O protocolo apresenta o Escherichia coli-baseado pressão seletiva incorporação de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) a lactococcal peptídeo antimicrobiano nisina. Suas propriedades podem ser alteradas durante a expressão recombinantes através de substituição com ncAAs desejado em meios de crescimento definido. As alterações resultantes na Bioatividade são mapeadas por ensaios de inibição de crescimento e de microscopia de fluorescência.
A natureza tem uma variedade de possibilidades para criar novas funções de proteínas modificando a sequência dos blocos de construção de cada aminoácido. No entanto, todas as variações baseiam-se os 20 aminoácidos canônicos (cAAs). Como uma maneira de introduzir os polipeptídeos adicionais propriedades físico-químicas, a incorporação de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) é cada vez mais usada na engenharia de proteínas. Devido à sua extensão relativamente curta, a modificação de peptídeos ribosomally sintetizados e post-translationally modificados por ncAAs é particularmente atraente. Novas funcionalidades e alças de químicas podem ser geradas por alterações específicas de resíduos individuais. O método de incorporação (SPI) de pressão seletiva utiliza cepas auxotróficos anfitrião que são privadas de um aminoácido essencial em meios quimicamente definidas de crescimento. Vários análogos de aminoácido estruturalmente e quimicamente semelhante podem então ser ativados pelo correspondente aminoacil-tRNA sintetase e fornecem resíduos específicos cAA(s) substituições de ncAA(s) → na sequência do peptide ou proteína alvo. Embora, no contexto do método SPI, ncAAs são também incorporadas o proteome anfitrião durante a fase de expressão de gene recombinante, a maioria dos recursos da célula é atribuída à expressão do gene do alvo. Isto permite eficiente incorporação de resíduos específicos de ncAAs muitas vezes acompanhada com quantidades elevadas de destino modificado. O trabalho apresentado descreve na vivo incorporação de seis análogos de prolina a nisina peptídeo antimicrobiano, uma lantibiotic naturalmente produzida por Lactococcus lactis. Propriedades antimicrobianas da nisina podem ser alteradas e ampliadas durante sua fermentação e expressão em Escherichia coli de auxotróficos estirpes em meios de crescimento definido. Desse modo, os efeitos da substituição de resíduos específicos da cAAs com ncAAs podem proporcionar mudanças na especificidade e atividade antimicrobiana. Ensaios de atividade antimicrobiana e microscopia de fluorescência são usados para testar as novas variantes de nisina para inibição do crescimento de uma estirpe de indicador de Gram-positivas Lactococcus lactis . Espectroscopia de massa é usada para confirmar a incorporação da ncAA em variantes de nisina bioativos.
A descoberta de antibióticos no século XX e o desenvolvimento paralelo de novos compostos antimicrobianos contra microorganismos patogênicos habilitados direcionados tratamentos de infecções bacterianas. No entanto, devido ao surgimento de patógenos multirresistentes como resistente à meticilina Staphylococcusaureus (MRSA), enterococos resistentes à vancomicina (VRE), MDR (multirresistentes) Salmonella typhimurium fago tipo 10 (DT10 ), e Klebsiella pneumoniae, é urgentemente necessário gerar novos agentes antimicrobianos1. Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são compostos versáteis, muitas vezes altamente específicos que são candidatos promissores para o desenvolvimento de novas drogas, graças a suas propriedades físico-químicas, flexibilidade, tamanho, hidrofobicidade e modo de acção2. Amplificadores são pequenos peptídeos geralmente consiste de 7-100 aminoácidos. Muitas vezes, eles têm uma estrutura catiônica rica em resíduos carregados positivamente de arginina e lisina, que interagem com a membrana celular microbiana direcionada, que oposta é cobrada3. Um subgrupo especial de amplificadores são peptídeos ribosomally sintetizado e modificado posttranslationally (RiPPs)4. Estes são produzidos por muitos organismos do Reino dos fungos e o domínio das bactérias. Um do mais conhecido e amplamente utilizado RiPPs é nisina, naturalmente produzida pela bactéria ácido láctico Lactococcus lactis (L. lactis). Ativo contra um painel de bactérias gram-positivas, nisina tem sido usada como um biopreservative na indústria de alimentos para mais de 50 anos, devido às suas propriedades antimicrobianas e ausência de resistência evoluída no cepas microbianas alvo5. Estudos têm mostrado que a nisina desestabiliza e gera poros em membranas de pilha bacterianas, levando a atividade antimicrobiana contra ambos os patógenos Gram-positivas e Gram-negativas6. Por ligação de lipídios II, síntese da parede celular bacteriana é inibida7. A nisina é codificada por nisA como um peptídeo precursor linear, que é composto de um líder e uma região de peptídeo de núcleo (Figura 1). Após a síntese ribossomal, prenisin primeiro é modificado pelo dehidratase NisB. Aqui, resíduos de serina e treonina na região prepeptide do núcleo são desidratados para dehydroalanine (Dha) e dehydrobutyrine (Dhb)8. Posteriormente, os resíduos desidratados são acoplados com cisteína para anéis de forma lanthionine (daí o nome “lantibiotic” para lanthionine anel contendo antibióticos) por uma adição de Michael catalisada por enzima. Esta modificação pós-traducional (PTM) é catalisada pela ciclase NisC. Em L. lactis, o prenisin modificado é então transportado fora da célula por transporte NisT, e o peptídeo líder é clivado pela protease NisP para liberar o formulário nisina maduro e ativo9. O peptidase líder responsável NisP tem uma alta especificidade, uma vez que somente processos modificados nisina eficientemente10.
