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방법 논문

주변에 Neuroregeneration 중앙 신 경계를 연구 하 고 대 한 Vivo에서 초파리 부상 모델

9.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/57557

⸱

2018년 5월 5일

 ,  ,  , 
1Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 우리로 초파리 감각 신경- vivo에서 결합 하는 수지상 arborization (다) 신경 부상 모델, 라이브 영상, 2 광자 레이저 axotomy/dendriotomy, 그리고 강력한 비행 유전 도구 상자, 를 사용 하 여 프로토콜을 제시 잠재적인 발기인 및 neuroregeneration의 억제제 상영을 위한 플랫폼.

초록

손상 된 신경의 재 성장을 용량 신 경계 외상 후 neuroregeneration 및 복구 기능을 제어합니다. 지난 몇 년간 다양 한 내부 및 외부 억제 요인 축 삭 재생의 제한에 관련 된 발견 되었습니다. 그러나,이 금지 신호를 단순히 제거 추가 규제의 존재를 나타내는 성공적인 재생에 대 한 충분 하지 않습니다. 초파리 melanogaster, 과일 파리, 척추 동물, 인간을 포함 한와 진화론 보존된 유전자와 신호 경로 공유 합니다. 파리의 강력한 유전자 도구 상자를 결합 하 여 두 광자 레이저 axotomy/dendriotomy와 함께, 우리는 설명 여기 초파리 감각 신경-체계적으로 소설에 대 한 심사를 위한 플랫폼으로 수지상 arborization (다) 신경 상해 모델 재생 레 귤 레이 터. 간단히,이 패러다임) dendrite(s) 또는 axon(s) 2 광자 레이저, c) 라이브 confocal 영상 포스트 상해 및 d) 데이터 분석을 사용 하 여 애벌레, b) 병 변 유도의 준비를 포함 한다. 우리의 모델에는 단일 레이블된 뉴런, 축 삭, 및 주변 및 중앙 신경 시스템에의 잘 정의 된 신경 하위의 dendrites의 높은 재현성 부상 수 있습니다.

서론

후 중앙 신경 시스템 (CNS)에 부상 환자, 영구 장애 발생할 수 있습니다 및 또한 신경 퇴행 성 질환1,2에에서 돌이킬 수 없는 신경학 상 적자에 역할을 다시 생성 하는 축 삭의 무 능력 ,3,,45. CNS 환경 뿐만 아니라 본질적인 성장 능력 뉴런의 축 삭 외상 후 재생성 수 있습니다 여부를 결정 합니다. 세포 외 요인 oligodendrocyte, astroglial, 및 fibroblastic 소스에서 신경 성장4,6,7,8, 하지만 이러한 분자의 제거를 방해 하 보였다 만 제한5돋 아 수 있습니다. 본질적인 재생 신호 재생 성공5,9 에 영향을 미칠 수 있습니다 잠재적인 치료 목표를 대표 하지만 이러한 프로세스는 분자 수준에서 아직도 분명 하지. 영양 요소 신호 또는10Pten 인산 가수분해 효소 등 생 브레이크의 제거 증가 axonal 재생 특정 상황에서 발생할 수 있습니다. 개별적으로 효과적인 것으로 발견 하는 다른 방법의 조합 또한만11,12,,1314날짜 제한 전체 복구를 제공 합니다. 따라서, 타겟된 치료에 대 한 추가 경로 식별 하는 절망적 인 필요가 있다. 뿐만 아니라 자라나는 축 삭의 개시 여부와 축 삭 다시 올바른 대상, 개혁 시 냅 스 특이성, 와이어 및 달성 하는 방법 기능 복구 중요 한 의문점이 있습니다.

