प्रोटोकॉल ई कोलाई-गैर विहित एमिनो एसिड के lactococcal रोगाणुरोधी पेप्टाइड निस्ां में (ncaas) के चयनात्मक दबाव शामिल आधारित प्रस्तुत करता है । इसके गुणों को परिभाषित विकास मीडिया में वांछित ncaas के साथ प्रतिस्थापन के माध्यम से रिकॉमबिनेंट अभिव्यक्ति के दौरान बदला जा सकता है । विकास निषेध परख और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रतिचित्रित कर रहे है में परिवर्तन के परिणामस्वरूप ।
प्रकृति की संभावनाओं की एक किस्म है व्यक्तिगत एमिनो एसिड इमारत ब्लॉकों के अनुक्रम को संशोधित करके नए प्रोटीन कार्य बनाने के लिए । हालांकि, सभी रूपों 20 विहित अमीनो एसिड (cAAs) पर आधारित हैं । एक तरह से polypeptides में अतिरिक्त भौतिक गुण परिचय के रूप में, गैर-विहित अमीनो एसिड का शामिल (ncaas) तेजी से प्रोटीन इंजीनियरिंग में प्रयोग किया जाता है । उनके अपेक्षाकृत कम लंबाई के कारण, ribosomally के संशोधन संश्लेषित और पोस्ट-अनुवाद द्वारा संशोधित पेप्टाइड्स ncaas द्वारा विशेष रूप से आकर्षक है । नई कार्यक्षमताओं और रासायनिक संभालती व्यक्तिगत अवशेषों के विशिष्ट संशोधनों के द्वारा उत्पंन किया जा सकता है । चयनात्मक दबाव निगमन (SPI) विधि auxotrophic मेजबान उपभेदों है कि रासायनिक परिभाषित विकास मीडिया में एक आवश्यक अमीनो एसिड से वंचित कर रहे है का उपयोग करता है । कई संरचनात्मक और रासायनिक समान एमिनो एसिड सादृश्य तो इसी aminoacyl-tRNA synthetase द्वारा सक्रिय किया जा सकता है और अवशेषों-विशिष्ट cAA (ओं) → ncAA (एस) लक्ष्य पेप्टाइड या प्रोटीन अनुक्रम में प्रतिस्थापन प्रदान करते हैं । हालांकि, SPI विधि के संदर्भ में, ncaas भी रिकॉमबिनेंट जीन अभिव्यक्ति के चरण के दौरान मेजबान proteome में शामिल किए गए हैं, सेल के संसाधनों का बहुमत लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के लिए आवंटित कर रहे हैं । यह सक्षम बनाता है कुशल अवशेषों के ncaas के विशिष्ट शामिल करने अक्सर संशोधित लक्ष्य की उच्च मात्रा के साथ साथ । प्रस्तुत कार्य में रोगाणुरोधी पेप्टाइड निस्ां, एक स्वाभाविक रूप से Lactococcus लैकि्टसद्वारा उत्पादित lantibiotic में छह लाइन सादृश्य के vivo में शामिल है । निस्ां के रोगाणुरोधी गुणों को बदला जा सकता है और आगे परिभाषित विकास मीडिया में auxotrophic ई कोलाई उपभेदों में अपनी किण्वन और अभिव्यक्ति के दौरान विस्तार किया । इस प्रकार, अवशेषों के प्रभाव-ncaas के साथ cAAs के विशिष्ट प्रतिस्थापन रोगाणुरोधी गतिविधि और विशिष्टता में परिवर्तन प्रदान कर सकते हैं । रोगाणुरोधी गतिविधि परख और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक ग्राम पॉजिटिव Lactococcus लैकि्टस संकेतक तनाव के विकास के अवरोध के लिए नए निस्ां वेरिएंट का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जाता है । मास स्पेक्ट्रोस्कोपी को सक्रिय निस्ां वेरिएंट में ncAA शामिल करने की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
बीसवीं सदी में एंटीबायोटिक दवाओं की खोज और रोगजनक सूक्ष्मजीवों के खिलाफ नई रोगाणुरोधी यौगिकों के समानांतर विकास बैक्टीरियल संक्रमण के लक्षित उपचार सक्षम होना चाहिए । हालांकि, बहुऔषध के उद्भव के कारण प्रतिरोधी रोगजनकों जैसे methicillin प्रतिरोधी Staphylococcusaureus (MRSA), vancomycin प्रतिरोधी enterococci (VRE), एमडीआर (बहुऔषध-प्रतिरोधी) साल्मोनेला typhimurium फेज प्रकार 10 (DT10 ), और Klebsiella निमोनिया, यह तत्काल नए रोगाणुरोधी एजेंटों1उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है । रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (AMPs) बहुमुखी, अक्सर अत्यधिक विशिष्ट यौगिकों कि उनके भौतिक गुण, लचीलापन, आकार, hydrophobicity, और कार्रवाई के मोड2के लिए नई दवाओं धन्यवाद के विकास के लिए उंमीदवारों का वादा कर रहे हैं । AMPs आम तौर पर 7-100 अमीनो एसिड से मिलकर छोटे पेप्टाइड्स हैं. अक्सर, वे एक cationic सकारात्मक आरोप लगाया arginine और lysine अवशेषों में अमीर संरचना है, जो लक्षित माइक्रोबियल कोशिका झिल्ली है, जो विपरीत है के साथ बातचीत3। AMPs के एक विशेष उपसमूह ribosomally संश्लेषित और posttranslationally संशोधित पेप्टाइड्स (फट)4रहे हैं । इन कवक के राज्य और बैक्टीरिया के डोमेन से कई जीवों द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । सबसे अच्छा ज्ञात है और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया फट में से एक निस्ां है, स्वाभाविक रूप से लैक्टिक एसिड जीवाणु Lactococcus लैकि्टस (एल. लैकि्टस) द्वारा उत्पादित । ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के एक पैनल के खिलाफ सक्रिय, निस्ां से अधिक ५० अपनी रोगाणुरोधी संपत्तियों के कारण और लक्षित माइक्रोबियल उपभेदों में विकसित प्रतिरोध के अभाव के लिए खाद्य उद्योग में एक परिरक्षक के रूप में इस्तेमाल किया गया है5। अध्ययनों से पता चला है कि निस्ां स्थिर और उत्पन्न करता है, जीवाणु कोशिका झिल्ली में pores, दोनों ग्राम पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक रोगजनकों6के खिलाफ गतिविधि रोगाणुरोधी करने के लिए अग्रणी । लिपिड द्वितीय के लिए बाध्यकारी द्वारा, बैक्टीरियल कोशिका दीवार संश्लेषण7हिचकती है. निस्ां एक रैखिक प्रणेता पेप्टाइड, जो एक नेता और एक कोर पेप्टाइड क्षेत्र (चित्रा 1) से बना है के रूप में निसा द्वारा इनकोडिंग है । राइबोसोमल संश्लेषण के बाद prenisin को सर्वप्रथम dehydratase NisB द्वारा संशोधित किया जाता है । यहां, serine और threonine के अवशेषों को पेप्टाइड कोर क्षेत्र में dehydroalanine (Dha) और dehydrobutyrine (Dhb)8के लिए निर्जलित रहे हैं । बाद में, निर्जलित अवशेषों cysteine के साथ युग्मित कर रहे है lanthionine के छल्ले फार्म (इसलिए नाम “lantibiotic” lanthionine अंगूठी युक्त एंटीबायोटिक दवाओं के लिए) एक एंजाइम-catalyzed माइकल इसके अलावा द्वारा । यह posttranslational संशोधन (PTM) cyclase NisC द्वारा catalyzed है । एल लैकि्टसमें, संशोधित prenisin फिर ट्रांसपोर्टर NisT द्वारा सेल से बाहर पहुंचाया जाता है, और नेता पेप्टाइड proteinase NisP द्वारा परिपक्व और सक्रिय निस्ां फार्म9जारी करने के लिए सट जाता है । जिंमेदार नेता peptidase NisP एक उच्च सब्सट्रेट विशिष्टता है, क्योंकि यह केवल संशोधित निस्ां कुशलता10प्रक्रियाओं ।
सामांय में, PTM एंजाइमों की कार्रवाई से सक्रिय फट परिणाम (उदाहरण के लिए NisBC), जो काफी कम पेप्टाइड्स के रासायनिक अंतरिक्ष में वृद्धि, जैसे, के माध्यम से acetylation, glycosylation, मिथाइल या फास्फारिलीकरण. जटिलता का यह स्तर आगे ncaas के प्रत्यक्ष निगमन द्वारा विस्तारित किया जा सकता है । जबकि अक्सर संभव है, AMPs के रासायनिक संश्लेषण उनके संरचनात्मक जटिलता के कारण बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक चुनौती है । उदाहरण के लिए, ७१ प्रतिक्रिया चरणों में lantibiotic lactosin एस के कुल रासायनिक संश्लेषण 10% की एक अंतिम उपज के साथ प्राप्त किया गया था और केवल ०.००३%11,12की एक कच्चे तेल की उपज के साथ कि निस्ां की । इसलिए, जैविक उत्पादन एक व्यवहार्य विकल्प प्रदान करता है, सही stereocenters और उच्च उत्पाद एकाग्रता की पीढ़ी के कारण ।
आज तक, १५० से अधिक ncaas, जैसे, कार्यात्मक फ्लोरीन या azides युक्त समूहों, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन में शामिल किया गया है, और ncAA के कई उदाहरण संशोधित AMPs13,14सूचित किया गया है, 15,16. ncaas के परिचय के साथ, उपंयास भौतिक गुण पारंपरिक mutagenesis की तुलना में उत्पंन किया जा सकता है । मौजूदा पेप्टाइड्स की विविधता बढ़ सकता है, संभवतः उपंयास एंटीबायोटिक दवाओं के लिए अग्रणी ।
