het vertalen van intralabyrinthine benaderingen in de kliniek.
Verschillende intralabyrinthine benaderingen zijn beoordeeld in dieren door injectie door de RWM5,,10,11 en in het scala media12,13,14, het scala-pauken 15 , 16, de scala vestibule17, de grachten semicircular16,18,19,20en de endolymphatic sac21. Elk van deze benaderingen heeft voor- en nadelen6. Levering via de RWM is atraumatische in neonatale muizen5,22. Echter, een lichte gehoorverlies wordt waargenomen in volwassen muizen na RWM injectie23, mogelijk als gevolg van middenoor effusie na de chirurgie24. Scala media injectie, waarbij de injectie van het reagens rechtstreeks in de endolymphatic ruimte met de sensorische epitheel, behaalt een hoge reagens concentratie in doel einde-organen12,14,, 25 , 26. maar deze aanpak vereist een complexe procedure en resulteert in een aanzienlijke verhoging van de drempel van de hoorzitting als uitgevoerd uiterlijk postnatale dag 5 (P5)25,27, waardoor de toepassing ervan wordt beperkt.
In vergelijking met de bovengenoemde intralabyrinthine benaderingen, canalostomy minimale schade veroorzaakt aan het binnenoor, vooral in volwassen muizen16,18,28,29,30, die is belangrijk zijn voor de evaluatie van de beschermende effecten en translationeel aspecten. Bovendien, knaagdieren, de semicircular grachten bevinden zich buiten de ' bulla ', ter vergemakkelijking van chirurgische ingrepen en vermijdt verstoring van het middenoor tijdens de operatie. In de kliniek, semicircular canal chirurgie gebruikt voor hardnekkige benigne paroxysmale positie vertigo31,32,33, suggereren de klinische haalbaarheid van canalostomy. Aangezien het eerst werd beschreven door Kawamoto et al. 16 in 2001, canalostomy is gebruikt voor het leveren van diverse reagentia, zoals virale vectoren, siRNA en stamcellen aminoglycoside, in het binnenoor lymfkliertest18,19,28,29 ,34,35,,36,,37. Inoculatie van adeno-associated virus (AAV) vectoren door canalostomy inschakelen overexpressie van exogene genen in de sensorische epitheel en primaire neuronen van het slakkenhuis en vestibulaire einde-organen18,28, 29,30. Therapie van het gen whirlin door canalostomy evenwicht functie herstelt en verbetert de hoorzitting in een muismodel van menselijke Usher syndroom19, suggereert dat canalostomy is nuttig voor onderzoek naar gentherapie voor genetische cochleovestibular ziekten. Transplantatie van mesenchymale stamcellen door canalostomy resulteert in een reorganisatie van cochleaire fibrocytes en hoorzitting herstel in een rat model van acute perceptief hoorzitting verlies35. Bovendien, canalostomy kan worden gebruikt voor het introduceren van aminoglycosiden in het binnenoor om vestibulaire laesies18,34,38, en meerdere injecties kunnen worden uitgevoerd indien nodig van18 , 34.
In dit artikel beschrijven we, in detail, canalostomy technieken in volwassen en neonatale muizen. Wij geënt verschillende reagentia, met inbegrip van snel-groene kleurstof en AAV serotype 8 (AAV8), samen met de groen fluorescente proteïne (GFP) gene (AAV8-GFP) en streptomycine, in het binnenoor van de muis te evalueren van de resultaten van de onmiddellijke en lange na canalostomy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures en dierlijke operaties werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Animal Care en gebruik van het Comité van de medische universiteit van China hoofdstad.
1. apparaat preparaten
- Om de injectie canule (figuur 1A), sluit polyimide buis (binnendiameter 114.3 µm, buitendiameter 139.7 µm, lengte ~ 3 cm) aan polyethyleen slang (binnendiameter 280 µm, buitendiameter 640 µm, lengte ~ 40 cm). Verbinding met ten minste drie toepassingen met behulp van lijm, afdichten. Het steriliseren van de canule injectie met ethyleenoxide.