요약에서 기계 지시 된 축 삭 재생의 현재 이해는 매우 단편적인 여전히. 문제의 일부는 축 삭의 기술적인 어려움 포유류 실시간 재생, 소모, 비용과 수행 대규모 유전 스크린에 도전 하는 방식. 초파리 melanogaster, 다른 한편으로, 복잡 한 생물 학적 질문의 연구에 대 한 매우 강력한 시스템을 입증 했다. 과일 파리 유전자를 정의 하 고 신호 통로 기 막히게 인간에서 보존 하는 수단이 되었으며 인간의 조건, 광대 한 분자 유전학 도구를 통해 신경 퇴행 성 질환 등의 연구에 대 한 성공적인 모델 되었습니다. 유전자 기능15조작에 사용할 수 있습니다. 특히, 초파리 신경 상해 및 자라나15,16에 관련 된 유전자의 발견에 대 한 이상적인 도구가 될 여겨진다. 성인 머리 또는 애벌레 복 부 신경 코드 (VNC) 찌르는 바늘, 애벌레 VNC 또는 집게, 애벌레 신경 레이저 axotomy, 후 각 수용 체 신경 제거, 뇌 explants 부상, 신경 호감을 포함 한 몇 가지 비행 신경 상해 모델 개발 되었습니다. 그리고 날개 퇴직금15,17,18,19,20,21,,2223여 주변 신경 병 변. 최근 작품 활용 초파리 부상 모델 excitingly, 세포와 유전자 경로 일부는 포유류24에에서 보존 될 표시 되었습니다 신경 부상에 대응 하는 신 경계에 의해 사용에 대 한 우리의 이해 고급 ,25. 다시,이 신경 선의 소설 메커니즘을 식별에 대 한이 모델 생물의 유틸리티를 강조 한다.

여기에 설명 된 2-광자 초파리 애벌레 감각 신경 상해 레이저 기반 모델이 이다. 두 광자 레이저 zebrafish에서 vivo에서 200326에 축 삭을 처음 사용 되었다. 같은 해, 첫 번째 레이저 dendriotomy 초파리 27펄스 질소 레이저 사용 하 여 수행 했습니다. 잠시 후, 여러 선 충 C. 실험실 축 삭 재생28의 모델을 확립 펨 레이저를 사용 합니다. 2007 년, 우 동료 비교 및 선 충 C. 레이저29의 다양 한 종류에 의해 유도 된에서 레이저 부상 간의 차이점을 보고. 2010 년에 축 삭 재생 레이저 axotomy 후 처음 초파리30에 표시 했다. 이 광범위 한 레이저 부상 문학에 건물, 우리는 개발 조직 이웃의 최소한의 섭 동으로 대상된 사이트에 상해의 정확한 유도 허용, 2-광자 레이저를 사용 하 여 비행 신경 상해 모델 상대적으로 깨끗 한 제공 단일 셀 해상도와 neuroregeneration의 기본 및 외부 속성을 공부 하는 시스템. 특히, 우리 모두는 말 초 신 경계 (PNS)에서 수지상 arborization (다) 감각 신경에 대 한 부상 메서드의 집합 설정한 및 CNS. 다 신경 그들의 모 수석 분기 복잡성에 의해 주로 구별 4 가지 종류로 분류 될 수 있다: 431종류 I. 우리의 출판된 일 다 신경 재생 phenotypic 및 분자 수준에서 포유류 부상 모델 유사한 보여준다: 다 신경 클래스 4와 클래스 특정 재생 속성을 표시 하지만 나 III 다 신경 재생을 전시 하지 클래스는 PNS; 클래스 4 다 신경 축 삭 주변에 견고 하 게 다시 생성 하지만 그들의 재생 잠재력은 따라서 닮은 포유류; 지 루트 신경 절 (DRG) 신경, CNS에서 극적으로 감소 Pten 통해 mTOR 활동 강화 삭제 또는 Akt overexpression 비행19CNS 축 삭 재생 향상. 이 부상 모델을 활용 하 여 우리 유전 스크린을 수행 되 고 있다 식별 RNA 가공 효소 Rtca 축 삭 재생을 위한 진화론 보존된 억제 요인으로 세포 스트레스 및 RNA 수정20 축 삭 상해를 연결 .

제시 패러다임에서 부상 애벌레 클래스 IV 또는 III 다 신경, ppk 권총-CD4-tdGFP 또는 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80에 의해 표시 된 각각의 레이저 axotomy/dendriotomy를 통해 유도 된다. 부상 (h AEL) 누워 계란 후 약 48-72 h에 3rd 탈피 애벌레를 2nd 에 수행 됩니다. PNS에 대 한 axotomy 병 변 세포 체, CNS axotomy ~ 20 µ m 직경, VNC에 commissure에의 지역 및 기본 수지상 브랜치 포인트에 dendriotomy에서 축 삭 ~ 20-50 µ m의 섹션 타겟팅 됩니다. 같은 신경은 부상 (AI) 완전 한 transection, 확인 후 8-24 h 고 48-72 h 재생을 평가 하기 위해 AI에서 몇 군데. 시간 경과 confocal 영상 통해 변성 및 부상 vivo에서 개별 axons/dendrites의 재생 시간이 지남에 모니터링할 수 있습니다.