Em geral, ativos RiPPs resultar da ação de enzimas PTM (por exemplo NisBC), que aumentam drasticamente o espaço químico de peptides curtos, por exemplo, através de acetilação, glicosilação, metilação ou fosforilação. Este nível de complexidade pode ser expandida ainda mais pela incorporação direta de ncAAs. Enquanto muitas vezes viável, síntese química de AMPs é um desafio para a produção em larga escala devido à sua complexidade estrutural. Por exemplo, a síntese química total do lactosin lantibiotic S em 71 passos de reação foi conseguida com um rendimento final de 10% e o de nisina com um rendimento bruto de 0,003%11,12. Portanto, a produção biológica oferece uma alternativa viável, devido a geração de estereocentros corretos e produto de alta concentração.
Até hoje, mais de 150 ncAAs, por exemplo, tendo grupos funcionais contendo flúor ou azidas, foram incorporadas proteínas recombinantes e vários exemplos de amplificadores ncAA-modificado foram relatados13,14, 15,16. Com a introdução do ncAAs, romance propriedades físico-químicas podem ser geradas em comparação com o mutagenesis convencional. A diversidade dos peptídeos existentes pode ser aumentada, possivelmente levando a novos antibióticos.
Um método para a incorporação de ncAAs peptídeos recombinantes é incorporação de pressão seletiva (SPI) baseada na utilização de cepas bacterianas auxotróficos17. Estas variedades não são capazes de sintetizar o correspondente analógico de cAA do ncAA. A metodologia usa a especificidade de substrato relaxante frequentemente observado, uma característica de muitos naturais aminoacil-tRNA sintetases (aaRSs)18. Além de seus substratos naturais de cAA, estas enzimas são frequentemente capazes de reconhecer e ativar o ncAA desejado e carregá-lo em sua cognata tRNA(s). Isto leva a incorporação ribosomal da ncAA para o produto do gene alvo em forma de resíduo-específica (ou seja, cAA → ncAA substituição). Isto naturalmente só é possível quando o ncAA desejado é estrutural e quimicamente semelhante ao ácido aminado canônico e tolerado pela fisiologia da célula, a maquinaria de tradução e a sequência do alvo do peptide ou proteína. Em uma instalação experimental particular, as células hospedeiras auxotróficos são cultivadas em meio definido fornecido com uma concentração limitante do aminoácido nativo para ser substituído. O crescimento celular ou troca por cAA-livre médio leva à depleção intracelular de cAA. Na próxima etapa, a ncAA é adicionado e a expressão do gene alvo é induzida. Inevitavelmente, ncAAs são agora também incorporados em muitas outras proteínas na célula hospedeira durante esta fase da expressão do gene alvo. Não obstante, a toxicidade da instalação do SPI é mantida em um nível baixo desde que a cepa de Escherichia coli (e. coli) é transformada com um plasmídeo que carreg o gene alvo sob controle de um promotor forte (comumente o promotor T7 altamente competitivo / Sistema de RNA polimerase)19. Imediatamente após a indução (geralmente quando o cAA está esgotado), o host células deixam de crescer e suas machineries citoplasmáticos enzimáticos são utilizados principalmente para a expressão do gene alvo baseados no plasmídeo. Mutagenesis local-dirigido pode ser usado para definir o site da instalação de ncAA de resíduo-específicas no gene alvo20.
