Summary
Nous présentons ici un protocole robuste et optimisé pour la production de quantités de milligramme de monomères natives, tag-free et les fibrilles de l’exon1 de la protéine huntingtine (Httex1) issu de la fusion transitoire du petit ubiquitine connexes modificateur (SUMO).
Abstract
Maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative mortelle héréditaire causée par une expansion CAG (≥36) dans le premier exon du gène HD, ayant pour résultat l’expression de la protéine huntingtine (Htt) ou N-terminale des fragments celle-ci avec un (polyglutamine élargi tronçon de polyQ).
L’exon1 de la protéine huntingtine (Httex1) est le plus petit fragment Htt qui reprend bon nombre des fonctionnalités de HD de cellulaires et animaux modèles et est l’un des fragments plus largement étudiés de Htt. La petite taille de Httex1 rend expérimentalement plus propices à la caractérisation biophysique utilisant des techniques standards et haute résolution par rapport à des fragments plus longs ou long Htt. Toutefois, la propension de grande agrégation du mutant Httex1 (mHttex1) avec une augmentation polyQ de contenu (≥42) a rendu difficile de développer l’expression efficace et des systèmes de purification de produire ces protéines en quantité suffisante et les rendre accessibles aux scientifiques de diverses disciplines sans l’utilisation de protéines de fusion ou d’autres stratégies qui modifient la séquence native de la protéine. Nous présentons ici une méthode robuste et optimisée pour la production de quantités de milligramme d’indigène, tag-gratuit Httex1 issu de la fusion transitoire du petit ubiquitine connexes modificateur (SUMO). La simplicité et l’efficacité de la stratégie permettra d’éliminer la nécessité d’utiliser des séquences non indigènes de Httex1, donc rendre cette protéine plus accessibles aux chercheurs et améliorer la reproductibilité des expériences dans différents laboratoires. Nous croyons que ces avancées facilitera également les futures études visant à élucider la relation structure-fonction de Htt ainsi qu’en développement de nouveaux outils diagnostiques et de thérapies pour traiter ou ralentir la progression de la HD.
Introduction
HTT est une protéine de 348 kDa et a été impliquée dans plusieurs fonctions physiologiques1. Lorsque Htt contient une région polyQ élargi de plus de 36 résidus dans son extrémité N-terminale, elle provoque HD2,3. Pathologie de la HD est caractérisée par des inclusions cellulaires dans le striatum et le cortex, ce qui conduit à la mort neuronale et une atrophie des tissus affectés4,5. Plusieurs fragments de N-terminal Htt qui contiennent le tractus de répétition de polyQ ont été détectés dans les cerveaux post mortem de patients HD et sont censés être générés par le traitement protéolytique de la protéine de la huntingtine6. Des études récentes suggèrent que Httex1 pourrait également être formé en raison de l’épissage des ARNm aberrants. Httex1 contient la mutation pathologique polyQ et sa surexpression chez les animaux peut récapituler nombreuses fonctionnalités clées de HD7, mettant ainsi en évidence un possible rôle central de ce fragment en HD pathologie et maladie progression6, 8,9.
En raison de la forte agrégation propension de mutant Httex1 (mHttex1) avec des voies élargis polyQ, la majorité des systèmes d’expression actuels est basée sur la fusion transitoire de Httex1 aux protéines (comme la glutathion-S-transférase (GST), thiorédoxine (TRX) ou protéine-liant-maltose (MBP) et/ou des peptides (poly-histidine) différemment d’améliorer son expression, de stabilité, de purification ou de solubilité10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Le partenaire de fusion est lié à Httex1 avec une courte séquence contenant un site de clivage des protéases comme la trypsine, tabacco etch protéase du virus (TEV) ou PreScission pour permettre le clivage et la libération de Httex1 avant l’ouverture de l’agrégation ou purification. Insuffisances de ces méthodes incluent la possibilité de laisser des résidus supplémentaires en raison de la non-chimiothèques clivage et la création de fragments tronquées en raison de le miscleavage au sein de la séquence de Httex1, en plus de l’hétérogénéité en raison du clivage incomplet ( Voir Vieweg, et al. , pour une discussion plus approfondie sur les avantages et les limites de cette approche)10. Pour pallier ces lacunes, nous avons récemment mis au point une stratégie d’expression permettant la génération de Httex1-sans tag native pour la première fois en utilisant une fusion de N-terminal transitoire de Synechocystis sp. (Ssp) DnaB intein à Httex110. Alors que le clivage intein chimiothèques est précis et donne la quantité de mg de protéines, il souffre encore deux inconvénients qui pourraient diminuer le rendement : nommément prématuré clivage de l’intein qui peut se produire lors de l’expression et le fait qu’un clivage se produit au cours plusieurs heures, ce qui pourraient conduire à la perte de protéines en raison de l’agrégation, surtout pour les Httex1 de polyQ expansé répétitions.