रिकॉमबिनेंट पेप्टाइड्स में ncaas के शामिल करने के लिए एक विधि चयनात्मक दबाव शामिल है (SPI) auxotrophic जीवाणु उपभेदों के उपयोग के आधार पर17. इन उपभेदों ncAA के इसी cAA अनुरूप synthesizing के लिए सक्षम नहीं हैं । पद्धति अक्सर मनाया आराम सब्सट्रेट विशिष्टता, कई प्राकृतिक aminoacyl की एक विशेषता का उपयोग करता है-tRNA synthetases (aaRSs)18। उनके प्राकृतिक cAA सब्सट्रेट के अलावा, इन एंजाइमों अक्सर पहचान करने के लिए सक्षम हैं और वांछित ncAA को सक्रिय करने और अपने cognate tRNA (ओं) पर इसे चार्ज करने के लिए. यह एक अवशेष में लक्ष्य जीन उत्पाद में ncAA के राइबोसोमल को शामिल करने की ओर जाता है-विशिष्ट तरीके से (यानी, cAA → ncaa प्रतिस्थापन) । यह निश्चित रूप से ही संभव है जब वांछित ncAA संरचनात्मक और रासायनिक विहित अमीनो एसिड के समान है और कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान द्वारा सहन, अनुवाद मशीनरी और लक्ष्य पेप्टाइड या प्रोटीन अनुक्रम । एक विशेष प्रायोगिक सेटअप में, auxotrophic मेजबान कोशिकाओं को परिभाषित मूल एमिनो एसिड की एक सीमित एकाग्रता के साथ आपूर्ति के लिए प्रतिस्थापित किया जा माध्यम में संस्कृति रहे हैं । सेलुलर विकास या cAA द्वारा विनिमय-मुक्त माध्यम cAA की intracellular घट की ओर जाता है । अगले कदम में, ncAA जोड़ा और लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति प्रेरित है । अनिवार्य रूप से, ncaas अब भी मेजबान सेल में कई अंय प्रोटीन में लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति के इस चरण के दौरान शामिल हैं । बहरहाल, SPI सेटअप के विषाक्तता के बाद से एक निंन स्तर पर रखा है ई कोलाई (ई. कोलाई) तनाव एक प्लाज्मिड के साथ एक मजबूत प्रमोटर के नियंत्रण में लक्ष्य जीन ले जाने के साथ बदल गया है (सामान्यतः अत्यधिक प्रतिस्पर्धी T7 प्रवर्तक/ आरएनए पोलीमरेज़ सिस्टम)19. प्रेरण के तुरंत बाद (आमतौर पर जब cAA समाप्त हो जाता है), मेजबान कोशिकाओं के विकास के लिए संघर्ष और उनके cytoplasmic एंजाइमी मशीनरी मुख्य रूप से प्लाज्मिड की अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता है-लक्ष्य जीन आधारित है । साइट निर्देशित mutagenesis को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है साइट (ओं) के अवशेषों का लक्ष्य जीन में विशिष्ट ncAA अधिष्ठापन20।
ncaas के शामिल करने के लिए एक मॉडल पेप्टाइड के रूप में, pentacyclic AMP निस्ां एक चुना गया था. यह ३४ अमीनो एसिड लंबे समय है और केवल कोर पेप्टाइड अनुक्रम में एक एकल लाइन अवशेष है (चित्र 1) । subtilisin में के रूप में, ericin ए और एस, और epidermin के रूप में अच्छी तरह के रूप में निस्ां जेड और निस्ां क्ष में, संरक्षण की रेखा के लिए गतिविधि के लिए आवश्यक लगता है9,21। cAA peptidyl-prolyl रोटेशन और माध्यमिक संरचना स्थिरीकरण के बीच में एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इसकी ओर श्रृंखला की अंगूठी अनुरूपता (exo/इंडो पक) के बीच बांड के एक ऊष्मा स्थिरीकरण के लिए जिंमेदार हैं । लक्षित रासायनिक संशोधनों (जैसे hydroxylations, fluorinations, मिथाइल) prolyl पक के रूप में अक्सर गंभीर तह स्थिरता, पाड़ कठोरता और कई जैविक संरचनाओं के कार्य22को प्रभावित करते हैं । इस प्रकार, यह उंमीद है कि समर्थक → रूपरेखा अनुरूप प्रतिस्थापन राज्यसत्ता अंगूठी बी, निस्ां की दूसरी अंगूठी, उपंयास और असामांय गुणों के साथ होगा प्रशंसनीय है ।
यहां, एक लाइन auxotrophic ई. कोलाई तनाव रिकॉमबिनेंट निस्ां उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया था । इस पेप्टाइड जीन निसा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संशोधन एंजाइम जीन nisBCकी अभिव्यक्ति की आवश्यकता है । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पेप्टाइड उत्पाद एक N-टर्मिनली अपने-टैग अपनत्व क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से शुद्धि के लिए नेता किया जाता है । गतिविधि निर्धारण के लिए, एल लैकि्टस व्यक्त और स्रावी NisPT ई. कोलाई सेल lysates या शुद्ध पेप्टाइड नमूनों (चित्रा 1) से रिकॉमबिनेंट निस्ां वेरिएंट को सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है । परिपक्व AMP NisP द्वारा नेता के क्लीवेज के बाद जारी की है. इस आगर प्रसार विधि में, AMP नमूना ठोस विकास माध्यम में फैलाना और ग्राम पॉजिटिव सूक्ष्मजीवों के विकास को बाधित कर सकते हैं । गर्मी के बाद, यह विकास अवरोध प्रभामंडल द्वारा नेत्रहीन मनाया जा सकता है । एक संकेतक के रूप में एल लैकि्टस के अलावा, संशोधित निस्ां वेरिएंट Enterococcus faecalis, बैसिलस cereus, Staphylococcus aureus, और लैक्टोबैसिलस johnsonii के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधि दिखाया 21,23.