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프로토콜

1입니다. 문화 접시와 병의 준비

  1. 포도 주스 한 천 배지 준비
    1. 비 커와 일시적으로 agar 완전히 녹아 때까지 저 어 약 4-5 분 동안 전자 레인지에 한 천 분말, 200ml 포도 주스와 192 mL ddH2O 10 g를 추가 합니다.
    2. 약 60 ° c 솔루션 진정 연기 후드, 4.2 mL 95% 에탄올과 4.0 mL 빙 초 산을 추가 합니다. 잘 ddH2오 믹스 400 mL에 솔루션의 전체 볼륨을 조정 합니다.
    3. 각 35 m m 플레이트에 대 한 솔루션의 약 2-3 mL를 추가 합니다. 400 mL 포도 주스 한 천 해결책의 총 약 120-150 번호판을 확인 합니다.
    4. 진정 하 판이 고 공고히 한 솔루션 10 분 기다립니다. 한 천 배지 각자 밀봉된 애 가방에 포도 주스를 포장 하 고 나중에 사용할 4 ° C에서 저장.
  2. Drosophila 문화 병의 준비
    1. 블레이드를 사용 하 여 초파리 문화 병의 1 개의 벽에 1.5 c m 측면 길이 삼각 구멍 펀치와 환기에 대 한 면의 2-2.5 cm 직경 공 구멍을 채우십시오.
    2. 효 모 반죽의 0.5 c m3 에 대 한 보충 포도 주스 한 천 배지와 병을 연결 합니다.

2입니다. 초파리 애벌레의 수집

  1. 성인 파리의 십자가를 설정합니다
    1. 장소 10 처녀 암컷과 5 남성 성인 문화 병 포도 주스 한 천 배지와 연결에 함께 난다.
    2. 병 바닥까지 25 ° C에서 되도록 놓습니다 포도 주스 한 접시에 알을 낳는 것 이다 파리. 하루에 적어도 한 번 효 모 반죽과 접시를 변경 합니다. 균질 성 발달 단계의 애벌레의 수확을 허용, 2-h 컬렉션 기간에 대 한 20 개 이상의 처녀 여성 및 10 남성 2.1.1 단계에서 시작 합니다.
    3. 0.5% 프로 산 성 솔루션에 배어와 젖은 조직, 예를 들어 60 mm 페 트리 접시에 25 ° C에서 격판덮개 문화. 산소 흐름을 차단 하지 않습니다 있도록 조직 정렬.
      참고: 프로 산 솔루션 접시에 습도 유지 하 고 곰 팡이의 성장을 피하기 위해 사용 됩니다.
  2. 특정 나이의 애벌레를 수확
    1. 효 모 반죽 없이 새로운 포도 주스 한 접시에 원하는 단계, 예를 들어 2nd 3rd 탈피 애벌레 (AEL) 누워 계란 후 48-72 h에 애벌레를 전송 집게의 쌍을 사용 합니다.
    2. 누 룩에서에서 제거 애벌레의 피부 하 여 레이저 axotomy 및 이미징 효 잠재적인 방해에서 방지 하기 위해 새로운 접시에 주변 탐색 합니다. 또는, PBS의 접시에 그들을 세척 하 고 티슈 페이퍼의 조각에 잠시 건조 하 여 애벌레 청소 철저 하 게.