Pour pallier ces lacunes et d’affiner notre stratégie pour la production de natif, sans tag Httex1, nous avons développé un nouveau système d’expression issu de la fusion transitoire du SUMO, plus exactement l’homologue de levure Smt3 à Httex1. L’application du système de production de protéines recombinantes SUMO a été publiée en 200429, où une augmentation du taux d’expression et de la solubilité de la protéine de fusion de SUMO a été démontrées. La balise SUMO peut être clivée par l’ubiquitine comme protéine spécifique protéase 1 (ULP1), qui ne nécessite pas un site de reconnaissance, mais reconnaît la structure tertiaire de SUMO et élimine pratiquement la possibilité de miscleavage30. Par ailleurs, le clivage ULP1 médiation est rapide et chimiothèques et ne laisse aucun résidu supplémentaire. Le clivage prématuré de la balise de fusion, tel qu’observé avec l’intein autocatalytique10, est complètement évité par l’exigence d’une protéase externe. Alors que la stratégie SUMO est aujourd'hui largement utilisée pour la production de protéine recombinante31,32,33, nous montrons dans cet article qu’il est particulièrement utile pour la génération d’un intrinsèquement désordonnés, sujettes à l’agrégation, protéine amyloïdogène tels que Httex1. Nous croyons que la simplicité, l’efficacité et la robustesse de notre méthode basée sur la fusion-SUMO vont faire Httex1 native, tag-free plus accessible aux chercheurs de différentes disciplines et élimine la nécessité d’utiliser des séquences non indigènes de Httex1 in vitro . Il s’agit d’une avancée importante qui permettra de faciliter les études futures afin d’élucider la relation structure-fonction de Httex1.
Le protocole décrit la purification de Httex1 de 12 L de culture bactérienne, mais le protocole pourrait être facilement adapté pour les productions plus petite ou plus grande échelle. Le protocole décrit la préparation de type sauvage Httex1 (wtHttex1) avec une longueur de répéter polyQ ci-dessous (23Q) et le mutant Httex1 (mHttex1) avec un polyQ répéter longueur au-dessus (43Q) le seuil pathogène (36Q).
Protocol
1. expression de recombinaison Httex1 23Q et 43Q
- Préparez les tampons nécessaires et les solutions. Préparer 1000 x solution mère de l’ampicilline (AMP, 100 mg/mL), filtre (0,2 µm), aliquote et conserver à-20 ° C. Préparer lysogénie bouillon (LB) milieu (25 g LB Miller par 1 L H2O), autoclave. Préparer la solution stock 1 M isopropylique ß-D-1thiogalactopyranoside (IPTG), filtre (0,2 µm), partie aliquote et magasin à-20 ° C.
- Transformation chimique compétentes d' Escherichia coli B ER 2566 avec un vecteur de pTWIN1, contenant Httex1 humain fusionné à une balise N-terminal His6-SUMO avec la méthode de choc thermique34.
Remarque : La souche d’e. coli BL21 DE3 a également été utilisée. Toutefois, dans ce cas une quantité accrue de troncations a été observée. - Inoculer 200 mL de milieu LB avec 1 x AMP dans une fiole conique de 1 L en ajoutant une seule colonie de la gélose avec une pointe de pipette stériles. Incuber la culture à 30 ° C et 180 tr/min pendant 20 h (une nuit) dans un incubateur bactérien.
- Prendre un échantillon de la culture avec une pipette stérile de 1 mL. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) de l’échantillon avec une cuvette en plastique jetable et d’un photomètre (respect de la mesure comprise entre 0,1 et 1, diluer avec LB-médium si nécessaire). Calculer le montant de préculture qui se traduira par un départ de l’OD600 de 0,05 dans une culture de 3 L (avec une préculture de OD600 = 3 cela signifierait 50 mL).
- Inoculer les quatre cultures (chaque 3 L de milieu LB avec 1 x ampli dans une fiole de 5 L), en ajoutant la quantité calculée de préculture avec une pipette stérile. Incuber les cultures à 37 ° C et 180 tr/min dans un incubateur bactérien.
- Toutes les 30 minutes, prendre un échantillon de la culture avec une pipette stérile de 1 mL. Mesurer l' OD600 de l’échantillon avec une cuvette en plastique jetable et d’un photomètre. Quand OD600 atteint 0,1 (typiquement après 1-2 h), régler la température de l’étuve bactérienne à 14 ° C et poursuivre l’incubation en refroidissant. Toutes les 30 minutes, prendre un échantillon de la culture avec une pipette stérile de 1 mL. Mesurer l' OD600 de l’échantillon avec une cuvette en plastique jetable et d’un photomètre.
Remarque : Le temps de refroidir les cultures peut varier avec l’incubateur utilisé, donc le temps de commencer à refroidissement pourrait avoir à adapter selon le type d’incubateur utilisé. Cependant, changer le gradient de température n’ait un faible impact sur le rendement comme la protéine de fusion SUMO semble être relativement stable. - Quand OD600 atteint 0,3-0,4 (typiquement après 1-2 h), prélever un échantillon d’aptitude préalable de la culture pour l’analyse de la surexpression de SDS-PAGE. Calculer la taille de l’échantillon qui donne une quantité comparable de cellules et un bon signal sur le bleu de Coomassie colorées SDS-PAGE : pour un 10 bien gel : volume = 0,2 mL/OD600; prendre la moitié pour un gel bien 15.
- Pour une culture bactérienne avec une OD600= 0,4, prendre 500 µL. Prendre le volume calculé de culture bactérienne avec une pipette stérile. Tournez en bas de l’échantillon (18000 x g, 4 ° C, 2 min) et éliminer le surnageant. Garder le diabolo à-20 ° C jusqu’au moment de l’utiliser pour l’analyse (étape 1.11).
