Presenteras i protokollet den Escherichia coli-baserat selektionstryck införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) i Lactococcus antimikrobiell peptid nisin. Dess egenskaper kan ändras under rekombinant uttryck via substitution med önskad ncAAs i definierade tillväxt medier. Förändringar i bioaktivitet mappas av tillväxt hämning analyser och fluorescensmikroskopi.
Naturen har en mängd möjligheter att skapa nya protein funktioner genom att ändra sekvensen av enskilda aminosyror byggstenar. Men är alla varianter baserade på de 20 kanoniska aminosyrorna (cAAs). Som ett sätt att införa ytterligare fysikalisk-kemiska egenskaper i polypeptider, används införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAAs) alltmer i proteinteknik. På grund av sin relativt korta längd och är ändring av ribosomally syntetiserade och post-translationally modifierade peptider av ncAAs särskilt attraktiva. Nya funktioner och kemiska handtag kan genereras av särskilda modifikationer av enskilda rester. Selektionstryck inkorporering (SPI) metoden utnyttjar auxotrophic värd stammar som berövas en essentiell aminosyra i kemiskt definierade tillväxt medier. Flera strukturellt och kemiskt liknande aminosyra analoger kan sedan aktiveras av den motsvarande aminoacyl-tRNA-syntetas och ge rester-specifika cAA(s) → ncAA(s) substitutioner i sekvensen mål peptid eller protein. Även om, i samband med metoden SPI, ncAAs också införlivas i det värd proteomet under fasen av rekombinant genuttryck, tilldelas majoriteten av cellens resurser uttrycket av målgenen. Detta möjliggör effektiv rester-specifika inkorporering av ncAAs ofta tillsammans med höga mängder av modifierade mål. Presenterade arbetet beskrivs i vivo införlivandet av sex proline analoger i den antimikrobiella peptid nisin, en lantibiotic som produceras naturligt av Lactococcus lactis. Antimikrobiella egenskaper av nisin kan ändras och byggas under jäsning och uttryck i auxotrophic Escherichia coli stammar i definierade tillväxt medier. Därmed kan effekterna av rester-specifika byte av cAAs med ncAAs leverera förändringar i antimikrobiell aktivitet och specificitet. Antimikrobiella aktivitet analyser och fluorescensmikroskopi används för att testa den nya nisin varianter för tillväxthämning av en grampositiva Lactococcus lactis indikator stam. Massa spektroskopi används för att bekräfta ncAA inkorporering bioaktiva nisin varianter.
Upptäckten av antibiotika i det tjugonde århundradet och den parallella utvecklingen av nya antimikrobiella föreningar mot patogena mikroorganismer aktiverat riktade behandlingar av bakteriella infektioner. Dock på grund av uppkomsten av multiresistenta patogener såsom meticillinresistenta Staphylococcusaureus (MRSA), vankomycinresistenta enterokocker (VRE), MDR (multiresistenta) Salmonella typhimurium phage Skriv 10 (DT10 ), och Klebsiella pneumoniae, det är absolut nödvändigt att generera nya antimikrobiella medel1. Antimikrobiella peptider (ampere) är mångsidig, ofta mycket specifika substanser som är lovande kandidater för utveckling av nya läkemedel tack vare sina fysikalisk-kemiska egenskaper, flexibilitet, storlek, vattenavvisande egenskaper och läge för åtgärd2. Ampere är små peptider vanligtvis bestående av 7-100 aminosyror. Ofta har de en katjoniska struktur som är rik på positivt laddade arginin och lysin rester, som interagerar med riktade mikrobiell cellmembranet, som debiteras oppositely3. En särskild undergrupp av ampere är ribosomally syntetiserade och posttranslationally modifierade peptider (RiPPs)4. Dessa tillverkas av många olika organismer från riket svampar och domänen för bakterier. En av de mest kända och mest använda RiPPs är nisin, produceras naturligt av mjölksyra bakterien Lactococcus lactis (L. lactis). Aktiv mot en panel av grampositiva bakterier, nisin har använts som en biopreservative inom livsmedelsindustrin för mer än 50 år på grund av dess antimikrobiella egenskaper och avsaknad av utvecklade resistens i riktade mikrobiell stammar5. Studier har visat att nisin destabiliserar och genererar porer i bakteriell cellmembran, leder till antimikrobiell aktivitet mot både grampositiva och gramnegativa patogener6. Genom bindning till lipid II är bakteriella cellväggen syntesen hämmad7. Nisin är kodad av nisA som en linjär föregångare peptid, som består av en ledare och en core peptid region (figur 1). Efter ribosomal proteinsyntes ändras först prenisin genom dehydratase NisB. Här, är serin och treonin rester i regionen prepeptide kärna uttorkade till dehydroalanine (Dha) och dehydrobutyrine (Dhb)8. Därefter torkade rester är tillsammans med cystein till formuläret lantionin ringar (därav namnet ”lantibiotic” för lantionin ring-innehållande antibiotika) av en enzymkatalyserade Michael tillägg. Denna posttranslationell modifiering (PTM) är katalyseras av cyclase NisC. I L. lactis, den modifierade prenisin sedan transporteras ut ur cellen av transportören NisT och ledare peptiden är klyvs av proteinas NisP att släppa den mogna och aktiva nisin form9. De ansvariga ledare-hämmare NisP har en hög substrat specificitet, eftersom det endast processer modifierade nisin effektivt10.