Opmerking: Wanneer verzegeling van de buis, beletten de lijm de slang van polyimide, die in een blokkade van de canule resulteren kan. De zegel van de buis op ten minste driemaal, omdat gas sterilisatie kan lekkage op de verbinding. - Met behulp van een naald 30 G, sluit het uiteinde van de polyethyleen slang aan een 1 cc spuit met normale zout. Vul de canule met normale zout door injectie met de spuit 1-cc om te controleren op eventuele lekkage of de blokkade bij de verbinding tussen de polyimide buis en polyethyleen slang.
Opmerking: Als er een lekkage of een blokkering van de verbinding, de canule kan niet worden gebruikt in de volgende procedures. - Evacueren een 10 µL micro-spuit met normale zout en sluit deze aan op de eerder genoemde 30 G naald met de canule injectie. Installeer de micro-spuit op een microinjection pomp (figuur 1B). Stel de snelheid van de injectie tot 0,5 µL/min en het volume 1 µL voor snel-groene kleurstof en AAV8-GFP, of 2 µL voor streptomycine.
Opmerking: Het aanbevolen bereik van injectie snelheid is 0.1−0.5 µL/min, en het aanbevolen bereik van geïnjecteerde volume is 0.5−2 µL. - Trek terug de micro-spuit naar 1 µL en haal de injectie reagens. Een luchtspleet zullen vormen tussen de normale zout en het ingespoten reagens (Figuur 1 c).
- Optioneel label de positie van de rand van de gas-vloeistof op de polyethyleen slang met een viltstift. Dit kan worden gebruikt om het reagens stroom tijdens de injectie te controleren.
2. Canalostomy in volwassen muizen
- Een volwassen muis anesthetize (vrouwelijke, FVB/N, 5 tot 6 - week oud) door intraperitoneale injectie van ketamine HCl (120 mg/kg) en xylazine HCl (7 mg/kg). 5−10 min wachten totdat het dier geen reactie op pijnlijke stimuli (de teen-snuifje reflex vertoont). Plaats het dier op een voorverwarmde elektrische pad na narcose. Een analgeticum, Meloxicam (1 mg/kg), werd subcutaan worden toegepast voor de operatie.
- Dekking van het dier ogen met oog zalf. Scheren van de linker post auricular regio met een elektrische dierlijke clipper en desinfecteren van de huid drie keer met 75% ethanol.
- Plaats het dier op een voorverwarmde elektrische pad. De temperatuur van de elektrische pad ingesteld op ~ 37° C. Plaats het dier in de rechts zijligging ter vergemakkelijking van de operatie aan de linker oor.
- Het maken van een post auricular incisie van 1-1,5-cm ~ 3 mm van de linker retroauricular groef (figuur 2A).
- Positionering van de achterste semicircular kanaal (PSC) en de laterale semicircular canal (LSC): wanneer de hoofdmap van de pinna (vet dot in figuur 2B) is gedefinieerd als de oorsprong en het vlak evenwijdig aan de calvarium als 3 tot 9 uur, het PVC en de LSC zijn meestal gelegen ~ 3 mm in de hoofdmap van de pinna tussen 2 en 3 uur (figuur 2B).
- Bot ontleden de spier die betrekking hebben op de temporale bone met micro-pincet bloot de PSC en LSC, waarvan de marges duidelijk zichtbaar als donkere strepen in de temporale bot (figuur 2C zijn). De GSC is op een ongeveer 30° hoek van het vlak evenwijdig aan de calvarium, en het PVC is verticale naar de LSC (figuur 2C). Een klein stukje van de spier met een micro-Tang verzamelen en laten drogen. In de volgende stap, zal deze spier worden gebruikt voor het afdichten van het gat.
Opmerking: Vermijd buitensporige scheuren van de weefsels te minimaliseren van schade aan de spieren. Te voorkomen beschadiging van de aangrenzende vaartuig, wanneer het bloot van de PSC (figuur 2D). - Maak een klein gaatje in het middelste gedeelte van het PVC met behulp van een naald 26 G (figuur 2D). Vloeibare lekkage door het gat geeft aan succesvolle penetratie van de benige wand van het PVC. Het gat naar een juiste maat, iets groter dan de diameter van de buis van polyimide vergroten.