- Induire l’expression de la protéine par pipetage 1,2 mL d’une solution mère de IPTG de 1 M à chaque solution de culture de 3 L (concentration finale 0,4 mM). Poursuivre l’incubation de la culture à 14 ° C pendant 16 h (une nuit).
Remarque : La température aura généralement atteint ~ 20 ° C au moment où QU'IPTG est ajouté, selon la performance de l’incubateur. - Prélever un échantillon après induction de la culture pour l’analyse de la surexpression, suivant la procédure décrite à l’étape 1.7 SDS-PAGE.
- Récolter les cellules par centrifugation dans des tubes de 1 L (3993 x g, 4 ° C, 10 min). Jeter le surnageant, garder le culot cellulaire sur la glace et passez directement à la purification.
- Analyser la surexpression par SDS-PAGE35,,36. Remettre en suspension les échantillons avant et après induction dans 20 µL de tampon et 20 µL de 2 x teinture de chargement. Faites chauffer les échantillons pendant 5 min à 95 ° C dans un bloc chauffant et charger 20 µL sur un gel de 15 % lorsqu’elle est encore chaude. Exécutez le gel pendant 90 min à 180 V. tache le gel avec du bleu de Coomassie teindre selon les instructions du fabricant. Comparer les résultats avec les résultats représentatifs dans la Figure 1C.
Remarque : Le protocole peut être arrêté ici, le culot cellulaire peut être congelé et conservé à-80 ° C pendant plusieurs semaines. Pour des résultats optimaux, il est recommandé d’utiliser le culot de bactéries fraîche et éviter le gel. Gel-dégel pourrait conduire à la lyse des cellules et de la dégradation des Httex1. Cela peut réduire le rendement et la qualité de la protéine.
2. cellules Lysis et Purification de son6-protéine de Fusion Httex1 SUMO immobilisée par chromatographie d’affinité métallique (IMAC)
- Préparer 2 L de tampons A dans une bouteille en verre (50 mM Tris (hydroxyméthyl)-aminomethan (Tris), 500 mM NaCl, imidazole de 15 mM). Préparer 1 L de tampon B (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 500 millimètres imidazole pH 7,4) dans une bouteille en verre. Après la dissolution des sels, ajuster le pH avec 10 N HCl et filtrer les solutions dans des bouteilles frais avec un bouteille de filtre supérieur (0,65 µm). Préparer un fluorure de x phenylmethylsulfonyl 1000 (PMSF, 0,3 M) stock solution, aliquote de 100 µL et conserver à-20 ° C.
Remarque : Le protocole est conçu pour permettre de remplir toutes les étapes de la lyse des bactéries boulettes à haute performance en phase inversée chromatographie en phase liquide (CLHP-PI) purification et lyophilisation dans les 8-9 h. Pour limiter la protéolyse et agrégation, il est recommandé de travailler rapidement sans faire de pause et effectuez toutes les opérations à 4 ° C ou sur la glace. - Ajouter 100 µL de la solution mère de PMSF et cinq comprimés (1 / 30 mL de volume final) de l’inhibiteur de protéase dans 100 mL de tampon préalablement réfrigérée A. ajouter le culot bactérien dans la mémoire tampon et homogénéiser la suspension par agitation avec une barre magnétique de remuer et de pipetage et descendre wi e une pipette stérile de 10 mL (~ 30 min).
- Diviser la suspension de bactéries en aliquotes de 40 mL dans des tubes en plastique jetables 50 mL. Soniquer chaque aliquote dans un lot d’eau/de glace pour la lyse cellulaire (amplitude de 70 %, temps de sonication total 5 min, intervalles de 30 sonication s, 30 pause s).
Remarque : Il est important que l’échantillon ne chauffe pas pendant l’étape de la sonication. Il est recommandé d’ajouter un peu d’eau pour le bain de glace pour améliorer la dissipation de la chaleur au cours de la sonication. La procédure de sonication devrez peut-être être adapté si l'on utilise un instrument différent. Autres méthodes de lyse comme une presse de Français ou d’un microfluidiseur devraient fonctionner aussi bien et peuvent être bénéfiques pour éviter un échauffement de l’agrégation de l’échantillon et en protéines. Ces appareils n’étaient pas disponibles dans notre laboratoire et nous avons obtenu de bons résultats avec notre protocole de sonication. - Prélever un échantillon de 50 µL du lysat de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel analyse par électrophorèse (SDS-PAGE). Centrifuger l’échantillon (18000 x g, 4 ° C, 2 min) et Pipeter la fraction soluble dans un nouveau tube à essai. Resuspendre la fraction insoluble dans 50 µL de tampons A avec une pipette. Conserver les échantillons sur la glace jusqu'à l’analyse SDS-PAGE (étape 2.6).
- Clarifier le lysat par centrifugation (39191 x g, 4 ° C, 60 min).
- Au cours de l’étape de centrifugation, analyser l’étape de la lyse cellulaire par SDS-PAGE. Ajouter 50 µL de 2 x chargement colorant à la fraction soluble et insoluble de la lysat respectivement. Faire chauffer pendant 5 min à 95 ° C et charger 2 µL sur un gel de 15 % lorsqu’elle est encore chaude. Exécutez le gel pendant 90 min à 180 V. tache le gel avec du bleu de Coomassie teindre selon les instructions du fabricant. Comparer les résultats avec les résultats représentatifs dans la Figure 1C.