I allmänhet resulterar aktiva RiPPs från handlingen av PTM enzymer (exempelvis NisBC), vilket drastiskt öka kemiska loppet av kort peptider, t.ex. via acetylering, glycosylation, metylering eller fosforylering. Denna nivå av komplexitet kan ytterligare utökas genom direkta införlivandet av ncAAs. Medan ofta genomförbart, är kemisk syntes ampere en utmaning för storskalig produktion på grund av deras strukturella komplexitet. Till exempel uppnåddes totala kemiska syntesen av den lantibiotic lactosin S i 71 reaktionen kliver med en slutlig avkastning på 10% och det av nisin med en rå kapacitet på endast 0,003%11,12. Därför, biologisk produktion erbjuder ett lönsamt alternativ, på grund av generationen av rätt stereocenters och hög koncentration.
Fram till idag, mer än 150 ncAAs, exempelvis att ha funktionella grupper som innehåller fluor eller azider, har införlivats i rekombinanta proteiner, och flera exempel på ncAA-modifierade ampere har varit rapporterade13,14, 15,16. Med införandet av ncAAs, kan det skapas nya fysikalisk-kemiska egenskaper jämfört med konventionella mutagenes. Mångfalden av befintliga peptider kan ökas, möjligen kan leda till nya antibiotika.
En metod för införlivandet av ncAAs i rekombinanta peptider är selektionstryck inkorporering (SPI) baserat på användning av auxotrophic bakteriestammar17. Dessa stammar är inte kan syntetisera motsvarande cAA analog av ncAA. Metoden används frekvent observerade avslappnad substrat specificitet, en funktion i många naturliga aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs)18. Bortsett från deras naturliga cAA-substrat klarar dessa enzymer ofta att erkänna och aktivera önskad ncAA och ladda det på deras besläktat tRNA(s). Detta leder till ribosomal införlivandet av ncAA i mål genen produkten på ett sätt som rester-specifika (dvs. Luftfartsverket → ncAA substitution). Detta är naturligtvis bara möjligt när önskad ncAA är strukturellt och kemiskt liknar den kanoniska aminosyran och tolereras av cellfysiologi, översättning maskiner och målet peptid eller protein sekvensen. I en viss experimentell setup odlas de auxotrophic värdcellerna i definierade medium medföljer en begränsande koncentration av infödda aminosyran ska ersättas. Den cellulära tillväxt eller utbyte av cAA-fri medium leder till intracellulär utarmning av Luftfartsverket. I nästa steg, ncAA läggs och målet genuttrycket induceras. Oundvikligen, ncAAs nu också ingår i många andra proteiner i värdcellen under denna fas av målet genuttryck. Dock toxiciteten av SPI setup hålls på en låg nivå eftersom Escherichia coli (E. coli) stammen förvandlas med en plasmid som transporterar målgenen under kontroll av en stark tillskyndare (vanligen mycket konkurrenskraftiga T7 promotorn / RNA-polymeras system)19. Omedelbart efter induktion (vanligtvis när Luftfartsverket är slut), värd celler upphöra att växa och deras cytoplasmiska enzymatisk maskinerier används främst för uttryck av plasmid-baserade målgenen. Webbplats riktad mutagenes kan användas för att definiera industriområden av rester-specifika ncAA installation i målet gen20.