एक वैकल्पिक और प्रयोगात्मक अलग विधि फट में ncaas शामिल करने के लिए रोक codon दमन (SCS)24है । इस के लिए, एक ओर्थोगोनल tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) जोड़ी इसी ncAA के लिए आवश्यक है । आदर्श रूप में, इन सभी तीन घटकों bioorthogonal हैं, यानी, वे अंतर्जात tRNAs और aaRSs के साथ बातचीत नहीं करते । एक ncAA-विशिष्ट aaRS एंजाइम सक्रिय साइट और उत्परिवर्ती synthetases25के आनुवंशिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के संशोधन के द्वारा उत्पंन किया जा सकता है । इसके अलावा, एक ncAA का परिचय एक codon जो और पुनः असाइन किया गया है जो cAA के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना नहीं है की आवश्यकता है । आमतौर पर, एंबर stop codon24,26का प्रयोग किया जाता है ।
हाल ही में, SPI α के शामिल करने के लिए स्थापित किया गया था-chloroacetamide युक्त और क्लिक करें-रसायन विज्ञान-निसा27में संगत ncaa. उदाहरण के लिए, Nε-alloc-lysine साइट के साथ कमंद पेप्टाइड captistruin में शामिल किया गया था-विशिष्ट (SCS) और अवशेषों-विशिष्ट (SPI) निगमन तरीकों और बाद में ruthenium द्वारा इन विट्रो में संशोधित-catalyzed विपयर्य28 . SPI की तुलना में, SCS विधि और अधिक जटिल है के बाद से एक ओर्थोगोनल tRNA/aaRS जोड़ी को सह व्यक्त किया है । तारीख करने के लिए, ओ-लाइन शामिल करने के लिए जोड़े को विकसित किया गया है29, लेकिन हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, रेखा अनुरूप शामिल करने का कोई उदाहरण नहीं बताया गया है ।
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि नहीं सभी ncaas SPI पद्धति का उपयोग कर शामिल किया जा सकता है । सबसे पहले, कोशिका द्रव्य में ncaas के अधिक परिवहन प्रोटीन है कि cytoplasmic झिल्ली, जो ग्राम के लिए भीतरी झिल्ली है में एंबेडेड है की एक भीड़ द्वारा विनियमित है- ई.कोलाई जैसे नकारात्मक जीवाणुओं । आम तौर पर, ई. कोलाई पक्ष जंजीरों के साथ सेल में एमिनो एसिड सादृश्य की एक विस्तृत श्रृंखला के परिवहन के लिए सक्षम है संरचनात्मक और रासायनिक विहित अमीनो एसिड के समान । दूसरा, कई रासायनिक प्रतिक्रियाशील या अस्थिर ncaas सेलुलर विकास की दिशा में एक अवरोधक के रूप में कार्य हो सकता है, के रूप में वे मेजबान सेल के चयापचय और फिजियोलॉजी30के लिए विषाक्त कर रहे हैं । इस प्रकार, और ncAA के उत्पादन मेजबान के लिए विषाक्तता पहले से परीक्षण किया जाना चाहिए । एक पक्ष प्रभाव के रूप में PTM मशीनरी की निष्क्रियता से बचने के लिए, जिंमेदार जीन के एक कड़ाई से नियंत्रित अभिव्यक्ति सेटअप को संशोधन एंजाइमों में प्राकृतिक एमिनो एसिड शामिल किया जा सकता है (जैसे, nisBC) और ncAA लक्ष्य जीन में ( उदा., निसा). यह दो अलग प्रमोटरों का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है और लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति की प्रेरण, के रूप में विशेष रूप से डिजाइन SPI प्रोटोकॉल31में प्रदर्शन किया । के रूप में ऊपर उल्लिखित, SPI विधि aaRS के आराम सब्सट्रेट विशिष्टता पर निर्भर करता है, जो ncAA सक्रियण और cognate tRNA चार्ज करने के लिए अनुमति देता है । बाद में, tRNA बांड गठन और लक्ष्य (पाली) पेप्टाइड की तह के बीच से पीछा ribosome के लिए दिया जाता है । इस प्रक्रिया में, ठीक करना और संपादन तंत्र३२प्रासंगिक हो सकता है । इन कारणों के लिए, यह बहुत महत्व का है कि संरचनात्मक और रासायनिक cAA के समान है एक लक्ष्य ncAA है । अंय महत्वपूर्ण अंक पर्याप्त स्थिरता रहे है (दोनों विकास मीडिया में और सेलुलर चयापचय से अवगत कराया) और ncAA के घुलनशीलता । इसके अतिरिक्त, यह या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध होना चाहिए या रासायनिक संश्लेषित किया जा करने के लिए आसान है ।