3. 2-광자 부상과 Confocal 영상

  1. 현미경 설치
    참고: 두 광자 레이저 스캔 현미경 confocal 레이저는이 실험을 위해 사용 되었다 하지만 해당 설치 다른 시스템도 충분 합니다. 두 광자 레이저 (930 nm) 부상과 아르곤 레이저를 전달 하기 위해 사용 되었다 (488 nm) GFP의 confocal 영상을 위해 사용 되었다.
    1. 각 세션의 시작 부분에서 2 광자 레이저 / confocal laser(s)와 현미경 설정. 이미징 소프트웨어를 엽니다.
    2. 930에서 2 광자 레이저 GFP를 이미징에 대 한 다음 매개 변수를 설정 하는 2 광자 부상, nm (1950 mW).
      1. 라인 스캔 모드를 선택 합니다. 줄곧 pinhole을 엽니다. ~ 20%에 레이저 강도 증가 (390 mW).
      2. 프레임 스캔으로 512 x 512를 선택 합니다. 최대 스캐닝 속도 (일반적으로 0.77 µs에 픽셀 유지 시간)를 사용 합니다. 평균 수는 1 비트 깊이 8 비트 확인 합니다.
      3. 하 ~ 750, 고 0 오프셋 설정된 얻을.
      4. 2 P GFP 930 제거를 쉽게 허용으로 실험 프로토콜 재사용 미래에이 사전 설정 저장 실험.
    3. 488에 아르곤 레이저 GFP를 이미징에 대 한 다음 매개 변수를 설정 하는 confocal 영상, 대 한 뉴 멕시코:
      1. 인수 탭 그리고 Z-스택을 선택 합니다.
      2. "레이저"에서 488 nm의 아르곤 레이저의 전원을 켭니다.
      3. 채널선택 488 m m 레이저, 레이저 파워 5-10%를 증가 이동 합니다. Pinhole에 대 한 1-2 공기 단위 (AU)를 사용 합니다. 650에 이득을 조정 합니다.
      4. 획득 모드에서 프레임 스캔으로 1024 x 1024를 선택, 최대 검색 속도, 2의 평균 수 8 비트의 비트 심도 사용 하 여.
      5. GFP 이미징이 미리 설정된 실험 프로토콜을 저장 합니다.
  2. 애벌레 마 취 diethyl 에테르와 장착
    1. 증기 두건에서 15 cm 플라스틱 페 트리 접시에에서 60-m m 유리 접시를 놓습니다. 배 고 누워 유리 접시의 바닥에 휴지 조각 다음 조직에 포도 주스 한 접시를 놓습니다. 유리 그릇에 휴지가 젖 었는 접시에 남아 있는 액체 에테르의 레이어는 포인트 diethyl 에테르를 추가 합니다. 항상 뚜껑을 유지.
    2. 준비 halocarbon의 한 방울을 유리 슬라이드 중앙에 27 오일. 4 관광 명소는 coverslip 지원 슬라이드의 네 모퉁이에 진공 그리스의 추가 합니다.
    3. 집게를 사용 하 여 청소 유 충 데리 러와 60 m m 유리 접시에 한 접시에 그것을 배치. 유리 접시의 뚜껑을 커버 하 고 유 충 이동 중지 될 때까지 기다립니다. PNS 부상/이미징, 유 충을 꺼내 꼬리 중지 꿈 틀 자 마자. CNS에 대 한 전체 애벌레 움직이지 않는, 될 때까지 기다릴 특히 머리 세그먼트.
      참고: 에테르 노출의 타이밍은 중요 합니다. 토론을 참조 하십시오.
    4. 신중 하 게 마 취 유 충을 선택 하 고 슬라이드에 halocarbon 오일 방울 머리 똑바로 장소. 슬라이드 위에 coverslip을 추가 합니다. 부드러운 압력을 사용 하 여 때까지 유 충 (그림 1A)를만 지는 coverslip에 밀어.
    5. 그는 신경/축 삭/모 수석의 현미경 렌즈에 가까운 위쪽에 왼쪽 이나 오른쪽, 애벌레를 향해 coverslip을 부드럽게 눌러 유 충의 위치를 조정 합니다.
    6. 모두는 tracheas 표시 되도록 PNS 부상, 유 충 등 사이드를 탑재 합니다. 다음 클래스 III 다 신경 축 삭 (그림 1B 및 1 C), 클래스 4 다 신경 축 삭 (그림 1B , 1E), 부상에 대 한 90도 또는 ~ 30 클래스 IV 다 신경 모 수석 (부상도 부상에 대 한 왼쪽 유 충 ~ 30도 롤 그림 2A)입니다.
    7. CNS 상해에 대 한 관심의 영역이 z-평면에서 현미경 렌즈에 가장 가까운 되도록 완벽 하 게 복 부 쪽 (그림 3A), 수 유 충을 놓습니다.
  3. 두 광자 레이저에 의해 부상
    1. 현미경 애벌레와 슬라이드를 놓고 무대에서 슬라이드 홀더를 가진 장소에서 안전 합니다. 유 충을 찾을 수 (0.3 없음) X 10 사용 하 여 목적.
    2. coverslip에 객관적인 오일 1 방울을 추가, (1.3 없음) X 40으로 전환 목표는 초점을 조정 하 고.
    3. 스캔 모드를 전환 하 고 실험 프로토콜 2 P GFP 930 절제를 다시 사용 합니다. Pinhole 줄곧 열 다는 것을 확인 하십시오.