Som en modell peptid för införlivandet av ncAAs valdes den gemensamma AMP nisin A. Det är 34 aminosyror lång och har bara en enda proline rester i sekvensen core peptid (figur 1). Liksom i subtilisin, ericin A och S, och epidermin såväl som i nisin Z och nisin Q verkar den bevarade prolin vara avgörande för aktivitet9,21. Den cAA prolin spelar en särskilt viktig roll i peptidyl-prolyl amide rotation och sekundärt strukturera stabilisering. Dess sidokedjan ring konformationer (exo / endo puckers) ansvarar för en termodynamisk stabilisering av Amid obligationen. Riktade kemiska modifieringar (till exempel hydroxylations, fluorinations, methylations) av prolyl puckers påverkar ofta kritiskt fällbara stabilitet, byggnadsställning styvhet och funktioner av många biologiska strukturer22. Därför är det rimligt att förvänta sig att Pro→ proline analoga substitutioner kommer förse ring B, den andra ringen av nisin, med romanen och ovanliga egenskaper.
Här, en proline-auxotrophic E. coli stam användes för rekombinant nisin produktion. Detta kräver ett uttryck för prepeptide gen nisA samt den modifiering enzym gener nisBC. Genetiskt kodade peptid produkten bär en N-terminalt hans-taggade ledare för rening via affinitetskromatografi. Aktivitet beslutsamhet, används L. lactis uttrycka och utsöndrar NisPT för att aktivera rekombinant nisin varianter från E. coli cell lysates eller renat peptid prover (figur 1). Den mogna AMP frigörs efter klyvning av ledare genom NisP. I denna agar diffusion metod, AMP provet diffunderar in i solid odlingsmedium och kan hämma tillväxten av grampositiva mikroorganism. Efter inkubation, kan detta observeras visuellt av tillväxt hämning glorior. Utöver L. lactis som indikator, modified nisin varianter visade antimikrobiell aktivitet mot Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus , Bacillus cereusoch Lactobacillus johnsonii 21,23.
En alternativ och experimentellt olika metod att införliva ncAAs i RiPPs är stop kodon suppression (SCS)24. För detta, en ortogonal tRNA / aminoacyl-tRNA Synthetasen (aaRS) par krävs för motsvarande ncAA. Helst är alla dessa tre komponenter bioorthogonal, dvs de inte interagerar med den endogena tRNAs och aaRSs. En ncAA-specifika aaRS kan genereras genom ändring av den enzym aktiva platsen och screening av genetiska bibliotek av muterade synthetases25. Införandet av en ncAA kräver dessutom en codon som tilldelas och som inte koda för Luftfartsverket. Vanligen, är den gula stop kodon används24,26.
Nyligen inrättades SPI för införlivandet av α-chloroacetamide-innehållande och klick-kemi-kompatibla ncAAs i NisA27. Till exempel införlivades Nε– alloc-lysin den lasso peptid captistruin med platsspecifika (SCS) och rester-specifika (SPI) införlivandet metoder och därefter ändrade in vitro genom rutenium-katalyseras metates28 . I jämförelse med SPI, metoden SCS är mer komplicerat eftersom en ortogonal tRNA / aaRS par måste vara co uttryckt. O-par för proline införlivandet har hittills varit utvecklade29, men till bäst av vår kunskap, inget exempel proline analoga stiftelseurkunden har rapporterats.