- Filtrer le liquide surnageant (0,45 µm, filtres de seringue). Prélever un échantillon de 20 µL du surnageant filtré pour analyse SDS-PAGE (étape 2.11).
Remarque : En règle générale, un volume de 90 à 100 mL du surnageant clarifié et filtrée est obtenu. 3 filtres de seringue sont habituellement suffisantes. Si la filtration est lourde, essayez d’augmenter la vitesse de centrifugation et/ou de la durée. - Isoler la protéine de fusion His6-SUMO Httex1 de la clarification bactérienne lysat par chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC) sur un système de chromatographie en phase liquide (FPLC) performances rapides à 4 ° C,37.
- Remplir le clarifié lysat superloop et charge sur la colonne de Ni-NTA (dépouillé, nettoyé et rechargé selon le manuel du fabricant, un témoin précédent est recommandé) à 2 mL/min. Pass 10 volumes de colonne (CV, 200 mL) de tampons A à 10 mL/min à laver les protéines non lié.
- Éluer la protéine de fusion avec 2.5 CV (50 mL) de 100 % de tampon B à 2 mL/min. Utilisez une taille de fraction de 50 mL pour le chargement et de lavage et 5 mL d’élution. Comparer les résultats avec les résultats représentatifs dans la Figure 1D.
- Prélever un échantillon de chaque fraction pour analyse SDS-PAGE (20 µL) et mettre en commun les fractions contenant la protéine de fusion selon le pic du chromatogramme IMAC. Ajouter (2 s, 3 s) - 1, 4 - Bis (sulfanyl) butane-2, 3-diol (TNT) et L-cystéine (concentration finale 100 mM chacun) comme une poudre et dissoudre en retournant doucement le tube.
NOTE : D’après notre expérience, la pureté de la protéine de fusion dans les différentes fractions est comparable. Par précaution, les fractions de la protéine purifiée de fusion devraient être rassemblées rapidement après l’IMAC pour empêcher l’agrégation des fractions hautement concentrées. En outre, il est recommandé de procéder directement sur le clivage de la balise SUMO et purification HPLC. Si nécessaire, le protocole peut être arrêté ici. La solution diluée de la protéine de fusion a été congelée dans l’azote liquide, stockée à-80 ° C et purifiée après décongélation sans une réduction significative de rendement. Stockage de la solution diluée de la protéine de fusion à 4 ° C pendant 24 h donne également des résultats similaires. - Analyser l’IMAC par SDS-PAGE. Ajouter 20 µL de colorant dans chaque échantillon de chargement. Charger 2 µL de la matière brute (2.7), la fraction libre, la fraction de lavage et chaque fraction du pic d’élution sur un gel de 15 %. Exécutez le gel pendant 90 min à 180 V. tache le gel avec du bleu de Coomassie teindre selon les instructions du fabricant. Comparer les résultats avec les résultats représentatifs dans la Figure 1D.
3. le clivage de la sa6-SUMO-tag et Purification HPLC
ATTENTION : L’acide trifluoroacétique (TFA) est un liquide volatil et peuvent occasionner des brulures graves donc manipuler avec soin. Procéder à toute manipulation sous une hotte et porter les équipements de protection individuelle adéquats (c.-à-d., gants jetables en nitrile, lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire).
- Dans une bouteille de 5 L, ajouter 5 mL d’AGT avec une seringue en plastique de 5 L d’eau (solvant A: H2O, 0,1 % (TFA). Ajouter 2,5 mL de TFA avec une seringue en plastique dans une bouteille de 2,5 L d’acétonitrile (solvant B: acétonitrile, 0,1 % TFA).
- Préparer le système HPLC tel que suggéré par le fabricant. Effectuer un run vide afin d’assurer une colonne propre.
- Prélever un échantillon de 100 µL de la protéine de fusion avant l’ajout de ULP1 pour surveiller la réaction de clivage de l’UPLC (étape 3.5).
- Transférer 20 mL de la protéine de fusion dans un nouveau tube de 50 mL et ajouter 0,4 mL de solution mère ULP1, incuber sur glace. Garder la protéine de fusion restants sur la glace.
Remarque : Le son-le tag catalytique fragment 403-621 de la protéase spécifique Ubiquitin-like 1 (dénommé ici « ULP1 ») a été utilisé en conjonction avec la balise SUMO. La protéine de fusion est plus stable que le Httex1 clivées. Il est recommandé de ne pas s’attacher l’étiquette de SUMO de l’ensemble du lot. Au lieu de cela, continuer avec aliquotes d’une taille qui peut être appliqué directement et complètement à la colonne HPLC. - Toutes les 10 minutes, prendre un échantillon de 100 µL de la réaction de clivage pour surveiller les progrès réalisés par chromatographie liquide à ultra performance (UPLC). Centrifuger les échantillons (18000 tr/min, 4 ° C, 2 min) et d’analyser 2 µL du liquide surnageant par UPLC (pente de 10 % à 90 % de solvant B à A de 0,25 à 3 min, 10 % B pendant 1 min, reportez-vous aux instructions du fabricant pour l’utilisation de l’instrument). Comparer les chromatogrammes obtenus pour l’échantillon avant l’ajout des ULP1 et les échantillons prélevés. Comparer les résultats avec les résultats représentatifs dans la Figure 2B.