Como um peptídeo de modelo para a incorporação de ncAAs, a efeitos AMP nisina A foi escolhida. É 34 aminoácidos longos e tem apenas um resíduo prolina único na sequência de peptídeo de núcleo (Figura 1). Como em subtilisina, ericin A e S e epidermin, bem como em nisina Z e nisina Q, a prolina conservada parece ser essencial para a atividade9,21. A prolina cAA desempenha um papel particularmente importante na rotação de Amida peptidyl-prolil e estabilização da estrutura secundária. Sua cadeia lateral anel conformações (exo / endo puckers) são responsáveis por uma estabilização termodinâmica da ligação Amida. Modificações químicas específicas (tais como hydroxylations, fluorinations, methylations) de prolil puckers frequentemente criticamente influenciam o dobramento estabilidade, rigidez do andaime e funções de muitas estruturas biológicas22. Assim, é plausível esperar que as substituições de analógico de prolina Pro→ vão dotar o anel B, o segundo anel da nisina, com romance e propriedades incomuns.
Aqui, uma prolina-auxotróficos estirpe de Escherichia coli foi usado para a produção de nisina recombinante. Isso requer a expressão do gene prepeptide nisA , bem como a modificação da enzima genes nisBC. O produto de peptídeo geneticamente codificado carrega um N-terminal com sua tag líder para cromatografia de purificação através de afinidade. Para determinação da atividade, L. lactis expressando e secretando NisPT é usado para ativar as variantes de nisina recombinante de lisados celulares de e. coli ou peptídeo purificada amostras (Figura 1). O AMP maduro é liberado após a clivagem do líder por NisP. Neste método de difusão de ágar, a amostra de AMP difunde-se no meio de um crescimento sólido e pode inibir o crescimento dos microorganismos Gram-positivos. Após a incubação, isto pode ser observado visualmente por halos de inibição do crescimento. Além de L. lactis como um indicador, modificado nisina variantes mostrou atividade antimicrobiana contra Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus e Lactobacillus johnsonii 21,23.
Um método alternativo e experimentalmente diferente para incorporar ncAAs em RiPPs é stop códon supressão (SCS)24. Por isso, um tRNA ortogonais / par de aminoacil-tRNA sintetase (aaRS) é necessária para o ncAA correspondente. Idealmente, todos estes três componentes são opaco, ou seja, eles não interagem com os tRNAs endógenos e aaRSs. Um aaRS ncAA específicos podem ser gerados pela modificação do sítio ativo da enzima e triagem de bibliotecas genéticas de mutante sintetases25. Além disso, a introdução de um ncAA exige um codão que é transferido, e que não codifica para o cAA. Comumente, o codão stop âmbar é usado24,26.
Recentemente, o SPI foi estabelecido para a incorporação de α-cloroacetamida-contendo e clique-química-compatible ncAAs NisA27. Por exemplo, Nε– alocação-lisina foi incorporada a captistruin de peptídeo de laço com site-specific (SCS) e métodos de incorporação de resíduos específicos (SPI) e posteriormente modificada em vitro por metátese de rutênio-catalisada28 . Em comparação com o SPI, o método do SCS é mais complicado desde um tRNA ortogonais / RAA par tem que ser co expressa. Até à data, ó pares para incorporação de prolina foram desenvolvidos29, mas o melhor de nosso conhecimento, nenhum exemplo de incorporação analógico de prolina tem sido relatado.