यहां, हम SPI के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, अवशेषों-रिकॉमबिनेंट फट में ncaas के विशिष्ट शामिल करने की अनुमति । विशेष रूप से, विभिंन रूपरेखा सादृश्य रोगाणुरोधी पेप्टाइड निस्ां एक मेजबान जीव के रूप में ई. कोलाई का उपयोग कर में शामिल कर रहे हैं । मास स्पेक्ट्रोमेट्री अमीनो एसिड प्रतिस्थापन और पेप्टाइड उत्पादों को सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है विकास निषेध परख और सूक्ष्म जीवाणु संकेतक उपभेदों का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर जैविक गतिविधि के लिए विश्लेषण कर रहे हैं ।
परिभाषित ncaas के साथ सफल रिकॉमबिनेंट निस्ां अभिव्यक्ति के लिए बुनियादी आवश्यकता एक उपयुक्त लाइन auxotrophic ई. कोलाई तनाव की आवश्यकता है । इस auxotrophy के लिए, proA बेकार हो गया है, उदाहरण के लिए जीनोमिक नॉकआउट द्वारा हासिल की । कोशिकाओं को पूरी तरह से intracellular प्रो के संश्लेषण से वंचित (यानी, proABCके विलोपन) के लिए संभावना के बिना संस्करण स्थिर auxotrophs हैं. व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जीन नॉकआउट तरीके फेज transduction या Datsenko & Wanner३३के अनुसार एकल जीन नॉकआउट कर रहे हैं । इसके अलावा, proA पीटकर उपभेदों ऐसे Addgene, CGSC या कईयो संग्रह के रूप में सार्वजनिक खजाने से प्राप्त किया जा सकता है । के बाद से रिकॉमबिनेंट nisABC अभिव्यक्ति यहां दिखाया T7 प्रवर्तकों के उपयोग पर निर्भर करता है, अभिव्यक्ति मेजबान तनाव को T7 आरएनए पोलीमरेज़ के लिए एक inducible जीन ले गया है । यह मेजबान जीनोम में λDE3 prophage का परिचय द्वारा पूरा किया जा सकता है, उदाहरण के लिए वाणिज्यिक किट का उपयोग कर । वैकल्पिक रूप से, उपभेदों जैसे BL21 (DE3) auxotrophic बनाया जा सकता है के रूप में ऊपर वर्णित है ।
रेखा के अनुरूप के लिए SPI का उपयोग करके, लक्षित निस्ां संरचनाओं काफी संशोधित किया जा सकता है, अद्वितीय अनुक्रम संयोजन और रासायनिक गुणों के साथ उपंयास पेप्टाइड वेरिएंट बनाने । इस तरह से शास्त्रीय जीन तकनीक की मूल सीमा को दरकिनार किया जा सकता है, जो २० cAAs की सुसाइड चेन chemistries को विवश कर रहा है. vivo में निस्ां के रासायनिक विविधीकरण के रूप में ऊपर उदाहरण प्राकृतिक PTMs पूरक करने के लिए और नाटकीय रूप से फट के रासायनिक अंतरिक्ष में वृद्धि करने के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण को दर्शाता है. हमें विश्वास है कि प्राकृतिक अमीनो एसिड की प्रदर्शनियों का विस्तार AMPs के लिए विशेष रूप से महान वादा रखती है । प्रोटीन में, कार्यक्षमताओं की एक जबरदस्त रेंज तीन आयामी संरचनाओं में 20 cAAs की एक निर्धारित व्यवस्था के माध्यम से महसूस किया जा सकता है । लंबाई3में केवल 7-100 एए के साथ, तरीके केवल cAAs के माध्यम से ऐसी संरचनात्मक सुविधाओं को प्राप्त करने के लिए AMPs के लिए सीमित हो जाएगा. यह इस प्रकार आश्चर्य की बात नहीं है कि फट के रूप में प्राकृतिक AMPs आमतौर पर बड़े पैमाने पर पोस्ट-अनुवाद4संशोधित कर रहे हैं । एक ही फैशन में, वैकल्पिक निर्माण ब्लॉकों के रूप में ncaas अपने pharmacodynamic और pharmacokinetic मापदंडों में सुधार करने के लिए महान वादा पकड़ (Baumann एट अल. २०१७३५ और उसमें संदर्भ देखें) ।
इस कार्य में प्रयुक्त SPI पद्धति अपेक्षाकृत आसान प्रायोगिक स्थापक, सीधा निष्पादन और उच्च reproducibility से लाभ करती है. वैश्विक प्रतिस्थापन के कारण, लक्ष्य पेप्टाइड्स में multisite ncAA शामिल करना भी संभव है । दूसरी ओर, विधि अक्सर लक्ष्य जीन उत्पाद में होने वाली अमीनो एसिड के प्रतिस्थापन के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । सिद्धांत रूप में, अवांछित पदों साइट द्वारा बदला जा सकता है निर्देशित mutagenesis, लेकिन इन अतिरिक्त परिवर्तन भी संरचना और गैर-सक्रियता सहित कई AMP गुण को प्रभावित कर सकता है । एक बार उत्पादन के लिए एक auxotrophic तनाव उपलब्ध है, कई ncaas आनुवंशिक स्तर पर व्यापक परिवर्तन की आवश्यकता के बिना परीक्षण किया जा सकता है । इसके अलावा, विधि auxotrophic ई. कोलाई उपभेदों तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी प्राकृतिक उत्पादन की मेजबानी का उपयोग किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, झोउ एट अल दिखाया है कि उपंयास के उत्पादन के लिए SPI फट भी स्वाभाविक रूप से टीआरपी में काम करता है-auxotroph एल लैकि्टस: परिभाषित मीडिया का प्रयोग, तीन tryptophan सादृश्य निस्ां५०में चार पदों पर शामिल किया गया ।