      참고: 구성 해야 최적화 개별 시스템에 기반으로 합니다.
    4. (ROI), 관심 영역을 찾으려고 라이브 모드를 시작 하 고 적절 한 확대와 좋은 이미지 품질을 달성 하기 위해 설정을 세부적으로 조정할.
      참고:이 단계의 목적은 최고의 품질의 이미지를 복용 하는 것 보다는 신경/축 삭/모 수석, 다치게 하 찾는 것입니다. 따라서, 최소한의 설정 대상 영역을 시각화 하기 위해 충분 한를 사용 하 여 노출 과도 또는 photobleaching를 피하기 위하여.
    5. 자르기 단추를 사용할 수 있게 됩니다 있도록 라이브 검색을 중지 합니다. 스틸 이미지는 로드맵 역할을 하자. 자르기 기능을 선택 하 고 스캔 창 부상 될 대상에 초점을 조정 합니다.
    6. 상해의 예비 사이트의 크기를 투자 수익을 줄일 수 있습니다. 예를 들어 그냥 축 삭 또는 상해의 정밀도 보장 하 고 주변 조직에 손상을 줄일 수 있는 모 수석의 폭을 커버. 필요한 경우 확대 투자 수익에 자르기 전에 더 정확한 부상에 대 한 허용 합니다.
    7. 새로운 이미징 창을 엽니다. 스캔 속도 감소 시키고 레이저 강도 증가 한다. 라이브 모드에서 스캔 조직 형광 신호에 따라 레이저 강도 증가 결정 합니다.
    8. 일반적으로, PNS 부상에 대 한 25% 및 VNC 부상에 대 한 50-100%에서 시작 하는 2 광자 레이저 강도 설정 합니다. PNS 축 삭 상해에 대 한 레이저 강도 ~ 480 mW 및 픽셀 인지 확인 유지 시간 8.19 μ s 이다. VNC 축 삭 상해에 대 한 레이저의 강도 및 픽셀 유지 시간은 일반적으로 965-1930 년 mW 8.19 32.77 µs, 각각 확인 합니다.
    9. 연속 스캔을 시작 합니다. 연속 단추를 가리키면 커서를 둡니다. 이미지에 주의깊게 감시 하 고 형광에 있는 급격 한 증가 관찰 하자마자 검사를 중지 합니다.
      참고: 형광 스파이크의 모양을 부상 사이트에 자동 형광 때문 이다.
    10. 설정을 다시 사용 하 여 라이브 모드로 다시 전환 합니다. 그냥 초점을 조정 하 여 대상 관심 영역을 찾아.
      참고: 성공적인 상해의 좋은 표시는 작은 분화구, 고리 모양의 구조, 또는 부상 사이트에서 지역화 된 파편의 외관 이다.
    11. 다음 뉴런에 이동 하 고 반복 단계 3.3.5, 하나의 동물에 여러 신경 손상에서. 또는 점차적으로 증가 하는 힘 및 초기 부상 충분 하지 않은 경우 검사 속도 줄이는 동안 3.3.5 단계를 반복 합니다.
      참고: 경우에는 레이저 파워는 너무 높은, 큰 손상된 영역 표시 됩니다 후 부상 라이브 스캔 이미지에. 너무 많은 부상 유 충의 죽음을 일으킬 수 있습니다.
    12. 신중 하 게 제거 하는 coverslip 고 부상된 유 충 효 모 반죽과 새로운 접시에 전송 유 충을 복구 합니다. 집게;와 한 접시에 여러 동굴을도 랑 또는, 전체 접시 접시 밖으로 크롤 링 하는 유 충의 가능성을 줄이기 위해 사용 하는 대신 접시에 한 천의 섬을 확인 합니다.
    13. 젖은 조직 (0.5% 프로 산 솔루션 젖 었)와 문화 실내 온도 또는 25 ° C에서 60 mm 페 트리 접시에 접시를 넣어
      참고: 유 충 약 25 ° c.에에 비해 실 온 (22 ° C)에서 추가 일에 대 한 애벌레 단계에 유지 됩니다.
  4. 이후 부상 confocal 영상
    1. 이미지 마 취와 다음 confocal 레이저 이미징 단계 3.2에서 장착의 동일한 절차를 사용 하 여 유 충을 준비 하 여 원하는 시간 지점에서 부상된 유 충.
      참고: 이미지 확인 axonal 상해 상해 (AI) 후 24 시간 및 48 h AI (클래스 4 다 신경) 또는 72 h 재생을 평가 하기 위해 AI (클래스 III 다 신경) 유 충.
    2. 10 X 목표를 사용 하 여 유 충을 찾아 (0.8 없음) X 25로 전환 후 목표. GFP 이미징실험 프로토콜을 다시 사용 합니다.
    3. 라이브 버튼을 클릭 하 고 이전 부상 같은 뉴런을 찾을.
    4. 라이브 검색 창에서 첫 번째 및 마지막 Z 위치를 설정 합니다. 중지를 Z 스택 이미지를 얻으려고 시작 실험 을 클릭 합니다.
      참고: 재생의 정량화가 가능한 이미지를 캡처할 때 정규화 지점 (축 삭 수렴 지점) 포함 되어 있는지 확인 (그림 1D, 1 층)-이 설명 데이터 분석 섹션에서 추가.
    5. 전환 이미지 처리하, 촬영, 이미지를 선택 하 고 최대 강도 투영을 생성. Z-스택 및 최대 강도 프로젝션 이미지를 저장 합니다.