Note-se que nem todos os ncAAs pode ser incorporadas utilizando a metodologia SPI. Em primeiro lugar, a absorção de ncAAs para o citoplasma é regulada por uma infinidade de proteínas de transporte que são incorporados na membrana citoplasmática, que é a membrana interna para bactérias Gram-negativas como e. coli. Normalmente, e. coli é capaz de transportar uma vasta gama de análogos de aminoácidos na célula com cadeias laterais estruturalmente e quimicamente semelhante ao canônico de aminoácidos. Segundo, muitos ncAAs quimicamente reativos, ou instáveis pode agir como um inibidor para o crescimento celular, como eles são tóxicos para o metabolismo e a fisiologia do hospedeiro celular30. Assim, a absorção e toxicidade do ncAA para o host de produção devem ser testados previamente. Para evitar a inativação da maquinaria PTM como um efeito colateral, uma instalação de expressão estritamente controlada dos genes responsáveis pode ser usada para incorporar o aminoácido natural as enzimas de modificação (por exemplo, nisBC) e o ncAA no gene do alvo ( por exemplo, nisA). Isso pode ser feito usando dois diferentes promotores e indução da expressão do gene alvo, conforme demonstrado no especialmente projetada de protocolos SPI31. Conforme descrito acima, o método SPI depende da especificidade de substrato descontraído da aaRS, que permite a ativação de ncAA e tRNA cognatos de carregamento. Posteriormente, o tRNA é entregue ao ribosome seguido de formação de ligação amida e dobramento do peptide alvo (poli). Este processos, revisão e edição de mecanismos podem tornar-se relevante32. Por estas razões, é de grande importância para ter um alvo ncAA estruturalmente e quimicamente semelhante a cAA. Outros pontos cruciais são estabilidade suficiente (ambos na mídia crescimento e expostos para o metabolismo celular) e solubilidade do ncAA. Além disso, deve ser comercialmente disponíveis ou fáceis de ser sintetizados quimicamente.
Aqui, descrevemos um protocolo para SPI, permitindo a incorporação de resíduos específicos de ncAAs em RiPPs recombinante. Particularmente, os análogos de prolina diferentes são incorporados a nisina peptídeo antimicrobiano A usando e. coli como organismo hospedeiro. Espectrometria de massa é usada para verificar a substituição do amino-ácido e produtos do peptide são analisados por Bioatividade usando microscopia de fluorescência usando cepas microbianas indicador e ensaios de inibição de crescimento.
O requisito básico para a expressão de sucesso nisina recombinante com ncAAs definidos requer uma adequado prolina auxotróficos estirpe de Escherichia coli . Para isto auxotrophy, a proA tem que ser disfuncional, por exemplo, alcançado por nocaute genômica. Células totalmente privaram da biossíntese de Pro intracelular (ou seja, a exclusão de proABC) sem possibilidade de reversão são auxotrophs estáveis. Amplamente utilizado gene nocaute métodos são transdução fago ou single-gene nocaute de acordo com Datsenko & Wanner33. Além disso, cepas de nocaute de proA podem ser obtidas de repositórios públicos como Addgene, NODIA ou a coleção de Keio. Desde que a expressão recombinante nisABC mostrada aqui baseia-se na utilização de promotores de T7, a estirpe de anfitrião de expressão tem que carregam um gene inducible para T7 RNA polimerase. Isso pode ser feito pela introdução da prophage λDE3 o genoma do hospedeiro, por exemplo, utilizando o kit comercial. Alternativamente, cepas como BL21(DE3) podem ser feitas auxotróficos conforme descrito acima.
Usando SPI para inserção de análogos de prolina, as estruturas de nisina alvo podem ser substancialmente modificadas, criação de variantes de peptídeo romance com combinações de sequência única e propriedades químicas. Desta forma, o limite básico de tecnologia genética clássica pode ser contornado, que é restrito para os químicos de cadeia lateral da cAAs a 20. Na vivo química diversificação da nisina como exemplificado acima demonstra uma abordagem geral para complementar PTMs naturais e para melhorar drasticamente o espaço químico de RiPPs. Acreditamos que ampliar o repertório dos aminoácidos naturais detém grande promessa especial para amplificadores. Em proteínas, uma gama enorme de funcionalidades pode ser realizada através de um arranjo definido dos 20 cAAs em estruturas tridimensionais. Com apenas 7-100 aa no comprimento3, maneiras de alcançar tais características estruturais somente através de cAAs seria limitadas para amplificadores. Assim, não é surpreendente que AMPs naturais em forma de RiPPs comumente são modificados extensivamente post-translationally4. Da mesma forma, ncAAs como blocos de construção alternativos segura a grande promessa para melhorar seus parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos (ver referências e Baumann et al . 201735 nele).