- Une fois que le SUMO-clivage est terminé (le pic de la protéine de fusion a disparu dans le chromatogramme de l’UPLC et est entièrement converti au pic nouvellement comparante de SUMO et Httex1), filtrer l’échantillon avec une seringue-filtre (0,22 µm).
Remarque : Le clivage SUMO est généralement très rapide (10-20 min à 4 ° C) analyse UPLC avec un temps de 4 min constitue donc un outil précieux pour surveiller la réaction. Filtrage de l’échantillon avant la HPLC purification est principalement une mesure préventive pour augmenter la durée de vie de la colonne. L’échantillon ne devrait pas tourner turbide. - Purifier l’échantillon filtré par RP-HPLC (gradient de 25 à 35 % de solvant B a solvant, à plus de 40 min à 15 mL/min. (0-10 min : 5 % ; 10-12.5 min : 5 à 25 % ; 12,5-52,5 min : 25 à 35 % ; 52,5-57,5 min 35 à 95 % ; reportez-vous aux instructions du fabricant pour l’utilisation de l’instrument). Comparer les résultats avec les résultats représentatifs dans la Figure 2C.
Remarque : Httex1 et son6-SUMO distinct bien par RP-HPLC. Toutefois, il peut être de petites quantités de Httex1 tronqué dans le début et la fin du pic. Recueillir les petites fractions pour obtenir le maximum de matériel pur.
ATTENTION : Utiliser l’équipement de sécurité approprié (c.-à-d., blouse, des gants et un masque facial) quelle manipulation fluides cryogéniques. - Analyser les HPLC-fractions par spectrométrie de masse à ionisation electro-spray (ESI-MS, échantillonneur automatique, injecter 10 µL, débit 0,6 mL/min, solvant : 20 % B a, aucune colonne, reportez-vous aux instructions du fabricant pour l’utilisation de l’instrument) et UPLC (pente de 10 % à 90 % solvant B à A de 0,25 à 3 min, 10 % B pendant 1 min, reportez-vous aux instructions du fabricant pour l’utilisation de l’instrument). Piscine des fractions du même degré de pureté dans les tubes en plastique de 50 mL, congélation dans l’azote liquide et lyophiliser. Peser et transférer la protéine lyophilisée dans des tubes en plastique de 2 mL et conserver à-20 ° C.
- Caractériser le matériel purifié par SDS-PAGE, ESI-MS et UPLC. Dissoudre 100 µg Httex1 lyophilisé dans 8 µL d’AGT soignée dans un tube de 1,5 mL et incuber pendant 20 min à température ambiante dans l’éprouvette fermée. Soigneusement évaporer le TFA sous une hotte avec un courant d’azote ou argon. Basse pression d’azote/argon permet d’éviter la perte de l’échantillon.
- Dissoudre la protéine dans 100 µL d’H2O. analyser 2 µL par UPLC et 5 µL par ESI-MS comme au point 3.8. Mélanger 20 µL de solution protéique avec 20 µL de 2 x teinture de chargement.
- Analyser des quantités de 1 µg à 10 µg par SDS-PAGE. Exécutez le gel pendant 90 min à 180 V. tache le gel avec du bleu de Coomassie teindre selon les instructions du fabricant. Comparer les résultats avec les résultats représentatifs àDde la Figure 2.
4. ventilation et Resolubilization des protéines Httex1
ATTENTION : TFA est un liquide volatil et peuvent occasionner des brulures graves donc manipuler avec soin. Procéder à toute manipulation sous une hotte et porter les équipements de protection individuelle adéquat (c'est-à-dire les gants nitrile jetables, des lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire).
- Préparer 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD) (137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) de la poudre prémélangée dans un tube de 50 mL. Filtrer la solution SPD sur un filtre de 0,2 µm avant chaque utilisation.
- Dissoudre 150 µg d’Httex1 lyophilisé dans 12 µL d’AGT soignée dans un tube de 1,5 mL et incuber pendant 20 min à température ambiante dans l’éprouvette fermée. Soigneusement évaporer le TFA sous une hotte avec un courant d’azote ou argon. Basse pression d’azote/argon permet d’éviter la perte de l' échantillon38.
Remarque : en général, utilisez 4 µL TFA se dissolvent et ventiler 50 µg de protéines. Cette procédure permet de créer une couche de protéines à l’intérieur des parois du tube à essai. Pour empêcher l’agrégation immédiate des Httex1 dans les étapes suivantes, travailler avec tampons refroidis, conserver la protéine toujours sur la glace et éviter des concentrations élevées. - Dissoudre les protéines désagrégées dans 1 mL de refroidissement préalable SPD et ajuster le pH à 7,2-7,4 avec 1 NaOH M. Filtrer la solution de protéines à travers un filtre centrifuge 100 kDa dans des tubes en plastique de 1,5 mL (20000 x g, 4 ° C, 20 minutes).
Remarque : La concentration théorique calculée de Httex1 est supérieure à la concentration finale souhaitée pour tenir compte de la perte possible. L’étape de filtration est nécessaire pour supprimer n’importe quel agrégat qui peut-être avoir formé au cours de la dissolution de la protéine. - Déterminer la concentration de Httex1 à l’aide d’une courbe d’étalonnage UPLC basée sur l’analyse des acides aminés (détection à λ214) et envoyer 2 µg de la protéine à l’analyse des acides aminés pour valider la concentration10. Calculer le montant de SPD qui doit être ajouté pour obtenir une concentration de 3 µM Httex1.
