Nous présentons ici un protocole robuste et optimisé pour la production de quantités de milligramme de monomères natives, tag-free et les fibrilles de l’exon1 de la protéine huntingtine (Httex1) issu de la fusion transitoire du petit ubiquitine connexes modificateur (SUMO).
Maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative mortelle héréditaire causée par une expansion CAG (≥36) dans le premier exon du gène HD, ayant pour résultat l’expression de la protéine huntingtine (Htt) ou N-terminale des fragments celle-ci avec un (polyglutamine élargi tronçon de polyQ).
L’exon1 de la protéine huntingtine (Httex1) est le plus petit fragment Htt qui reprend bon nombre des fonctionnalités de HD de cellulaires et animaux modèles et est l’un des fragments plus largement étudiés de Htt. La petite taille de Httex1 rend expérimentalement plus propices à la caractérisation biophysique utilisant des techniques standards et haute résolution par rapport à des fragments plus longs ou long Htt. Toutefois, la propension de grande agrégation du mutant Httex1 (mHttex1) avec une augmentation polyQ de contenu (≥42) a rendu difficile de développer l’expression efficace et des systèmes de purification de produire ces protéines en quantité suffisante et les rendre accessibles aux scientifiques de diverses disciplines sans l’utilisation de protéines de fusion ou d’autres stratégies qui modifient la séquence native de la protéine. Nous présentons ici une méthode robuste et optimisée pour la production de quantités de milligramme d’indigène, tag-gratuit Httex1 issu de la fusion transitoire du petit ubiquitine connexes modificateur (SUMO). La simplicité et l’efficacité de la stratégie permettra d’éliminer la nécessité d’utiliser des séquences non indigènes de Httex1, donc rendre cette protéine plus accessibles aux chercheurs et améliorer la reproductibilité des expériences dans différents laboratoires. Nous croyons que ces avancées facilitera également les futures études visant à élucider la relation structure-fonction de Htt ainsi qu’en développement de nouveaux outils diagnostiques et de thérapies pour traiter ou ralentir la progression de la HD.
HTT est une protéine de 348 kDa et a été impliquée dans plusieurs fonctions physiologiques1. Lorsque Htt contient une région polyQ élargi de plus de 36 résidus dans son extrémité N-terminale, elle provoque HD2,3. Pathologie de la HD est caractérisée par des inclusions cellulaires dans le striatum et le cortex, ce qui conduit à la mort neuronale et une atrophie des tissus affectés4,5. Plusieurs fragments de N-terminal Htt qui contiennent le tractus de répétition de polyQ ont été détectés dans les cerveaux post mortem de patients HD et sont censés être générés par le traitement protéolytique de la protéine de la huntingtine6. Des études récentes suggèrent que Httex1 pourrait également être formé en raison de l’épissage des ARNm aberrants. Httex1 contient la mutation pathologique polyQ et sa surexpression chez les animaux peut récapituler nombreuses fonctionnalités clées de HD7, mettant ainsi en évidence un possible rôle central de ce fragment en HD pathologie et maladie progression6, 8,9.
En raison de la forte agrégation propension de mutant Httex1 (mHttex1) avec des voies élargis polyQ, la majorité des systèmes d’expression actuels est basée sur la fusion transitoire de Httex1 aux protéines (comme la glutathion-S-transférase (GST), thiorédoxine (TRX) ou protéine-liant-maltose (MBP) et/ou des peptides (poly-histidine) différemment d’améliorer son expression, de stabilité, de purification ou de solubilité10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Le partenaire de fusion est lié à Httex1 avec une courte séquence contenant un site de clivage des protéases comme la trypsine, tabacco etch protéase du virus (TEV) ou PreScission pour permettre le clivage et la libération de Httex1 avant l’ouverture de l’agrégation ou purification. Insuffisances de ces méthodes incluent la possibilité de laisser des résidus supplémentaires en raison de la non-chimiothèques clivage et la création de fragments tronquées en raison de le miscleavage au sein de la séquence de Httex1, en plus de l’hétérogénéité en raison du clivage incomplet ( Voir Vieweg, et al. , pour une discussion plus approfondie sur les avantages et les limites de cette approche)10. Pour pallier ces lacunes, nous avons récemment mis au point une stratégie d’expression permettant la génération de Httex1-sans tag native pour la première fois en utilisant une fusion de N-terminal transitoire de Synechocystis sp. (Ssp) DnaB intein à Httex110. Alors que le clivage intein chimiothèques est précis et donne la quantité de mg de protéines, il souffre encore deux inconvénients qui pourraient diminuer le rendement : nommément prématuré clivage de l’intein qui peut se produire lors de l’expression et le fait qu’un clivage se produit au cours plusieurs heures, ce qui pourraient conduire à la perte de protéines en raison de l’agrégation, surtout pour les Httex1 de polyQ expansé répétitions.