4. 데이터 분석

  1. 처리 하 고 이미징 소프트웨어 또는 ImageJ를 사용 하 여 이미지를 계량.
  2. PNS에서 축 삭 재생의 정량화
    1. 재생 비율, lesioned 했다 모든 axons 중 축 삭 재생의 %는 계산 합니다. 으로 부상 사이트 넘어 regrows 재생성으로 축 삭을 점수.
    2. 측정 재생 길이, 축 삭 길이 증가입니다. ImageJ로 측정, 세그먼트 선 도구를 사용 하 여 재생성 된 축 삭을 추적 하 고 분석 메뉴에서 측정값 을 사용 하 여 재생성 된 축 삭을 대표 하는 라인의 길이.
    3. 정규화 된 축 삭 길이 증가 재생 지를 계산 합니다.
      참고: 축 삭 길이 셀 바디와 수렴 하는 지점 (DCAC)-축 삭 길이/DCAC (그림 1D 및 1F) 축 삭 사이의 거리에 의해 정규화 됩니다. 이 값 애벌레 스케일링은 어떤 axonal 성장에 대 한 계정을 수 있습니다. 양수 값 재생, 0 의 값은 아무 재생 나타내고 음수 값은 철회.
  3. 모 수석 중생의 정량화
    1. 재생 비율, 다 신경 절단 하는 모든 사람들 사이에서 %는 분명 모 수석 자라나 표시를 계산 합니다.
      참고: 모 수석 자라나는 경우 새로운 긍정적인 dendrites 철회 수지상 줄기에서 및 부상 사이트 넘어 밖으로 regrow로 점수입니다. 부상 사이트 결정 랜드마크로 그리고 어떤 경우에, 잔여 상해 유도 autofluorescence 쉽게 표시.
    2. 지 포인트의 증가, 부상 후 새로운 모 수석 분기 포인트의 추가 계산 계산 합니다.
    3. 총 모 수석 길이 증가, 부상 후 추가 된 모든 새로운 모 수석의 누적 길이 계산 합니다.
  4. CNS 축 삭 재생의 정량화
    참고: 병 변 사이트는 처음으로 지점 몇 군데 (그림 3B)에 변성을 보여줍니다, 그것은 재생 길이 속도의 분석에서 포함 될 것입니다.
    1. 측정 재생 길이regrowing 축 삭의 길이입니다.
      참고: 단일 병 변 사이트의 regrowing 축 삭 부상 전에 원래 축 삭 경로 원본으로 식별 됩니다.
    2. Normalized 재생 길이, 재생 길이 commissure 세그먼트-commissures ("Y" 그림 3A 와 3B) 사이의 경도 거리의 길이를 정규화를 계산 합니다.
      참고:이 값 애벌레 크기 차이의 효과 대 한 올바른 수 있습니다.
    3. 재생 속도, 재생 했다 lesioned, 특정 유전자 형의 재생 능력을 반영 하기 위해 모든 세그먼트 사이 세그먼트의 %를 계산 합니다.