- Diluer la protéine à 3 µM en ajoutant le montant calculé du SPD dans l’éprouvette. Maintenir le tube sur la glace jusqu'à l’ouverture du protocole de l’agrégation.
Remarque : Httex1 43Q ne doivent pas être rangés dans la solution. Préparez toujours une solution de protéine douce basée sur le protocole ci-dessus. Httex1 protéines sont mieux stockées sous forme de poudre lyophilisée à-20 ° C.
5. suivi de la cinétique agrégation de Httex1 43Q UPLC et de spectroscopie de dichroïsme (CD) circulaire et de caractérisation des agrégats de la microscopie électronique à Transmission (TEM)
- Préparer la solution de formiate d’uranyle pour TEM comme indiqué précédemment39.
- Initier l’agrégation de Httex1 43Q en incubant une solution de 3 µM au SPD à 37 ° C (utilisation 1 mL de la solution préparée comme décrit ci-dessus dans le protocole de désagrégation).
Remarque : L’agrégation de Httex1 peut être effectuée à des concentrations plus élevées selon les besoins et les objectifs de l’expérience. - Quantifier la quantité de protéine soluble à l’aide de UPLC aux moments indiqués (à 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 et 120 h). Pour ce faire, prélever une partie aliquote de 35 µL et supprimer les agrégats insolubles par centrifugation (20000 x g, 4 ° C, 20 min). Injecter 4 µL du liquide surnageant dans l’UPLC. Calculer la proportion de monomère soluble basé sur la variation de la surface du pic à l’aide de l’instrument logiciel 40. Comparer les résultats avec les résultats représentatifs dans la Figure 3A.
- Caractériser les changements dans la structure secondaire en utilisant la spectroscopie de CD à 0 et 48 h. Prélever une partie aliquote de 100 µL et mesurer l’ellipticité (cuvette de quartz de 1 mm, 195 nm à 250 nm, 20 ° C, les données des points chaque 0,2 nm, vitesse 10 nm/min, l’intégration numérique temps 2 s, largeur de bande de 1,0 nm). Acquérir des spectres de l’échantillon et la moyenne 6 et lisse en utilisant un filtre binomial avec largeur de convolution de 99. Tracer le spectre comme la moyenne des résidus ellipticité molaire (θMRE)41. Comparer les résultats avec les résultats représentatifs dans la Figure 3B.
- Caractériser les propriétés structurales et morphologiques des agrégats de TEM. Mettez 3 µL de la solution de protéines sur une Formvar/carbone-enduit 200 mailles déchargé glow cuivre grille pendant 1 min. laver la grille deux fois avec de l’eau μL 15, une fois avec 15 μl de formiate d’uranyle de 0,7 % (p/v) et la tache pendant 30 s avec 15 μl de formiate d’uranyle de 0,7 % w/v. Effectuer une analyse TEM des grilles. Comparer les résultats avec les résultats représentatifs dans la Figure 3C.
Representative Results
Httex1 est exprimée chez e. coli avec un N-terminal son6-balise SUMO. Les résultats représentatifs de l’expression et purification de la protéine de fusion sont résumés dans la Figure 1. La séquence de Httex1 se compose des résidus 2-90 de Htt et commence par Ala2, car Met1 est totalement clivé en vivo42. La numérotation des acides aminés correspond à la variante de 23Q, la séquence complète de la protéine de fusion exprimée est montrée dans la Figure 1A. Les plasmides seront déposés à Addgene dans un proche avenir à partager avec la communauté. Une représentation schématique du plasmide et la protéine de fusion exprimée est illustré à la Figure 1B. His6-SUMO Httex1 exprime à un niveau moyen (Figure 1C) et la plus grande partie de la protéine de fusion est présent dans la fraction soluble après lyse, tant pour la 23Q et la variante 43Q. La protéine de fusion migre plus élevés que prévu, selon le poids moléculaire. C’est en partie à cause du pli fort du SUMO mais surtout en raison de la composition de la séquence inhabituelle de Httex1, contenant principalement des résidus de glutamine et de la proline. Le type sauvage (23Q) tant le mutant (43Q) protéine de fusion peut être enrichie à environ 80 % de pureté par IMAC (Figure 1D), la présence de purification des protéines de l’hôte peut s’expliquer par le niveau d’expression relativement faible de Httex1 et le grand échantillon volume appliqué à la colonne.
Le clivage de la sa6-balise SUMO et la purification de Httex1 est illustré dans la Figure 2A. UPLC est un outil efficace pour surveiller le clivage de la sa6-balise SUMO (Figure 2B). Le pic initial de la protéine de fusion est consommé et deux pics de nouveau et bien séparées correspondant le son6-balise SUMO et Httex1 apparaissent. La réaction de clivage est terminée en 10-20 min. Le Western Blot (WB) est trop lent pour surveiller la réaction de clivage efficacement, mais il a été inclus dans la figure pour référence et pour démontrer la conformité du clivage SUMO. Les deux Httex1 23Q et 43Q peuvent être séparés de son6-SUMO tag par RP-HPLC (Figure 2C) et ont été obtenues en grande pureté comme indiqué par l’analyse de l’UPLC, MS et SDS-PAGE (Figure 2D).