Pour pallier ces lacunes et d’affiner notre stratégie pour la production de natif, sans tag Httex1, nous avons développé un nouveau système d’expression issu de la fusion transitoire du SUMO, plus exactement l’homologue de levure Smt3 à Httex1. L’application du système de production de protéines recombinantes SUMO a été publiée en 200429, où une augmentation du taux d’expression et de la solubilité de la protéine de fusion de SUMO a été démontrées. La balise SUMO peut être clivée par l’ubiquitine comme protéine spécifique protéase 1 (ULP1), qui ne nécessite pas un site de reconnaissance, mais reconnaît la structure tertiaire de SUMO et élimine pratiquement la possibilité de miscleavage30. Par ailleurs, le clivage ULP1 médiation est rapide et chimiothèques et ne laisse aucun résidu supplémentaire. Le clivage prématuré de la balise de fusion, tel qu’observé avec l’intein autocatalytique10, est complètement évité par l’exigence d’une protéase externe. Alors que la stratégie SUMO est aujourd’hui largement utilisée pour la production de protéine recombinante31,32,33, nous montrons dans cet article qu’il est particulièrement utile pour la génération d’un intrinsèquement désordonnés, sujettes à l’agrégation, protéine amyloïdogène tels que Httex1. Nous croyons que la simplicité, l’efficacité et la robustesse de notre méthode basée sur la fusion-SUMO vont faire Httex1 native, tag-free plus accessible aux chercheurs de différentes disciplines et élimine la nécessité d’utiliser des séquences non indigènes de Httex1 in vitro . Il s’agit d’une avancée importante qui permettra de faciliter les études futures afin d’élucider la relation structure-fonction de Httex1.
Le protocole décrit la purification de Httex1 de 12 L de culture bactérienne, mais le protocole pourrait être facilement adapté pour les productions plus petite ou plus grande échelle. Le protocole décrit la préparation de type sauvage Httex1 (wtHttex1) avec une longueur de répéter polyQ ci-dessous (23Q) et le mutant Httex1 (mHttex1) avec un polyQ répéter longueur au-dessus (43Q) le seuil pathogène (36Q).
Dans ce protocole, nous avons défini une méthode efficace pour obtenir quantités de milligramme de natif, non identifié Httex1 contenant des résidus de glutamine 23 ou 43. Ceci a été réalisé en exprimant Httex1 comme une fusion de C-terminal de son6-balise SUMO, qui sert à isoler la protéine de fusion depuis le lysat cellulaire par IMAC et est clivé avant purification HPLC de Httex1. Alors que la stratégie SUMO a été utilisée dans la production de plusieurs autres protéines, notre méthode montre que les propriétés uniques que Sumo pourrait également être utilisé pour générer intrinsèquement désordonnés, sujettes à l’agrégation, protéine amyloïdogène qui se sont déjà révélés extrêmement difficile à gérer et produire43,44. Nous présentons un protocole qui est simple, facile à utiliser et comparable à un protocole pour la production d’une protéine « sage ». La fusion de SUMO solubilise et stabilise la Httex1 pendant l’expression et la purification d’IMAC. Clivage prématuré de la balise, comme observé avec la stratégie d’intein10 et agrégation n’étaient plus un problème.
Protéines intrinsèquement désordonnées sont particulièrement vulnérables à la dégradation. Alors que la dégradation de le N-terminale de la région de la N17 n’est pas un problème à l’aide de ce protocole, troncatures dans le PRD de Httex1 peuvent se produire. Comme les protéines tronquées sont très semblables à Httex1 hydrophobie, responsable et taille, il est difficile de les enlever par des moyens chromatographiques, donc il est préférable de prévenir leur formation en premier lieu. S’en tenir étroitement au protocole, toujours sur la glace en utilisant une quantité suffisante d’inhibiteur de protéase devraient aider maintenir le niveau de troncature observée très faible. Appliquer une balise de fusion à l’extrémité C-terminale de Httex1 a pu supprimer troncations dans le PRD facilement comme la protéine tronquée perdrait la balise affinité ainsi. Toutefois, si la séquence native doit être maintenue à que cette option ne peut être appliquée comme Httex1 se termine par la proline et au mieux de notre connaissance, il n’y a aucune balise de fusion C-terminale qui est connus pour induire un clivage chimiothèques et efficace après proline.
La partie la plus critique du protocole est le traitement de la Httex1 libéré après clivage de la balise SUMO par ULP1. La protéine doit être purifiée immédiatement par RP-HPLC. Heureusement, c’est une réaction efficace et rapide qui est habituellement réalisée dans 10-20 min à 4 ° C. En revanche, la stratégie d’intein exige plusieurs heures pour le clivage complet de l’intein, ce qui nécessite un compromis entre un clivage incomplet et agrégation de début afin de maximiser le rendement. Un bilan rapide est obligatoire pour mutant Httex1, car il va commencer à agréger à la concentration relativement élevée dans la réaction de clivage, tandis que la variante 23Q est stable pendant une longue période. Au cours de la purification de RP-HPLC, apparaît un autre avantage du SUMO : alors que le Ssp DnaB intein est hydrophobe et s’en tient fermement à la colonne, SUMO est plus hydrophile et élué complètement de la colonne de phase inversée de C4. Bien que commercial ULP1 est très coûteux, la protéine peut être facilement produite des rendements élevés suivant les protocoles publiés antérieurement29.