Opmerking: Boor en vergroten van het gat voorzichtig en geleidelijk om te voorkomen dat de breuk van het PVC. - Reinig de effusie rond het gat van de PSC met behulp van een katoen-pellet.
- Plaats het uiteinde van de buis van polyimide zachtjes in het PVC richting de gemeente crus tot een diepte van 1−2 mm (figuur 2E). Start de injectie door de 'uitvoeren' knop in te drukken op de pomp.
- Wacht na de injectie, ~ 2 min zodat het reagens te verspreiden. Trim het kleine stukje spier verzameld in stap 2.6 met micro-schaar. Vervolgens de injectie canule verwijderen en onmiddellijk de spier te plaatsen in het gat in het PVC.
Opmerking: Controleer voor iedere vloeistof lekt uit het gat na het inpluggen om ervoor te zorgen dat het gat volledig is afgesloten. - Terugkeer van de gescheiden spieren en onderhuidse weefsels. Sutuur (geologie) de incisie met behulp van een 5-0 hechtdraad. Desinfecteer de insnijding regio met Povidon jodium.
Opmerking: Alle bovenstaande chirurgische procedures duren ongeveer 25 min. - Positie het dier op een elektrische pad voorverwarmd tot ~ 37 ° C. Plaats het dier in de rechts zijligging voor herstel.
- Uitvoeren van auditieve brainstem response (ABR) metingen en proeven een week na de operatie18zwemmen.
- Desgewenst voeren herhaalde injecties in een ander gebied van de PSC of LSC.
3. Canalostomy in de neonatale muizen
- Gebruik onderkoeling te induceren en onderhouden van sedatie in neonatale muizen (FVB/N) postnatale dagen 1 tot 2 (P1-2). Plaats de pup op een bedje van plastic wrap-bedekte van crushed ijs voor ~ 4 min. Leg vervolgens de pup op een ijs gevulde platform. Desinfecteer het chirurgische gebied driemaal met 75% ethanol.
Opmerking: Zorg ervoor dat het hoofd van de pup uit het ijs. De gehele operatie met de pup op een platform van ijs gevulde uitvoeren. - De volgende stappen verschillen in de pasgeborene in vergelijking met de volwassen muizen.
- Maak een incisie ~ 3-mm postauricular van ~ 2 mm posterieure aan de auricular plooi (figuur 3A -B).
- Zacht maken een opening in het zachte PVC met behulp van een naald 26 G. De canule in het PVC invoegen zonder uitbreiding van de opening (Figuur 3 c -E).
- Gebruik een stuk spier te dekken, in plaats van de plug, de opening als deze kan leiden tot een breuk van het zachte PVC (figuur 3F) na injectie.
- Sluit de huid met behulp van een 6-0 hechtdraad.
- ABR metingen uitvoeren en zwemmen proeven op P3030.
- Ouderlijke kannibalisme is een veelvoorkomend probleem na de neonatale operatie. De volgende stappen verminderen de kans op ouderlijke kannibalisme.
- Veegt schoon het bloed rondom de incisie met alcohol na de operatie.
- Ervoor zorgen dat de pasgeborene zich vrij verplaatsen kan voordat u het terugkeert naar de dam.
- Uitstrijkje pasgeborenen met bevuilde beddengoed uit de Moederdag kooi en plaats die de pasgeborenen terug in het midden van het nest.
- Die geen operatie ondergaan moeten krijgen een soortgelijke postauricular ingesneden en hechtdraad.
- Scheid de reu uit de fok kooi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Snel-groene kleurstof werd geïnjecteerd in het PVC van volwassen en neonatale muizen zijn onmiddellijke verdeling in het binnenoor wilt evalueren. De kleurstof werd ontdekt in het slakkenhuis, vestibule en semicircular grachten onmiddellijk na de operatie (Figuur 4).