Det bör noteras att inte alla ncAAs kan införlivas med metoden som SPI. Först, upptaget av ncAAs in i cytoplasman är reglerad av en mängd transportproteiner som är inbäddade i cytoplasmic membranet, vilket är det inre membranet för gramnegativa bakterier som E. coli. Normalt är E. coli kan transportera ett brett utbud av aminosyra analoger in i cellen med sida kedjor strukturellt och kemiskt liknar kanoniska aminosyror. Andra, många Kemiskt reaktiva eller instabil ncAAs kan fungera som en hämmare mot cellulära tillväxt, eftersom de är giftiga för metabolism och fysiologi i mottagande cellen30. Således bör det upptag och toxicitet av ncAA för produktion värden testas i förväg. För att undvika inaktivering av PTM maskinen som en bieffekt, en strängt kontrollerade uttryck inställning av de ansvariga generna kan användas för att införliva den naturliga aminosyran i ändring enzymer (t.ex. nisBC) och ncAA i målgenen ( t.ex. nisA). Detta kan åstadkommas med två olika initiativtagare och induktion av målet genuttryck, vilket framgår i specialdesignade SPI protokoll31. Enligt ovan, bygger metoden SPI på avslappnad substrat specificiteten av de årliga verksamhetsrapporterna, vilket möjliggör ncAA aktivering och cognate tRNA laddning. Därefter levereras tRNAen till Ribosomen följt av Amid bond bildandet och vikning av mål (poly) peptiden. I denna processer, kan korrekturläsning och redigering mekanismer bli relevanta32. Av dessa skäl är det av stor vikt att ha ett mål ncAA som strukturellt och kemiskt liknar Luftfartsverket. Andra viktiga punkter är tillräcklig stabilitet (både i tillväxt medier och utsätts för cellulära metabolismen) och löslighet i ncAA. Dessutom bör man antingen kommersiellt tillgänglig eller lätt att syntetiseras kemiskt.
Här beskriver vi ett protokoll för SPI, så att rester-specifika införlivande av ncAAs i rekombinant RiPPs. Särskilt olika proline analoger införlivas i den antimikrobiella peptid nisin A med E. coli som värdorganism. Masspektrometri används för att verifiera aminosyra ersättning och peptid produkter analyseras för bioaktivitet använder tillväxt hämning analyser och fluorescensmikroskopi använder mikrobiell indikator stammar.
Grundkravet för framgångsrika rekombinant nisin uttryck med definierade ncAAs kräver en lämplig proline auxotrophic E. coli -stam. För detta auxotrophy, proA måste vara dysfunktionella, exempelvis uppnås genom genomisk knockout. Celler helt berövas intracellulära Pro biosyntes (dvs borttagande av proABC) utan möjligheten för återgång är stabila auxotrophs. Utbredda gen knockout metoder är phage transduktion eller singel-gen knockout enligt Datsenko & Wanner33. ProA knockout stammar kan dessutom erhållas från offentliga databaser såsom Addgene, CGSC eller samlingen Keio. Eftersom uttrycket rekombinant nisABC som visas här är beroende av användningen av T7 initiativtagare, har uttryck värd stammen att bära en inducerbara genen för T7 RNA-polymeras. Detta kan uppnås genom införandet av den λDE3 profagen i värd genomet, till exempel hjälp av kommersiella kit. Alternativt, stammar såsom BL21(DE3) kan göras auxotrophic som beskrivs ovan.
Genom att använda SPI för införande av prolin analoger, kan riktade nisin strukturer väsentligen ändras, skapa nya peptid varianter med unik teckensekvens kombinationer och kemiska egenskaper. På detta sätt kan grundläggande gränsen av klassiskt gentekniken kringgås, som begränsas till de side chain kemiska sammansättningar av de 20 cAAs. In vivo kemiska diversifiering av nisin som exemplifieras ovan visar en allmän riktlinje att komplettera naturliga PTMs och dramatiskt förbättra det kemiska utrymmet av RiPPs. Vi tror att utöka repertoaren av de naturliga aminosyrorna innehar stort löfte särskilt för ampere. I proteiner, kan ett enormt utbud av funktioner realiseras genom en definierad arrangemang av de 20 cAAs i tredimensionella strukturer. Med bara 7-100 aa i längd3, skulle sätt att uppnå sådana strukturella funktioner endast genom cAAs begränsas för ampere. Det är således inte förvånande att naturliga förstärkare i form av RiPPs är vanligen i stor utsträckning post-translationally modifierade4. På samma sätt håller ncAAs som alternativa byggstenar stort löfte att förbättra deras farmakodynamiska och farmakokinetiska parametrar (se Baumann et al. 201735 och referenser däri).