के बाद से SPI विधि ncAA द्वारा चुना cAA के वैश्विक प्रतिस्थापन की ओर जाता है, यह आम तौर पर लक्ष्य पेप्टाइड्स और प्रोटीन की एक व्यापक रेंज के लिए लागू होता है । auxotrophic ई. कोलाई उपभेदों की एक श्रृंखला उपलब्ध है (चरण 1 देखें), कई cAAs प्रत्येक की अनुमति के लिए ncaas द्वारा प्रतिस्थापन के लिए परीक्षण किया जाएगा । मुलाकात की मेटाकमी उपभेदों (जैसे, B834 (DE3)) का उपयोग कर शामिल सादृश्य सबसे अधिक कार्यरत हैं । isostructural के उदाहरणों से मुलाकात की एनालॉग azidohomoalanine है (अहा) और homopropargylglycine (Hpg), व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ncaas जो कुशलतापूर्वक शामिल किया जा सकता है । दोनों परिचय bioorthogonal संभालती है जो एक संगत alkyne या azide कार्यशीलता, क्रमशः ले जाने के अणुओं के लगाव की अनुमति । उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट रंजक या पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) moieties तांबे (I)-catalyzed azide alkyne cycloaddition (CuAAC)५१द्वारा संलग्न किया जा सकता है ।
हालांकि दोनों रिकॉमबिनेंट ncAA निगमन तरीकों (SPI और SCS) आम तौर पर पर्याप्त लक्ष्य मात्रा को प्राप्त करने, पैदावार अक्सर इसी पेप्टाइड्स और प्रोटीन के जंगली प्रकार के उत्पादन के सापेक्ष कम कर रहे हैं । के रूप में purities अक्सर उत्पादन क्षमता के साथ सहसंबंधी बनाना, अतिरिक्त शोधन कदम विशेष रूप से कम प्रचुर प्रजातियों के लिए, की आवश्यकता हो सकती है । रिकॉमबिनेंट निस्ां उत्पादन के इस विशेष मामले में, अपने-नेता अनुक्रम टैग बहुत सेल lysates से चयनात्मक संवर्धन द्वारा तेजस्वी शुद्धि को सरल करता है । इस प्रोटोकॉल में दिखाया शुद्धि शुद्धता और निस्ां की एकाग्रता में सुधार, लेकिन अक्सर AMP purities उपज और विशिष्ट गतिविधि निर्धारित करने के लिए पर्याप्त उपज नहीं है । IMAC के अलावा, आमतौर पर इस्तेमाल किया AMP शोधन विधियों HPLC शामिल हैं, आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (आईईसी) और वर्षण (उदा . एसीटोन या trichloroacetic अम्ल (टीसीए) का उपयोग करना) या तत्संबंधी संयोजन-एक multistep शुद्धिकरण योजना में जिसके परिणामस्वरूप५२ . यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि उनके सामान्यतः polycationic प्रकृति आईईसी शुद्धिकरण की सुविधा दे सकती है. फ्रीज-सुखाने अक्सर शुद्ध AMPs की दुकान करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
आदर्श रूप में, AMPs में शामिल करने के लिए ncaas सस्ती कीमतों पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध होना चाहिए या आसानी से सरल और reproducible रासायनिक संश्लेषण प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित. SPI विधि के लिए एक समान रूप से महत्वपूर्ण शर्त यह है कि ncAA मांयता प्राप्त है, सक्रिय है और अंतर्जात या सह द्वारा cognate tRNA पर आरोप लगाया aaRS व्यक्त की है । यह अमीनो एसिड सक्रियण या tRNA aminoacylation परख५३द्वारा इन विट्रो में परीक्षण किया जा सकता है । एक आसान विकल्प के रूप में, SPI इस तरह के ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में मॉडल प्रोटीन का परीक्षण अभिव्यक्ति (GFP) दोनों उपस्थिति में और ncAA पूरकता की अनुपस्थिति में आयोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, विकास मध्यम और कोशिका पारगम्यता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रासायनिक स्थिरता में घुलनशीलता महत्वपूर्ण कारकों का गठन ।