Om te beoordelen van de veiligheid en de efficiëntie van canalostomy voor binnenoor gene levering, werd AAV8-GFP geïnjecteerd in het binnenoor van volwassen en neonatale muizen. Alle dieren tentoongesteld normale ABR drempels en testscores zwemmen na AAV8-GFP injectie18,30. Immunohistology is gebleken dat, in de auditieve zintuiglijke epitheel, binnenste haarcellen (IHCs) en een paar buitenste haarcellen (OHCs) van de basale beurt toonde robuuste GFP expressie30. In de vestibulaire zintuiglijke epitheel, werd GFP expressie ontdekt in de utricle, saccule en ampullen30. Zowel de vestibulaire haarcellen (Figuur 5) en de ondersteunende cellen werden getransduceerde met hoge efficiëntie18,30.
Infusie van streptomycine door canalostomy induceert ernstige Haarcel verlies in de utricle18,34,38. Om te testen de haalbaarheid van meerdere injecties via canalostomy, kregen de muizen streptomycine via de LSC 7 dagen later gevolgd door AAV8-GFP schorsingen door het PVC. Dit experiment werd ook ontworpen om te evalueren van de kenmerken van de transductie van AAV8-GFP in de lesioned utricle, die was nuttig voor gene therapie studies in het binnenoor beschadigd na HC verlies18. GFP werd verspreid over de lesioned utricle (Figuur 6). Talrijke GFP-positieve cellen waren negatief voor myosin VIIA, die aangeeft dat zij werden getransduceerde SCs. Een paar HCs (myosin VIIa-positieve cellen) met onrijpe haar bundels uitgedrukt ook GFP.
Figuur 1: voorbereiding van het apparaat. (A) de polyimide buis (i) en de polyethyleen slang (ii) zijn verzegeld zodat een injectie canule (iii). (B) is de canule verbonden met een 10-µL micro-injectiespuit met een naald 30 G en vervolgens geïnstalleerd op een pomp. Pijl geeft aan dat het uiteinde van de canule. (C) injectie reagens en normale zout worden gescheiden door een luchtspleet. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Canalostomy in een volwassen muis. (A) een post auricular insnijding (pijl). (B) spieren die betrekking hebben op de temporale bot worden blootgesteld. Als we de wortel van de pinna (vet dot) als de oorsprong en het vlak definiëren evenwijdig aan de calvarium 3/9 uur, de achterste semicircular canal (PSC) en laterale semicircular canal (LSC) zijn over het algemeen gelegen in de regio tussen 2 en 3 uur (pentagram) , ~ 3 mm van de oorsprong. Inzet: lagere-vergroting afbeelding van de afdrukstand. De stippellijn geeft de calvarium vliegtuig. (C) de PSC en LSC zijn blootgesteld (stippellijnen). Inzet: De LSC is op een ongeveer 30° hoek van het vlak evenwijdig aan de calvarium, en het PVC is verticale naar de LSC. (D) een klein gaatje in het PVC wordt gemaakt. (E) het uiteinde van de canule wordt ingevoegd in het PVC en het reagens wordt geïnjecteerd. (F) het gat is verzegeld met een klein stukje van de spier. Schaal bar in A 5 mm, thats in B 1 mm (B voor B-F), dat in de inzet naar B is 1 cm, en dat de inzet tot C is 5 mm. is Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Canalostomy in een neonatale muis. (A) een post auricular insnijding (pijl). (B) spieren die betrekking hebben op de temporale bot zijn blootgesteld, en de achterste semicircular canal (PSC) is ~ 2 mm in de hoofdmap van de pinna (vet dot) bij 2-3 uur (pentagram). De afdrukstand is identiek aan dat bij volwassen muizen (figuur 2B). (C) de PSC en laterale semicircular canal (LSC) zijn blootgesteld (stippellijnen). (D) een kleine opening is gemaakt in het PVC. (E) de canule wordt ingevoegd in het PVC. (F) een klein stukje spier wordt gebruikt ter dekking van de opening na injectie. Schaal bars in A en B verzonken zijn 5 mm, thats in B 1 mm, en dat in C 1 mm (C voor C-F is). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Stereo microscopische beelden van de inner oren van volwassene (A-A') en neonatale muizen (B-B') toegediend snel-groene kleurstof via canalostomy. Monsters werden genomen onmiddellijk na de operatie. (A en B) Het extracranial oppervlak. (A' en B') Intracraniële oppervlak. Snel-groene kleurstof distribueert in het slakkenhuis, vestibule en semicircular grachten. Schaal bars zijn 1 mm (A' voor A-A 'en B voor B-B'). PSC, posterior semicircular kanaal. LSC, laterale semicircular kanaal. SSC, superieure semicircular kanaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: vertegenwoordiger confocal beelden van hele koppelingen van het slakkenhuis (A-A") en utricle (B-B") van volwassen muizen, bereid 30 dagen na AAV8-GFP injectie via canalostomy. Monsters zijn gekleurd met antilichamen voor GFP (groen) en myosin VIIa (rood). (A-A ") GFP wordt uitgedrukt in de meest binnenste haarcellen (IHC). (B-B ") In het brandvlak van de cuticular plaat van de utricle express talrijke haarcellen GFP (pijlen). GFP, groen fluorescent proteïne. Kopklep, buitenste haarcellen. Schaal bars zijn 25 µm (A"voor A-A ', B" voor B-B"). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: vertegenwoordiger confocal beelden van een getraumatiseerde utricle verkregen 30 dagen na AAV8-GFP injectie via canalostomy. Een volwassen muis werd geïnjecteerd met streptomycine via de laterale semicircular canal en 7 dagen later ingespoten met AAV8-GFP via het posterieure semicircular-kanaal. GFP (groen), myosin VIIa (rood) en actine (blauw). Pijlpunten geven aan representatieve ondersteunende cellen getransduceerde met AAV8-GFP (GFP +/ myosin VIIa-cellen), en pijlen geven aan representatieve haarcellen getransduceerde met AAV8-GFP (GFP +/ myosin VIIa + cellen) met onrijpe haar bundels. De bar van de schaal is 20 µm (D voor A-D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie toonden we dat drug levering door canalostomy hebben geleid tot de wijdverspreide distributie van het reagens in het slakkenhuis en vestibulaire einde-organen. Als een methode voor het binnenoor gene bezorgen, canalostomy geleid tot GFP expressie in de binnenste oren van volwassen en neonatale muizen met minimale schade aan gehoorbescherming en vestibulaire functie. Bovendien kunnen meerdere injecties gemakkelijk worden uitgevoerd in hetzelfde dier.
Een van de grootste troeven van canalostomy is dat het minimale schade veroorzaakt aan binnenoor functie, vooral in volwassen muizen16,18,28,29,30, die belangrijk is voor de beoordeling van beschermende effecten en voor translationeel aspecten. Verschillende groepen hebben gebruikt canalostomy om verschillende reagentia, zoals virale vectoren, siRNA en stamcellen aminoglycoside, leveren in de lymfkliertest binnenoor18,19,28,29, 34,35,,36,,37. In de huidige studie beschreven we stap voor stap, gedetailleerde chirurgische technieken van canalostomy in volwassen en neonatale muizen. Vergeleken met eerdere studies, bevat onze studie aanvullende bijzonderheden over de positionering van de semicircular-grachten, die is een belangrijke procedure voor succesvolle operatie. Zoals aangegeven in figuur 2B en C, waren de PSC en LSC over het algemeen gelegen ~ 3 mm in de hoofdmap van de pinna op 2-3 uur. De LSC was op een ongeveer 30° hoek van het vlak evenwijdig aan de calvarium, en het PVC was verticale naar de LSC. Bovendien, we de chirurgische procedures vereenvoudigd en verkort de chirurgische tijd om ongeveer 25 min met vergelijkbare resultaten29.