L’importance cruciale de l’application d’un protocole de ventilation avant d’utiliser le Httex1 ne peut pas être assez souligné. PolyQ lyophilisée protéines telles que les Httex1 sont stables et peuvent être stockées longtemps, mais ne sont pas complètement solubles dans l’eau et les tampons. La présence d’oligomères préformés ou fibrilles pourrait avoir un impact significatif sur la cinétique de l’agrégation et les propriétés biophysiques de la protéine45. Le protocole de désagrégation décrit ici permet la ventilation de la protéine, l’élimination des agrégats préformés et génération d’une solution de monomère Httex1 auprès d’un échantillon lyophilisé. Nous avons observé l’agrégation cinétique et fibrilles une morphologie semblable pour Httex1 obtenus avec le SUMO et la stratégie d’intein.
Par rapport aux méthodes précédentes de production Httex1, la stratégie SUMO décrite ici offre plusieurs avantages et élargit l’éventail des études possibles pour étudier la structure et les propriétés fonctionnelles de cette protéine dans la santé et la maladie. La protéine de fusion de SUMO-Httex1 est facile à manipuler, il peut être congelé et stocké ou maintenu dans la solution pendant 24 h à température ambiante, tandis que le mHttex1 libre serait regrouper rapidement. La stabilité et la grande solubilité des protéines SUMO-Httex1 fusion fournissent une plus grande flexibilité pour manipuler la protéine et/ou introduisent des modifications dans mHttex1 qui serait autrement impossible après clivage enzymatiques et chimiques. Cela inclut l’introduction de modifications post-traductionnelles, fluorophores, marqueurs de spin, balises de biotine, etc. les avances présentées ici devraient 1) faciliter les futures études afin d’élucider les relations structure-fonction des Httex1 ; 2) génèrent de nouveaux outils pour étudier l’agrégation Htt et la diffusion de la pathologie ; 3) permettent le développement de nouveaux tests pour identifier les molécules qui stabilisent mutant Httex1 et empêchent son agrégation ; et 4) encourager les scientifiques dans d’autres domaines pour apporter à travailler sur cette protéine et rejoignez notre quête pour trouver des remèdes pour la maladie de Huntington.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé principalement par des subventions de la Fondation CHDI et la Swiss National Science Foundation. Nous remercions Dr Sophie Vieweg discussions utiles lors de l’élaboration de ce nouveau système d’expression et d’autres membres du groupe Lashuel pour partager leur expérience avec ce système d’expression et leur entrée et précieux commentaires. Nous remercions également Prof. Oliver Hantschel fournissant le plasmide ULP1. Les auteurs tiennent à remercier Dr. John B. Warner et Dr Senthil K. Thangaraj examen critique du manuscrit
Uranyl formate (UO2(CHO2)2) | EMS | 22450 | |
Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids | EMS | FCF200-Cu-50 | |
High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics | HellmaAnalytics | 110-1-40 | |
Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA | Witech | SVA4730203 | |
Ampicillin | AxonLab | A0839.0100 | |
Luria Broth (Miller's LB Broth) | Chemie Brunschwig | 1551.05 | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | AxonLab | A1008.0025 | |
E. coli B ER2566 | NEB | NEB# E4130 | |
Imidazole | Sigma | 56750-500G | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82 | Merck Millipore Corporation | MAB5492 | |
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L) | Licor | 925-68070 | |
PMSF | AxonLab | A0999.0005 | |
HisPrep 16/10 column | GE Healthcare | 28936551 | |
C4 HPLC column | Phenomenex | 00G-4168.P0 | 10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19×10 mm guard column, not temperature jacketed |
Acetonitrile HPLC | MachereyNagel | C2502 | |
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile | Sarstedt AG | 83.1826 | |
Spectrophotometer semi-micro cuvette | Reactolab S.A. | 2534 | |
Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml | GE Healthcare | 18111382 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml | Greiner Bio-One | 7.160 102 | |
100 kD Microcon fast flow filters | Merck Millipore Corporation | MRCF0R100 | |
Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor | Sonics | ||
Äkta 900 equipped with a fraction collector | GE Healthcare | ||
Jasco J-815 Circular Dichroism | Jasco | ||
Waters UPLC system | Waters | C8 BEH acquity 2.1×100 mm 1.7 micron column , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL | |
waters HPLC system | Waters | 2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing | |
ESI-MS: Finnigan LTQ | Thermo Fisher Scientific | ||
lyophylizer instrument | FreeZone 2.5 Plus | ||
Tecnai Spirit BioTWIN | FEI | electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV | |
37 °C shaking incubator | Infors HT multitron Standard | ||
Biophotometer plus | Eppendorf |