Den SPI-metod som använts i detta arbete fördelarna från en relativt lätt experiment, okomplicerad utförande och hög reproducerbarhet. På grund av globala substitution är multisite ncAA införlivande i målet peptider också möjligt. Däremot, kan metoden inte vara tillräcklig för byte av aminosyror som ofta uppstår i mål genen produkten. I princip, oönskad positioner kan ändras av webbplats riktad mutagenes, men dessa ytterligare ändringar kan också påverka flera AMP egenskaper inklusive struktur och bioaktivitet. När en auxotrophic stam för produktion är tillgänglig, kan flera ncAAs testas utan att kräva omfattande förändringar på genetisk nivå. Metoden är inte heller begränsad till auxotrophic E. coli stammar, men kan även utföras med naturliga produktion värden. Zhou et al. visade till exempel att SPI för produktion av romanen RiPPs fungerar även den naturligt Trp-auxotroph L. lactis: med hjälp av fastställda media, tre tryptofan analoger införlivades på fyra positioner i nisin50.
Eftersom metoden SPI leder till globala ersättare valda cAA av ncAA, det gäller generellt för ett brett spektrum av mål peptider och proteiner. Ett utbud av auxotrophic E. coli stammar är tillgängliga (se steg 1), vilket gör att flera cAAs varje testas för byte av ncAAs. Träffade analoger införlivas med metA-bristfällig stammar (t.ex. B834(DE3)) är oftast anställda. Exempel på isostructural Met analoger är azidohomoalanine (Aha) och homopropargylglycine (Hpg), kommersiellt tillgängliga ncAAs som effektivt kan införlivas. Både införa bioorthogonal handtag som tillåter fastsättning av molekyler som bär kompatibel alkynen eller natriumazid funktionalitet, respektive. Till exempel fluorescerande färgämnen eller polyetylenglykol (PEG) delarna kan fästas av koppar (I)-katalyseras natriumazid alkynen cykloadditionen (CuAAC)51.
Även om båda rekombinant ncAA inkorporering metoder (SPI och SCS) brukar uppnå tillräckliga mål mängder, avkastningen är ofta reduceras i förhållande till vildtyp produktionen av motsvarande peptider och proteiner. Som föroreningar ofta korrelerar med produktionseffektivitet, kan ytterligare reningssteg krävas, särskilt för låg-rikliga arter. I detta fall av rekombinant nisin produktion förenklar hans-taggade ledare sekvensen RiPP rening av selektiv anrikning från den cell lysates. Den rening som visas i detta protokoll förbättrar renhet och koncentration av nisin, men ofta ger inte AMP med tillräcklig för att fastställa avkastningen och specifik aktivitet. Vanligen används AMP reningsmetoder ingår förutom IMAC, HPLC, jonbyteskromatografi (IEC) och nederbörd (e.g.. med aceton eller triklorättiksyra (TCA)) eller kombinationer av dessa – vilket resulterar i ett utgångsämnet rening system52 . Det bör noteras att deras vanligen polycationic natur kan underlätta IEC rening. Frystorkning är ofta används för att lagra renat ampere.
Helst ncAAs för iblandning i ampere ska vara kommersiellt tillgänglig till överkomliga priser eller produceras enkelt av enkla och reproducerbara kemisk syntes protokoll. En lika viktig förutsättning för SPI-metoden är att ncAA är erkända, aktiveras och debiteras på den cognate tRNAen av de årliga verksamhetsrapporterna endogen eller samtidig uttryckt. Detta kan vara testade i vitro av aminosyra som aktivering eller tRNA aminoacylation assay53. Som ett lätt alternativ, SPI test uttryck av modell proteiner såsom grönt fluorescerande protein (GFP) bedrivs både i närvaro och i frånvaro av ncAA tillskott kan utföras. Dessutom löslighet i den tillväxt medium och cell permeabilitet samt kemisk stabilitet utgör viktiga faktorer.
I det här exemplet visades antimikrobiell aktivitet använder en grampositiva indikator stam. Som det uttrycker den leader-hämmare NisP, catalyzeds det sista steget av nisin mognad. Borttagning av sekvensen ledare (hans-märkta för rening ändamål) kan också vara utförda i vitro genom behandling med renat NisP50 eller trypsin54. Utanför ramen för detta arbete, patogena organismer och multiläkemedels resistenta stammar kan sedan testas för bakteriostatiska eller bakteriedödande hämning av AMPs använder en liknande metod. Kliniskt relevanta målarter inkluderar MRSA, MDR Mycobacterium tuberculosis, VRE, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa och Klebsiella pneumoniae. Förutom agar plattan diffusion assay presenteras här, tillväxt hämning kan också utföras med lämpliga flytande media inokuleras med bakteriearter och kompletteras med AMP. Med buljong utspädning metoder, kan den minsta hämmande koncentrationen (MIC) bestämmas med pure peptider55. Aktivitet analysen presenteras här kan också användas för att uppskatta bioaktivitet och styrkan av AMP-innehållande lösningar i förhållande till referens föreningar, till exempel kommersiellt tillgängliga nisin.