इस उदाहरण में, रोगाणुरोधी गतिविधि एक ग्राम सकारात्मक संकेतक तनाव का उपयोग कर दिखलाई गई । जैसा कि यह नेता peptidase NisP व्यक्त करता है, निस्ां परिपक्वता के अंतिम चरण catalyzed है । नेता अनुक्रम को हटाना (अपने-शुद्धि प्रयोजनों के लिए टैग) भी इन विट्रो में शुद्ध NisP५० या trypsin५४के साथ उपचार द्वारा किया जा सकता है । इस काम के दायरे से परे, रोगजनक जीवों और बहुऔषध प्रतिरोधी उपभेदों तो एक समान पद्धति का उपयोग कर AMPs द्वारा बैक्टीरियोस्टेटिक या जीवाणुनाशक निषेध के लिए परीक्षण किया जा सकता है. चिकित्सकीय प्रासंगिक लक्ष्य प्रजातियों MRSA, एमडीआर माइकोबैक्टीरियम तपेदिक, VRE, Acinetobacter baumannii, स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया, Pseudomonas aeruginosa और Klebsiella निमोनियाशामिल हैं । इसके अलावा आगर प्लेट प्रसार परख यहाँ प्रस्तुत, विकास निषेध भी जीवाणु प्रजातियों के साथ inoculated उपयुक्त तरल मीडिया का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है और AMP के साथ पूरक. शोरबा कमजोर पड़ने तरीकों का प्रयोग, ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) शुद्ध पेप्टाइड्स५५का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । यहां प्रस्तुत गतिविधि परख भी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अधिक गतिविधि AMP युक्त समाधान संदर्भ यौगिकों के सापेक्ष की शक्ति, उदाहरण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध निस्ां ।
फट के रिकॉमबिनेंट उत्पादन अक्सर व्यवहार्य३९है, जो सामांयतः PTM जीन की सह अभिव्यक्ति शामिल है । जैसे ही उत्पादन तनाव एक रासायनिक परिभाषित या सिंथेटिक न्यूनतम एक उपयुक्त ncAA युक्त माध्यम में स्थानांतरित कर दिया है, अवशेषों-इसी cAA के विशिष्ट प्रतिस्थापन जगह लेता है । इस प्रकार, अंय फट एक ही पद्धति द्वारा उत्पादित किया जा सकता है, बशर्ते कि उनके रिकॉमबिनेंट उत्पादन संभव है और शर्तों पाया जा सकता है, जहां ncAA निगमन और PTM लक्ष्य उत्पाद की पर्याप्त मात्रा में उपज । ध्यान दें कि मेजबान सेल proteome के अलावा, पेप्टाइड PTM मशीनरी भी ncAA-SPI के दौरान संशोधित हो सकता है । नतीजतन, लक्ष्य अभिव्यक्ति प्रेरण और निंनलिखित मशीन अवधि की लंबाई के समय अनुकूलन की आवश्यकता कर सकते हैं । के बाद से PTM एंजाइमों में ncAA शामिल उनके स्थिरता और गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं, प्रोसेस्ड रिप का उत्पादन सिद्धांत रूप में प्रभावित हो सकता है । पर्याप्त PTM एंजाइम प्रभावकारिता संसाधित पेप्टाइड के गठन के द्वारा संकेत दिया है, के रूप में एमएस और के द्वारा पता लगाया गतिविधि परख. के रूप में ऊपर शुरू की, विभिंन inducible प्रमोटरों के क्रम में PTM जीन पहले का उत्पादन करने के लिए कार्यरत किया जा सकता है (ncaa की अनुपस्थिति में) ncaa की उपस्थिति में प्रणेता पेप्टाइड जीन की प्रेरण के बाद । सामांय में, cAA के उत्पादन-लक्ष्य पेप्टाइड युक्त ncAA, जो है क्यों के अग्रदूत जीन के तंग दमन की आवश्यकता है के अलावा पहले दबाया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल के भीतर, यह वृद्धि मध्यम करने के लिए ग्लूकोज के अलावा के माध्यम से catabolic दमन द्वारा हासिल की है । खासकर के बाद से PTM के लिए आवश्यक एंजाइमों एक आनुवंशिक रूप से दूर मेजबान से आमतौर पर शुरू, अभिव्यक्ति तापमान और इसी जीन के codon उपयोग अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है अगर रिकॉमबिनेंट उत्पादन अभी तक नहीं किया गया है स्थापित. सिद्धांत रूप में, निस्ां NisBC और NisP के मामले में PTM एंजाइमों की मांयता और प्रसंस्करण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, पेप्टाइड में ncaas की उपस्थिति । AMPs में ncAA शामिल करने के लिए, यह इस तरह के लिए उपयुक्त अभिव्यक्ति की स्थिति और AMP गतिविधि परख की विश्वसनीयता की पहचान करने के लिए पहले छोटे पैमाने पर अभिव्यक्ति प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है.
The authors have nothing to disclose.