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결과

다 신경 클래스 특이성 뿐 아니라 주변 및 중앙 신경 조직 사이 잠재적인 차동 재생을 보여줍니다. 이 축 삭 재생 (를 사용 하 여 클래스 IV PNS 부상)로 (클래스 IV CNS 상해와 클래스 III PNS 부상) 재생에 대 한 금지는 그에 필요한 새로운 요소에 대 한 화면에 독특한 기회를 제공 합니다.

PNS에서 축 삭 재생

예를 들어, 클래스 III과 클래스 4 다 신경 세포의 재생의 특성을 설명 합니다. 이러한 신경 양측 각 몸 세그먼트에 있습니다. 여러 신경 같은 유 충;에 손상 될 수 있습니다. 복 부 세그먼트 a 7-a 2의 오른쪽에 일반적으로 3-4 신경. 클래스 III 및 클래스 IV 다 신경 수 구상 될 UAS-CD4tdGFP, 19-...

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토론

플라이를 설정 넘어, 여성 및 남성 사용의 수는 genotypes 및 특정 실험에 필요한 애벌레의 수에 따라 달라질 수 있습니다. WT 파리에 대 한 일반적인 크로스 10 여성 5 남성을 사용합니다. 컬렉션 창 애벌레 나이 요구의 정확도 따라 축소 수 있습니다. 예를 들어 2-h 컬렉션 기간 더 균질 인구의 애벌레를 얻을 것입니다. 이 경우에, 20 또는 더 처녀 여성을 사용 하 여 십자가를 설정 도움이 됩니다 충분 한 달걀을 얻을. 첫날부터 수확량은 일반적으로 부족 한, 그래서 수집 계란 접시 챔버를 설정 후 2 개 이상 일. 때 더 계란 접시 배양, 조직 0.5% 프로 산 솔루션 뿐만 아니라 접시에 습도 유지할 것 이다 하지만 금형의 성장을 방지는 물 대신에 60 mm 페 트리 접시에 담가 두는 것이 좋습니다.

애벌레 마 취 및 장착에 대 한 장치를 설정할 때 때문에 에테르 플라스틱을 통해 녹을 것 이다 유리 접시를 사용 하 여 있는지 확인 하십시오. 유리 접시는 15 cm ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 기술 지원에 대 한 제시카 Goldshteyn 감사합니다. 노래 랩에서 일 NIH 그랜트 R00NS088211, 그리고 지적 및 발달 장애 연구 센터 (IDDRC) 새로운 프로그램 개발 수상에 의해 자금이 다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
디에틸 에테르, ACS 시약, 무수Acros OrganicsAC615080010
Halocarbon 27 OilGenesee Scientific59-133
인산염 완충 식염수 (PBS), 20x 농축액, pH 7.5, 공급업체 # E703-1LVWR97062-948 
한천 가루, Alfa Aesar, 500GMVWRAAA10752-36
포도 주스Welch' s
에탄올 95% (시약, 알코올 95%), VWR64-17-5
아세트산시그마-알드리치A6283
프로피온산J.T.BakerU33007
커버 안경: 직사각형Fisher Scientific12-544-D50mm X 22mm
Zeiss LSM 880 레이저 스캐닝 현미경Zeiss
Zen 소프트웨어Zeiss
Chameleon Ultra IICoherent

참고문헌

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