Tijdens de canalostomy is het noodzakelijk om te voorkomen lekkage op de injectieplaats en verstopping van de canule. Voordat over te schakelen op de pomp, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het uiteinde van de canule wordt ingevoegd in het semicircular-kanaal en dat is de canule niet gebogen of geblokkeerd. Droge spiermassa wordt geadviseerd om te worden gebruikt bij het afdichten van het gat in het semicircular-kanaal van volwassen muizen omdat, in aanwezigheid van semicircular canal de vloeistof, het breidt en stekkers van het gat (zie stap 2.6 en 2.10). Omdat de muur van het semicircular-kanaal van neonatale muizen zacht en breekbaar is, moet de opening door bekleding met autogene spier of medische lijm30worden verzegeld. We hebben ook verwijderd de canule zonder die betrekking hebben op de opening met spier; de resultaten geopenbaarde vergelijkbare AAV transductie efficiëntie in het binnenoor (gegevens niet worden weergegeven), die aangeeft dat de opening in het PVC van neonatale muizen op bevredigende wijze werd gesloten.
Een ander voordeel van canalostomy is de haalbaarheid van meerdere procedures, waardoor herhaalde toepassingen van dezelfde of een andere reagentia (Figuur 6). Omdat fibrotische en korreling weefsels zijn vaak te vinden op vorige chirurgische sites, en het semicircular-kanaal kan worden belemmerd na chirurgie34, het is raadzaam voor het uitvoeren van injecties tijdens herhaalde chirurgische ingrepen in een ander gedeelte van de laterale en/of posterior halfcirkelvormige kanalen18.
De belangrijkste beperking van canalostomy is de moeilijkheid bij het bepalen of de canule injectie de perilymphatic of endolymphatic ruimte wordt ingevoegd. Na toediening van adenovirale vectoren in het binnenoor16 via canalostomy, werden meest getransduceerde cellen gevestigd in de perilymphatic ruimte, wat suggereert dat de injectie waarschijnlijk uitgevoerd in dat gebied was. Laag moleculair gewicht verbindingen (bijvoorbeeld AAV streptomycine en siRNA) kunnen passeren de barrière tussen de perilymph en de endolymfe en bereiken de sensorische epitheel na injectie in de perilymphatic of endolymphatic ruimte18,19 ,34. Na injectie in de perilymph, kunnen reagentia blijven echter in de perilymphatic ruimte als ze niet kunnen doordringen de barrière tussen de perilymph en de endolymfe16,39,40 tot. Dus, de doorlaatbaarheid van de geïnjecteerde reagentia moet worden onderzocht voordat met behulp van canalostomy.
Kortom, resulteert canalostomy in een brede distributie van reagentia in het slakkenhuis en vestibule met minimale verstoring van gehoorbescherming en vestibulaire functie. De operatie is eenvoudig toe te passen in volwassen en neonatale muizen en meerdere procedures kunnen worden uitgevoerd indien nodig. Canalostomy is dus een effectieve en veilige benadering voor de levering van de drug in het binnenoor van knaagdieren en in de toekomst, klinisch kan worden gebruikt om menselijke cochleovestibular ziekten te behandelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten worden gedeclareerd.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidie-nummers 81570912, 81771016, 81100717).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
References
- Stachler, R. J., et al. Clinical practice guideline: sudden hearing loss. Otolaryngol Head Neck Surg. 146 (3 Suppl), S1-S35 (2012).
- Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19 (3), 345-350 (2013).
- Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
- El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
- Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane. J Vis Exp. (97), e52187 (2015).
- Ahmed, H., Shubina-Oleinik, O., Holt, J. R. Emerging Gene Therapies for Genetic Hearing Loss. J Assoc Res Otolaryngol. 18 (5), 649-670 (2017).
- Murillo-Cuesta, S., et al. A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection. J Vis Exp. (121), e54951 (2017).
- Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, P. C., Lang, H. The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration. J Vis Exp. (105), e53131 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Principles of local drug delivery to the inner ear. Audiol Neurootol. 14 (6), 350-360 (2009).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35 (3), 264-272 (2017).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Mol Med. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. J Neurosci Methods. 150 (1), 67-73 (2006).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice. Mol Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Bowers, W. J., et al. Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea. Mol Ther. 6 (1), 12-18 (2002).
- Wang, G. P., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer targeting normal and traumatized mouse utricle. Gene Ther. 21 (11), 958-966 (2014).
- Isgrig, K., et al. Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25 (3), 780-791 (2017).
- Gassner, D., Durham, D., Pfannenstiel, S. C., Brough, D. E., Staecker, H. Canalostomy as a surgical approach for cochlear gene therapy in the rat. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1830-1836 (2012).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac. Hum Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene transfection in neonatal mice using adeno-associated viral vector: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Chien, W. W., McDougald, D. S., Roy, S., Fitzgerald, T. S., Cunningham, L. L. Cochlear gene transfer mediated by adeno-associated virus: Comparison of two surgical approaches. Laryngoscope. 125 (11), 2557-2564 (2015).
- Zhu, B. Z., Saleh, J., Isgrig, K. T., Cunningham, L. L., Chien, W. W. Hearing Loss after Round Window Surgery in Mice Is due to Middle Ear Effusion. Audiol Neurootol. 21 (6), 356-364 (2017).
- Wang, Y., et al. Early postnatal virus inoculation into the scala media achieved extensive expression of exogenous green fluorescent protein in the inner ear and preserved auditory brainstem response thresholds. J Gene Med. 15 (3-4), 123-133 (2013).
- Lee, M. Y., et al. Survival of human embryonic stem cells implanted in the guinea pig auditory epithelium. Sci Rep. 7, 46058 (2017).
- Ishimoto, S., Kawamoto, K., Kanzaki, S., Raphael, Y. Gene transfer into supporting cells of the organ of Corti. Hear Res. 173 (1-2), 187-197 (2002).
- Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33 (4), 655-659 (2012).
- Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).
- Guo, J. Y., et al. Cochleovestibular gene transfer in neonatal mice by canalostomy. Neuroreport. 28 (11), 682-688 (2017).
- Beyea, J. A., Agrawal, S. K., Parnes, L. S. Transmastoid semicircular canal occlusion: a safe and highly effective treatment for benign paroxysmal positional vertigo and superior canal dehiscence. Laryngoscope. 122 (8), 1862-1866 (2012).
- Naples, J. G., Eisen, M. D. The History and Evolution of Surgery on the Vestibular Labyrinth. Otolaryngol Head Neck Surg. 155 (5), 816-819 (2016).
- Hamilton, L., Keh, S., Spielmann, P. M., Hussain, S. S. How we do it: locating the posterior semicircular canal in occlusion surgery for refractory benign paroxysmal positional vertigo: a cadaveric temporal bone study. Clinical Otolaryngology. 41 (2), 190-193 (2016).
- Jung, J. Y., et al. siRNA targeting Hes5 augments hair cell regeneration in aminoglycoside-damaged mouse utricle. Mol Ther. 21 (4), 834-841 (2013).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. Am J Pathol. 171 (1), 214-226 (2007).
- Pfannenstiel, S. C., Praetorius, M., Plinkert, P. K., Brough, D. E., Staecker, H. Bcl-2 gene therapy prevents aminoglycoside-induced degeneration of auditory and vestibular hair cells. Audiol Neurootol. 14 (4), 254-266 (2009).
- Kawamoto, K., Izumikawa, M., Beyer, L. A., Atkin, G. M., Raphael, Y. Spontaneous hair cell regeneration in the mouse utricle following gentamicin ototoxicity. Hear Res. 247 (1), 17-26 (2009).
- Wang, G. P., et al. Notch signaling and Atoh1 expression during hair cell regeneration in the mouse utricle. Hear Res. 267 (1-2), 61-70 (2010).
- Pietola, L., et al. HOX-GFP and WOX-GFP lentivirus vectors for inner ear gene transfer. Acta Otolaryngol. 128 (6), 613-620 (2008).
- Han, J. J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