Rekombinant produktionen av RiPPs är ofta genomförbart39, som vanligen omfattar samtidig uttryck av PTM gener. Så snart produktionen stammen övergår i ett kemiskt definierade eller syntetiska minimal medium innehållande ett passande ncAA, sker rester-specifika byte av motsvarande Luftfartsverket. Således kan andra RiPPs produceras av samma metod, förutsatt att deras rekombinanta produktion är genomförbart och villkor kan hittas där ncAA införlivandet och PTM ge tillräckliga mängder målet produkt. Observera att förutom det mottagande cellen proteomet, peptid PTM maskiner kan också bli ncAA-modifierade under SPI. Tidpunkten för målet uttryck induktion och längden på följande inkubationstiden kan följaktligen kräver optimering. Eftersom ncAA införlivande PTM enzymer kan påverka deras stabilitet och verksamhet, kan produktion av den bearbetade RiPP i princip påverkas. Tillräcklig PTM enzym effekt indikeras av bildandet av bearbetade prepeptide, som upptäckts av MS och bioaktivitet analyser. Som infördes ovan, olika inducerbara initiativtagare kan användas för att producera PTM gener först (i frånvaro av ncAA) följt av induktion av föregångare peptid genen i närvaro av ncAA. I allmänhet måste produktionen av cAA-innehållande mål peptid undertryckas före tillsats av ncAA, varför snäva förtryck av föregångare genen är nödvändiga. Inom detta protokoll uppnås detta genom katabola förtryck genom tillsats av glukos till odlingsmedium. Särskilt eftersom de PTM enzymer som krävs för prepeptide bearbetning härstammar oftast från en genetiskt avlägsen värd, kan uttryck temperatur och kodon användning av motsvarande gener kräva optimering om rekombinant produktion har ännu inte etablerade. I princip, kan förekomsten av ncAAs i prepeptide störa erkännande och bearbetning av PTM enzymer, när det gäller nisin NisBC och NisP. För ncAA iblandning i ampere rekommenderas det således att utföra småskaliga uttryck experiment först för att identifiera lämpliga uttryck villkor och tillförlitlighet av AMP verksamhet analysen.
The authors have nothing to disclose.
J.H.N., T.B. och M.B. godkänner finansieringen av programmet EU FW7 (SYNPEPTIDE). F.-J.S. och T.F. godkänner finansieringen av det federala ministeriet för utbildning och vetenskap (BMBF Program ”HSP 2020”, TU-WIMIplus projekt SynTUBio) och den tyska forskningsfondens (Cluster of Excellence ”Unifying begrepp i katalys”).
sodium chloride | Carl Roth, Germany | P029 | |
guanidine hydrochloride | Carl Roth, Germany | 0035.2 | |
dipotassium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P749.3 | |
potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | 3904.3 | |
sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth, Germany | K300.2 | |
disodium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P030.2 | |
L-alanine | Carl Roth, Germany | 3076.2 | |
L-arginine | Carl Roth, Germany | 3144.3 | |
L-asparagine monohydrate | Carl Roth, Germany | HN23.1 | |
L-aspartic acid | Carl Roth, Germany | T202.1 | |
L-cysteine | Carl Roth, Germany | 3467.3 | |
L-glutamine | Carl Roth, Germany | 3772.1 | |
L-glutamic acid | Carl Roth, Germany | 3774.1 | |
L-glycine | Carl Roth, Germany | 3187.3 | |
L-histidine | Carl Roth, Germany | 3852.3 | |
L-isoleucine | Carl Roth, Germany | 3922.3 | |
L-leucine | Carl Roth, Germany | 3984.3 | |
L-lysine monohydrate | Carl Roth, Germany | 4207.2 | |
L-methionine | Carl Roth, Germany | 9359.4 | |
L-phenylalanine | Carl Roth, Germany | 4491.2 | |
L-proline | Carl Roth, Germany | T205.3 | |
L-serine | Carl Roth, Germany | 4682.4 | |
L-threonine | Carl Roth, Germany | T206.2 | |
L-tryptophan | Carl Roth, Germany | 4858.2 | |
L-tyrosine | Carl Roth, Germany | T207.2 | |
L-valine | Carl Roth, Germany | 4879.4 | |
ammonium sulfate | Carl Roth, Germany | 3746.3 | |
magnesium sulfate | Carl Roth, Germany | 0261.2 | |
D-glucose | Carl Roth, Germany | 6780 | prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar |
calcium chloride | Carl Roth, Germany | PN93.2 | |
iron(II) chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 372870 | |
thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Germany | T1270 | |