A SPI metodologia este trabalho beneficia de uma instalação experimental relativamente fácil, simples execução e alta reprodutibilidade. Devido à substituição global, incorporação de ncAA em vários locais em peptídeos de destino também é viável. Por outro lado, o método pode não ser adequado para substituição de aminoácidos, ocorrendo frequentemente no produto do gene alvo. Em princípio, posições indesejadas podem ser alteradas pelo mutagenesis local-dirigido, mas essas alterações adicionais também podem afetar várias propriedades de AMP, incluindo estrutura e Bioatividade. Quando uma tensão auxotróficos de produção estiver disponível, vários ncAAs pode ser testados sem a necessidade de grandes mudanças a nível genético. Além disso, o método não está limitado a auxotróficos Escherichia coli as tensões, mas também pode ser realizada usando o host de produção natural. Por exemplo, Zhou et al mostrou que a SPI para produção de novela RiPPs também funciona naturalmente Trp-auxotroph L. lactis: usando definido mídia, três análogos de triptofano foram incorporados em quatro posições em nisina50.
Desde que o método SPI conduz à substituição global dos escolhidos cAA pela ncAA, é geralmente aplicável a uma ampla gama de alvo de peptídeos e proteínas. Uma gama de auxotróficos de Escherichia coli , cepas está disponível (Veja passo 1), permitindo que vários cAAs cada a ser testado para substituição por ncAAs. Conheci os análogos incorporados usando metA-cepas deficientes (por exemplo, B834(DE3)) do são mais comumente empregados. Exemplos de isostructural Met análogos são azidohomoalanine (Aha) e homopropargylglycine (Hpg), ncAAs comercialmente disponíveis que podem ser incorporados de forma eficiente. Ambos apresentar opaco alças que permitem a fixação de moléculas carregando um alquino compatível ou funcionalidade de azida sódica, respectivamente. Por exemplo, corantes fluorescentes ou metades de polietileno glicol (PEG) podem ser anexados por cobre (I)-catalisada azida alquino cicloadição (CuAAC)51.
Embora os dois métodos de incorporação da ncAA recombinante (SPI e SCS) geralmente obter quantidades suficientes de alvo, rendimentos são frequentemente reduzidos em relação à produção do selvagem-tipo do correspondente de peptídeos e proteínas. Como as purezas frequentemente correlacionam com a eficiência da produção, etapas de purificação adicional podem ser necessárias, especialmente para espécies abundantes-baixo. Neste caso específico de produção de nisina recombinantes, a sequência de líder com sua tag simplifica RiPP purificação por enriquecimento seletivo dos lisados celulares. A purificação mostrada neste protocolo melhora a pureza e concentração da nisina, mas muitas vezes não rende purezas AMP suficientes para determinar o rendimento e a atividade específica. Além de IMAC, métodos de purificação de AMP comumente usados incluem HPLC, cromatografia de troca iônica (IEC) e precipitação (por exemplo. usando acetona ou ácido tricloroacético (TCA)) ou combinações – resultando em um esquema de várias etapas de purificação52 . Note-se que sua comumente polycationic natureza pode facilitar a purificação do IEC. Liofilização é frequentemente usado para armazenar AMPs purificadas.
Idealmente, ncAAs para incorporação em ampères deve ser comercialmente disponível a preços acessíveis ou facilmente produzido por protocolos de síntese química simples e reprodutível. Uma condição igualmente importante para o método SPI é que a ncAA é reconhecido, ativado e cobrado para o tRNA cognatos pela aaRS endógena ou co expressa. Isso pode ser testado em vitro por aminoácidos ativação ou tRNA aminoacylation ensaio53. Como uma alternativa fácil, expressões de teste SPI de proteínas de modelo como a proteína verde fluorescente (GFP) realizada tanto na presença e na ausência de suplementação de ncAA podem ser executadas. Além disso, solubilidade na permeabilidade média e célula de crescimento, bem como estabilidade química constituem fatores importantes.
Neste exemplo, a atividade antimicrobiana foi exibida usando uma estirpe de indicador Gram-positivas. Como expressa o peptidase líder NisP, a etapa final da maturação da nisina é catalisada. Remoção da sequência líder (His-marcados para fins de purificação) também pode ser realizada em vitro por tratamento com purificada NisP50 ou tripsina54. Além do escopo deste trabalho, os organismos patogénicos e multi-droga resistentes podem então ser testados para inibição bacteriostática ou bactericida por amplificadores utilizando uma metodologia semelhante. Espécies-alvo clinicamente relevantes incluem MRSA, MDR Mycobacterium tuberculosis, VRE, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae. Além da difusão de placa de ágar, ensaio, apresentou crescimento inibição também pode ser executada usando a mídia adequada de líquido inoculado com a espécie bacteriana e suplementado com AMP. Usando métodos de diluição do caldo, a concentração inibitória mínima (CIM) pode ser determinada usando peptídeos pura55. O ensaio da atividade aqui apresentado também pode ser usado para estimar a bioatividade e potência do AMP-contendo soluções em relação à referência compostos, nisina por exemplo comercialmente disponível.