Pour illustrer que les protéines de Httex1 préparés par cette méthode conservent les propriétés attendues de l’agrégation de Httex1, nous avons évalué la cinétique de la fibrillization du mutant Httex1 à 37 ° C par un dosage de la sédimentation, surveiller les changements dans la structure secondaire de CD spectroscopie et caractérise la morphologie des agrégats de TEM. Un ensemble de données représentatif de la cinétique de l’agrégation de la formation de fibrilles mHttex1 tel que déterminé par un test de sédimentation est montré dans laFigure 3A. La perte de Httex1 soluble 43Q au fil du temps, en raison de la formation de fibrilles a été quantifié par UPLC. Nous observons un épuisement complet des protéines solubles après 48 heures d’incubation. En outre, nous avons déterminé la structure secondaire de la protéine par spectroscopie CD (Figure 3B). Httex1 43Q quarts de non structurées (λmin 205 nm) à feuillet β principalement riche conformation (λmin 215 nm) après 48 heures d’incubation. Ce changement structurel est accompagné par la formation d’agrégats longtemps fibrillaires comme observables par TEM à 48 heures (Figure 3C).
Figure 1 . Expression et purification de son6-protéine de fusion de SUMO Httex1.
(A), la séquence d’acides aminés His6-SUMO-Httex1-QN fusion constructions (son6-SUMO en vert et Httex1-QN en orange) ; (B) un aperçu schématique de l’expression et purification de la protéine de fusion ; (C) analyse SDS-PAGE de l’expression et la solubilité de la protéine de fusion après la lyse ; Chromatogramme (D) de la purification de l’IMAC de la protéine de fusion et l’analyse des fractions par SDS-PAGE (barre rouge : barre de fraction libre, bleu : lavage fraction, noir bar : fractions contenant les pics d’élution) ; S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Clivage de la sa balise SUMO6 et purification des protéines de Httex1-QN tag-free.
Présentation schématique de la (A) ; (B) analyse du clivage de la balise SUMO avec ULP1 par UPLC (bleu : avant l’ajout des ULP1 ; noir : 20 min (23Q), respectivement de 10 min (43Q) après l’addition de ULP1) et la Banque mondiale (MAB5492 1 : 2000, chèvre secondaire anti souris anticorps 1 : 5000) ; (C) chromatogramme de la purification de RP-HPLC préparative des Httex1 ; D : analyse de la Httex1 purifié par UPLC, SDS-PAGE et ESI-MS ; le poids moléculaire prévu est respectivement de 9943 Da (23Q) et 12506 Da (43Q). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Agrégation de Httex1-43Q : test de sédimentation (A) basé sur UPLC. (B) des spectres de DC de la structure secondaire à 0 h et des micrographies TEM de 48 h. (C) des agrégats après 48 h (barreaux de l’échelle est 200 nm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Dans ce protocole, nous avons défini une méthode efficace pour obtenir quantités de milligramme de natif, non identifié Httex1 contenant des résidus de glutamine 23 ou 43. Ceci a été réalisé en exprimant Httex1 comme une fusion de C-terminal de son6-balise SUMO, qui sert à isoler la protéine de fusion depuis le lysat cellulaire par IMAC et est clivé avant purification HPLC de Httex1. Alors que la stratégie SUMO a été utilisée dans la production de plusieurs autres protéines, notre méthode montre que les propriétés uniques que Sumo pourrait également être utilisé pour générer intrinsèquement désordonnés, sujettes à l’agrégation, protéine amyloïdogène qui se sont déjà révélés extrêmement difficile à gérer et produire43,44. Nous présentons un protocole qui est simple, facile à utiliser et comparable à un protocole pour la production d’une protéine « sage ». La fusion de SUMO solubilise et stabilise la Httex1 pendant l’expression et la purification d’IMAC. Clivage prématuré de la balise, comme observé avec la stratégie d’intein10 et agrégation n’étaient plus un problème.
Protéines intrinsèquement désordonnées sont particulièrement vulnérables à la dégradation. Alors que la dégradation de le N-terminale de la région de la N17 n’est pas un problème à l’aide de ce protocole, troncatures dans le PRD de Httex1 peuvent se produire. Comme les protéines tronquées sont très semblables à Httex1 hydrophobie, responsable et taille, il est difficile de les enlever par des moyens chromatographiques, donc il est préférable de prévenir leur formation en premier lieu. S’en tenir étroitement au protocole, toujours sur la glace en utilisant une quantité suffisante d’inhibiteur de protéase devraient aider maintenir le niveau de troncature observée très faible. Appliquer une balise de fusion à l’extrémité C-terminale de Httex1 a pu supprimer troncations dans le PRD facilement comme la protéine tronquée perdrait la balise affinité ainsi. Toutefois, si la séquence native doit être maintenue à que cette option ne peut être appliquée comme Httex1 se termine par la proline et au mieux de notre connaissance, il n’y a aucune balise de fusion C-terminale qui est connus pour induire un clivage chimiothèques et efficace après proline.