biotin | Carl Roth, Germany | 3822.2 | |
copper(II) sulfate | Merck, Germany | 102792 | |
manganese(II) chloride | Carl Roth, Germany | KK36.2 | |
zinc chloride | Merck, Germany | 108816 | |
immonium orthomolybdate | Sigma-Aldrich, Germany | 277908 | |
glycerol | Carl Roth, Germany | 7533.3 | |
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich, Germany | I6758 | |
ampicillin sodium salt | Carl Roth, Germany | K029.5 | working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O |
kanamycin sulfate | Carl Roth, Germany | T832.2 | working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O |
chloramphenicol | Carl Roth, Germany | 3886.1 | working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol |
(4S)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3970 | |
(4R)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3975 | |
(4S)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-1395 | |
(4R)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-2980 | |
(4S)-methanoproline | chemically synthesized | ||
(4R)-methanoproline | chemically synthesized | ||
hydrochloric acid (HCl) | Carl Roth, Germany | P074.4 | |
ethanol | VWR, Germany | 20825.324 | |
M17-broth | Sigmal-Aldrich, Germany | 56156 | commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation |
agar-agar | Carl Roth, Germany | 5210.5 | |
Nisin from Lactococcus lactis | Sigma-Aldrich, Germany | N5764 | commercial product, can be used as reference for bioactivity |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Carl Roth, Germany | A994.1 | |
imidazole | Carl Roth, Germany | 3899.3 | |
1.5 mL autosampler vial for LC-MS | Sigma-Aldrich, Germany | Supelco 854165 | |
acetonitrile | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
formic acid | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude | GE Healthcare, UK | 29-0486-31 | different manufacturers and resins available for IMAC |
0.45 µm bottle top filter unit | VWR, Germany | 10040-470 | sterile filtration of solutions using a vacuum pump |
0.45 µm syringe filter PVDF membrane | Carl Roth, Germany | CCY1.1 | sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates |
luer-lock syringe, PP, 50 ml | Carl Roth, Germany | T552.2 | sterile filtration of solutions |
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 | |
petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth, Germany | TA19 | |
Nile red | Sigma-Aldrich, Germany | 72485 | |
E. coli ΔproA strain | CGSC, Keio collection | JW0233-2 | proline-auxotrophic E. coli K-12 strain |
E. coli B834(DE3) | Novagen (Merck), Germany | 69041 | methionine-auxotrophic E. coli B strain |
λDE3 Lysogenization Kit | Novagen (Merck), Germany | 69734-3 | |
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT | bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890 | ||
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 5427 R | |
peristaltic pump | GE Healthcare, UK | P1 | |
FPLC system | GE Healthcare, UK | Äkta Purifier 10 or the like | |
inverted microscope | Nikon | TI Eclipse wide-field fluorescence microscope with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp | example setup for fluorescence microscopy |
electron multiplying CCD (EMCCD) camera | Andor Technologies, UK | Andor Luca | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence excitation filter | Thorlabs, USA | Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence emission filter | AHF Analysentechnik, Germany | T 560 LPXR | example setup for fluorescence microscopy |
cover slip 24 x 60 mm | Carl Roth, Germany | LH26.1 | example setup for fluorescence microscopy |
Immersion Oil | Carl Zeiss, Germany | Immersol 518 F | example setup for fluorescence microscopy |
probe sonicator | Bandelin, Germany | Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 | 200 W maximum HF output |
C5 HPLC column (2.1×100 mm, 3 µm particle size) | Sigma-Aldrich, Germany | 567227-U | example setup for mass spectrometry |
ESI-TOF coupled to HPLC system | Agilent, USA | Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC | example setup for mass spectrometry |