Produção recombinante de RiPPs é muitas vezes possível39, que geralmente inclui co a expressão de genes PTM. Assim que o esforço de produção é transferido para um meio mínimo quimicamente definido ou sintético contendo um apropriado ncAA, substituição de resíduos específicos de cAA correspondente tem lugar. Assim, outros RiPPs pode ser produzido pela mesma metodologia, desde que sua produção recombinante é viável e condições encontram-se a incorporação da ncAA e PTM rendem suficientes quantidades de produto-alvo. Observe que, além do anfitrião célula proteome, a maquinaria PTM peptídeo também pode se tornar ncAA-modificado durante a SPI. Consequentemente, o timing da indução de expressão de destino e a duração do período de incubação de seguir podem exigir otimização. Desde que a incorporação de ncAA em enzimas PTM pode afetar a sua estabilidade e atividade, a produção do RiPP transformado pode em princípio ser afetada. Eficácia de enzima suficiente PTM é indicada pela formação de prepeptide transformado, detectadas por ensaios MS e Bioatividade. Como apresentado acima, diferentes promotores inducible poderiam ser empregados para produzir o PTM genes primeiro (na ausência do ncAA) seguiram por indução do gene do peptide precursor na presença do ncAA. Em geral, a produção de cAA-contendo o peptídeo de destino deve ser suprimida antes da adição do ncAA, é por isso que a forte repressão do gene precursor é necessária. Neste protocolo, isto é conseguido pela repressão catabólica por meio da adição de glicose para o meio de crescimento. Especialmente, uma vez que as enzimas PTM necessárias para processamento prepeptide originam-se geralmente um host geneticamente distante, uso de temperatura e códon de expressão dos genes correspondentes pode exigir otimização se produção recombinante ainda não foi estabelecido. Em princípio, a presença de ncAAs no prepeptide pode interferir com reconhecimento e processamento das enzimas PTM, no caso de nisina, NisBC e NisP. Para a incorporação de ncAA nos amplificadores, assim é aconselhável realizar experiências em escala reduzida expressão primeiro para identificar condições de expressão adequado e a confiabilidade do ensaio de atividade do AMP.
The authors have nothing to disclose.
J.H.N., T.B. e M.B. reconheceram financiamento pelo programa UE FW7 (SYNPEPTIDE). F.-J.S. e T.F. reconheceram financiamento pelo Ministério Federal da educação e ciência (BMBF programa “HSP 2020”, TU-WIMIplus projeto SynTUBio) e Fundação de pesquisa alemã (Cluster de excelência “Unifying conceitos em catálise”).
sodium chloride | Carl Roth, Germany | P029 | |
guanidine hydrochloride | Carl Roth, Germany | 0035.2 | |
dipotassium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P749.3 | |
potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | 3904.3 | |
sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth, Germany | K300.2 | |
disodium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P030.2 | |
L-alanine | Carl Roth, Germany | 3076.2 | |
L-arginine | Carl Roth, Germany | 3144.3 | |
L-asparagine monohydrate | Carl Roth, Germany | HN23.1 | |
L-aspartic acid | Carl Roth, Germany | T202.1 | |
L-cysteine | Carl Roth, Germany | 3467.3 | |
L-glutamine | Carl Roth, Germany | 3772.1 | |
L-glutamic acid | Carl Roth, Germany | 3774.1 | |
L-glycine | Carl Roth, Germany | 3187.3 | |
L-histidine | Carl Roth, Germany | 3852.3 | |
L-isoleucine | Carl Roth, Germany | 3922.3 | |
L-leucine | Carl Roth, Germany | 3984.3 | |
L-lysine monohydrate | Carl Roth, Germany | 4207.2 | |
L-methionine | Carl Roth, Germany | 9359.4 | |
L-phenylalanine | Carl Roth, Germany | 4491.2 | |
L-proline | Carl Roth, Germany | T205.3 | |
L-serine | Carl Roth, Germany | 4682.4 | |
L-threonine | Carl Roth, Germany | T206.2 | |
L-tryptophan | Carl Roth, Germany | 4858.2 | |
L-tyrosine | Carl Roth, Germany | T207.2 | |
L-valine | Carl Roth, Germany | 4879.4 | |
ammonium sulfate | Carl Roth, Germany | 3746.3 | |
magnesium sulfate | Carl Roth, Germany | 0261.2 | |
D-glucose | Carl Roth, Germany | 6780 | prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar |
calcium chloride | Carl Roth, Germany | PN93.2 | |