La partie la plus critique du protocole est le traitement de la Httex1 libéré après clivage de la balise SUMO par ULP1. La protéine doit être purifiée immédiatement par RP-HPLC. Heureusement, c’est une réaction efficace et rapide qui est habituellement réalisée dans 10-20 min à 4 ° C. En revanche, la stratégie d’intein exige plusieurs heures pour le clivage complet de l’intein, ce qui nécessite un compromis entre un clivage incomplet et agrégation de début afin de maximiser le rendement. Un bilan rapide est obligatoire pour mutant Httex1, car il va commencer à agréger à la concentration relativement élevée dans la réaction de clivage, tandis que la variante 23Q est stable pendant une longue période. Au cours de la purification de RP-HPLC, apparaît un autre avantage du SUMO : alors que le Ssp DnaB intein est hydrophobe et s’en tient fermement à la colonne, SUMO est plus hydrophile et élué complètement de la colonne de phase inversée de C4. Bien que commercial ULP1 est très coûteux, la protéine peut être facilement produite des rendements élevés suivant les protocoles publiés antérieurement29.
L’importance cruciale de l’application d’un protocole de ventilation avant d’utiliser le Httex1 ne peut pas être assez souligné. PolyQ lyophilisée protéines telles que les Httex1 sont stables et peuvent être stockées longtemps, mais ne sont pas complètement solubles dans l’eau et les tampons. La présence d’oligomères préformés ou fibrilles pourrait avoir un impact significatif sur la cinétique de l’agrégation et les propriétés biophysiques de la protéine45. Le protocole de désagrégation décrit ici permet la ventilation de la protéine, l’élimination des agrégats préformés et génération d’une solution de monomère Httex1 auprès d’un échantillon lyophilisé. Nous avons observé l’agrégation cinétique et fibrilles une morphologie semblable pour Httex1 obtenus avec le SUMO et la stratégie d’intein.
Par rapport aux méthodes précédentes de production Httex1, la stratégie SUMO décrite ici offre plusieurs avantages et élargit l’éventail des études possibles pour étudier la structure et les propriétés fonctionnelles de cette protéine dans la santé et la maladie. La protéine de fusion de SUMO-Httex1 est facile à manipuler, il peut être congelé et stocké ou maintenu dans la solution pendant 24 h à température ambiante, tandis que le mHttex1 libre serait regrouper rapidement. La stabilité et la grande solubilité des protéines SUMO-Httex1 fusion fournissent une plus grande flexibilité pour manipuler la protéine et/ou introduisent des modifications dans mHttex1 qui serait autrement impossible après clivage enzymatiques et chimiques. Cela inclut l’introduction de modifications post-traductionnelles, fluorophores, marqueurs de spin, balises de biotine, etc. les avances présentées ici devraient 1) faciliter les futures études afin d’élucider les relations structure-fonction des Httex1 ; 2) génèrent de nouveaux outils pour étudier l’agrégation Htt et la diffusion de la pathologie ; 3) permettent le développement de nouveaux tests pour identifier les molécules qui stabilisent mutant Httex1 et empêchent son agrégation ; et 4) encourager les scientifiques dans d’autres domaines pour apporter à travailler sur cette protéine et rejoignez notre quête pour trouver des remèdes pour la maladie de Huntington.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt avec le contenu de cet article.
Acknowledgments
Ce travail a été financé principalement par des subventions de la Fondation CHDI et la Swiss National Science Foundation. Nous remercions Dr Sophie Vieweg discussions utiles lors de l’élaboration de ce nouveau système d’expression et d’autres membres du groupe Lashuel pour partager leur expérience avec ce système d’expression et leur entrée et précieux commentaires. Nous remercions également Prof. Oliver Hantschel fournissant le plasmide ULP1. Les auteurs tiennent à remercier Dr. John B. Warner et Dr Senthil K. Thangaraj examen critique du manuscrit
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uranyl formate (UO2(CHO2)2) | EMS | 22450 | |
| Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids | EMS | FCF200-Cu-50 | |
| High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics | HellmaAnalytics | 110-1-40 | |
| Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA | Witech | SVA4730203 | |
| Ampicillin | AxonLab | A0839.0100 | |
| Luria Broth (Miller's LB Broth) | Chemie Brunschwig | 1551.05 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | AxonLab | A1008.0025 | |
| E. coli B ER2566 | NEB | NEB# E4130 | |
| Imidazole | Sigma | 56750-500G | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82 | Merck Millipore Corporation | MAB5492 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L) | Licor | 925-68070 | |
| PMSF | AxonLab | A0999.0005 | |
| HisPrep 16/10 column | GE Healthcare | 28936551 | |
| C4 HPLC column | Phenomenex | 00G-4168.P0 | 10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed |
| Acetonitrile HPLC | MachereyNagel | C2502 | |
| Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile | Sarstedt AG | 83.1826 | |
| Spectrophotometer semi-micro cuvette | Reactolab S.A. | 2534 | |
| Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 ml | GE Healthcare | 18111382 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml | Greiner Bio-One | 7.160 102 | |
| 100 kD Microcon fast flow filters | Merck Millipore Corporation | MRCF0R100 | |
| Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor | Sonics | ||
| Äkta 900 equipped with a fraction collector | GE Healthcare | ||
| Jasco J-815 Circular Dichroism | Jasco | ||
| Waters UPLC system | Waters | C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL | |
| waters HPLC system | Waters | 2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing | |
| ESI-MS: Finnigan LTQ | Thermo Fisher Scientific | ||
| lyophylizer instrument | FreeZone 2.5 Plus | ||
| Tecnai Spirit BioTWIN | FEI | electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV | |
| 37 °C shaking incubator | Infors HT multitron Standard | ||
| Biophotometer plus | Eppendorf |
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