J.H.N., T.B. और M.B. यूरोपीय संघ FW7 कार्यक्रम (SYNPEPTIDE) द्वारा धन स्वीकार करते हैं । एफ.-J.S. और T.F. शिक्षा और विज्ञान के संघीय मंत्रालय द्वारा धन स्वीकार (BMBF कार्यक्रम “HSP २०२०”, टू-WIMIplus परियोजना SynTUBio) और जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (उत्कृष्टता के क्लस्टर “Catalysis में अवधारणाओं को एकीकृत”) ।
sodium chloride | Carl Roth, Germany | P029 | |
guanidine hydrochloride | Carl Roth, Germany | 0035.2 | |
dipotassium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P749.3 | |
potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | 3904.3 | |
sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth, Germany | K300.2 | |
disodium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P030.2 | |
L-alanine | Carl Roth, Germany | 3076.2 | |
L-arginine | Carl Roth, Germany | 3144.3 | |
L-asparagine monohydrate | Carl Roth, Germany | HN23.1 | |
L-aspartic acid | Carl Roth, Germany | T202.1 | |
L-cysteine | Carl Roth, Germany | 3467.3 | |
L-glutamine | Carl Roth, Germany | 3772.1 | |
L-glutamic acid | Carl Roth, Germany | 3774.1 | |
L-glycine | Carl Roth, Germany | 3187.3 | |
L-histidine | Carl Roth, Germany | 3852.3 | |
L-isoleucine | Carl Roth, Germany | 3922.3 | |
L-leucine | Carl Roth, Germany | 3984.3 | |
L-lysine monohydrate | Carl Roth, Germany | 4207.2 | |
L-methionine | Carl Roth, Germany | 9359.4 | |
L-phenylalanine | Carl Roth, Germany | 4491.2 | |
L-proline | Carl Roth, Germany | T205.3 | |
L-serine | Carl Roth, Germany | 4682.4 | |
L-threonine | Carl Roth, Germany | T206.2 | |
L-tryptophan | Carl Roth, Germany | 4858.2 | |
L-tyrosine | Carl Roth, Germany | T207.2 | |
L-valine | Carl Roth, Germany | 4879.4 | |
ammonium sulfate | Carl Roth, Germany | 3746.3 | |
magnesium sulfate | Carl Roth, Germany | 0261.2 | |
D-glucose | Carl Roth, Germany | 6780 | prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar |
calcium chloride | Carl Roth, Germany | PN93.2 | |
iron(II) chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 372870 | |
thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Germany | T1270 | |
biotin | Carl Roth, Germany | 3822.2 | |
copper(II) sulfate | Merck, Germany | 102792 | |
manganese(II) chloride | Carl Roth, Germany | KK36.2 | |
zinc chloride | Merck, Germany | 108816 | |
immonium orthomolybdate | Sigma-Aldrich, Germany | 277908 | |
glycerol | Carl Roth, Germany | 7533.3 | |
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich, Germany | I6758 | |
ampicillin sodium salt | Carl Roth, Germany | K029.5 | working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O |
kanamycin sulfate | Carl Roth, Germany | T832.2 | working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O |
chloramphenicol | Carl Roth, Germany | 3886.1 | working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol |
(4S)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3970 | |
(4R)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3975 | |
(4S)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-1395 | |
(4R)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-2980 | |
(4S)-methanoproline | chemically synthesized | ||
(4R)-methanoproline | chemically synthesized | ||
hydrochloric acid (HCl) | Carl Roth, Germany | P074.4 | |
ethanol | VWR, Germany | 20825.324 | |
M17-broth | Sigmal-Aldrich, Germany | 56156 | commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation |
agar-agar | Carl Roth, Germany | 5210.5 | |
Nisin from Lactococcus lactis | Sigma-Aldrich, Germany | N5764 | commercial product, can be used as reference for bioactivity |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Carl Roth, Germany | A994.1 | |
imidazole | Carl Roth, Germany | 3899.3 | |
1.5 mL autosampler vial for LC-MS | Sigma-Aldrich, Germany | Supelco 854165 | |
acetonitrile | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
formic acid | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude | GE Healthcare, UK | 29-0486-31 | different manufacturers and resins available for IMAC |
0.45 µm bottle top filter unit | VWR, Germany | 10040-470 | sterile filtration of solutions using a vacuum pump |
0.45 µm syringe filter PVDF membrane | Carl Roth, Germany | CCY1.1 | sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates |
luer-lock syringe, PP, 50 ml | Carl Roth, Germany | T552.2 | sterile filtration of solutions |
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 | |
petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth, Germany | TA19 | |
Nile red | Sigma-Aldrich, Germany | 72485 | |
E. coli ΔproA strain | CGSC, Keio collection | JW0233-2 | proline-auxotrophic E. coli K-12 strain |
E. coli B834(DE3) | Novagen (Merck), Germany | 69041 | methionine-auxotrophic E. coli B strain |
λDE3 Lysogenization Kit | Novagen (Merck), Germany | 69734-3 | |
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT | bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890 | ||
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 5427 R | |
peristaltic pump | GE Healthcare, UK | P1 | |
FPLC system | GE Healthcare, UK | Äkta Purifier 10 or the like | |
inverted microscope | Nikon | TI Eclipse wide-field fluorescence microscope with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp | example setup for fluorescence microscopy |
electron multiplying CCD (EMCCD) camera | Andor Technologies, UK | Andor Luca | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence excitation filter | Thorlabs, USA | Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence emission filter | AHF Analysentechnik, Germany | T 560 LPXR | example setup for fluorescence microscopy |
cover slip 24 x 60 mm | Carl Roth, Germany | LH26.1 | example setup for fluorescence microscopy |
Immersion Oil | Carl Zeiss, Germany | Immersol 518 F | example setup for fluorescence microscopy |
probe sonicator | Bandelin, Germany | Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 | 200 W maximum HF output |
C5 HPLC column (2.1×100 mm, 3 µm particle size) | Sigma-Aldrich, Germany | 567227-U | example setup for mass spectrometry |
ESI-TOF coupled to HPLC system | Agilent, USA | Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC | example setup for mass spectrometry |