iron(II) chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 372870 | |
thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Germany | T1270 | |
biotin | Carl Roth, Germany | 3822.2 | |
copper(II) sulfate | Merck, Germany | 102792 | |
manganese(II) chloride | Carl Roth, Germany | KK36.2 | |
zinc chloride | Merck, Germany | 108816 | |
immonium orthomolybdate | Sigma-Aldrich, Germany | 277908 | |
glycerol | Carl Roth, Germany | 7533.3 | |
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich, Germany | I6758 | |
ampicillin sodium salt | Carl Roth, Germany | K029.5 | working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O |
kanamycin sulfate | Carl Roth, Germany | T832.2 | working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O |
chloramphenicol | Carl Roth, Germany | 3886.1 | working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol |
(4S)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3970 | |
(4R)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3975 | |
(4S)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-1395 | |
(4R)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-2980 | |
(4S)-methanoproline | chemically synthesized | ||
(4R)-methanoproline | chemically synthesized | ||
hydrochloric acid (HCl) | Carl Roth, Germany | P074.4 | |
ethanol | VWR, Germany | 20825.324 | |
M17-broth | Sigmal-Aldrich, Germany | 56156 | commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation |
agar-agar | Carl Roth, Germany | 5210.5 | |
Nisin from Lactococcus lactis | Sigma-Aldrich, Germany | N5764 | commercial product, can be used as reference for bioactivity |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Carl Roth, Germany | A994.1 | |
imidazole | Carl Roth, Germany | 3899.3 | |
1.5 mL autosampler vial for LC-MS | Sigma-Aldrich, Germany | Supelco 854165 | |
acetonitrile | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
formic acid | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude | GE Healthcare, UK | 29-0486-31 | different manufacturers and resins available for IMAC |
0.45 µm bottle top filter unit | VWR, Germany | 10040-470 | sterile filtration of solutions using a vacuum pump |
0.45 µm syringe filter PVDF membrane | Carl Roth, Germany | CCY1.1 | sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates |
luer-lock syringe, PP, 50 ml | Carl Roth, Germany | T552.2 | sterile filtration of solutions |
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 | |
petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth, Germany | TA19 | |
Nile red | Sigma-Aldrich, Germany | 72485 | |
E. coli ΔproA strain | CGSC, Keio collection | JW0233-2 | proline-auxotrophic E. coli K-12 strain |
E. coli B834(DE3) | Novagen (Merck), Germany | 69041 | methionine-auxotrophic E. coli B strain |
λDE3 Lysogenization Kit | Novagen (Merck), Germany | 69734-3 | |
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT | bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890 | ||
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 5427 R | |
peristaltic pump | GE Healthcare, UK | P1 | |
FPLC system | GE Healthcare, UK | Äkta Purifier 10 or the like | |
inverted microscope | Nikon | TI Eclipse wide-field fluorescence microscope with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp | example setup for fluorescence microscopy |
electron multiplying CCD (EMCCD) camera | Andor Technologies, UK | Andor Luca | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence excitation filter | Thorlabs, USA | Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence emission filter | AHF Analysentechnik, Germany | T 560 LPXR | example setup for fluorescence microscopy |
cover slip 24 x 60 mm | Carl Roth, Germany | LH26.1 | example setup for fluorescence microscopy |
Immersion Oil | Carl Zeiss, Germany | Immersol 518 F | example setup for fluorescence microscopy |
probe sonicator | Bandelin, Germany | Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 | 200 W maximum HF output |
C5 HPLC column (2.1×100 mm, 3 µm particle size) | Sigma-Aldrich, Germany | 567227-U | example setup for mass spectrometry |
ESI-TOF coupled to HPLC system | Agilent, USA | Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC | example setup for mass spectrometry |