주변에 Neuroregeneration 중앙 신 경계를 연구 하 고 대 한 Vivo에서 초파리 부상 모델

Summary

여기, 우리로 초파리 감각 신경- vivo에서 결합 하는 수지상 arborization (다) 신경 부상 모델, 라이브 영상, 2 광자 레이저 axotomy/dendriotomy, 그리고 강력한 비행 유전 도구 상자, 를 사용 하 여 프로토콜을 제시 잠재적인 발기인 및 neuroregeneration의 억제제 상영을 위한 플랫폼.

Abstract

손상 된 신경의 재 성장을 용량 신 경계 외상 후 neuroregeneration 및 복구 기능을 제어합니다. 지난 몇 년간 다양 한 내부 및 외부 억제 요인 축 삭 재생의 제한에 관련 된 발견 되었습니다. 그러나,이 금지 신호를 단순히 제거 추가 규제의 존재를 나타내는 성공적인 재생에 대 한 충분 하지 않습니다. 초파리 melanogaster, 과일 파리, 척추 동물, 인간을 포함 한와 진화론 보존된 유전자와 신호 경로 공유 합니다. 파리의 강력한 유전자 도구 상자를 결합 하 여 두 광자 레이저 axotomy/dendriotomy와 함께, 우리는 설명 여기 초파리 감각 신경-체계적으로 소설에 대 한 심사를 위한 플랫폼으로 수지상 arborization (다) 신경 상해 모델 재생 레 귤 레이 터. 간단히,이 패러다임) dendrite(s) 또는 axon(s) 2 광자 레이저, c) 라이브 confocal 영상 포스트 상해 및 d) 데이터 분석을 사용 하 여 애벌레, b) 병 변 유도의 준비를 포함 한다. 우리의 모델에는 단일 레이블된 뉴런, 축 삭, 및 주변 및 중앙 신경 시스템에의 잘 정의 된 신경 하위의 dendrites의 높은 재현성 부상 수 있습니다.

Introduction

후 중앙 신경 시스템 (CNS)에 부상 환자, 영구 장애 발생할 수 있습니다 및 또한 신경 퇴행 성 질환^{1,2에에서 돌이킬 수 없는 신경학 상 적자에 역할을 다시 생성 하는 축 삭의 무 능력 ,3,,45}. CNS 환경 뿐만 아니라 본질적인 성장 능력 뉴런의 축 삭 외상 후 재생성 수 있습니다 여부를 결정 합니다. 세포 외 요인 oligodendrocyte, astroglial, 및 fibroblastic 소스에서 신경 성장^4,6,7,8, 하지만 이러한 분자의 제거를 방해 하 보였다 만 제한⁵돋 아 수 있습니다. 본질적인 재생 신호 재생 성공^5,9 에 영향을 미칠 수 있습니다 잠재적인 치료 목표를 대표 하지만 이러한 프로세스는 분자 수준에서 아직도 분명 하지. 영양 요소 신호 또는¹⁰Pten 인산 가수분해 효소 등 생 브레이크의 제거 증가 axonal 재생 특정 상황에서 발생할 수 있습니다. 개별적으로 효과적인 것으로 발견 하는 다른 방법의 조합 또한만^11,12,,1314날짜 제한 전체 복구를 제공 합니다. 따라서, 타겟된 치료에 대 한 추가 경로 식별 하는 절망적 인 필요가 있다. 뿐만 아니라 자라나는 축 삭의 개시 여부와 축 삭 다시 올바른 대상, 개혁 시 냅 스 특이성, 와이어 및 달성 하는 방법 기능 복구 중요 한 의문점이 있습니다.

요약에서 기계 지시 된 축 삭 재생의 현재 이해는 매우 단편적인 여전히. 문제의 일부는 축 삭의 기술적인 어려움 포유류 실시간 재생, 소모, 비용과 수행 대규모 유전 스크린에 도전 하는 방식. 초파리 melanogaster, 다른 한편으로, 복잡 한 생물 학적 질문의 연구에 대 한 매우 강력한 시스템을 입증 했다. 과일 파리 유전자를 정의 하 고 신호 통로 기 막히게 인간에서 보존 하는 수단이 되었으며 인간의 조건, 광대 한 분자 유전학 도구를 통해 신경 퇴행 성 질환 등의 연구에 대 한 성공적인 모델 되었습니다. 유전자 기능¹⁵조작에 사용할 수 있습니다. 특히, 초파리 신경 상해 및 자라나^15,16에 관련 된 유전자의 발견에 대 한 이상적인 도구가 될 여겨진다. 성인 머리 또는 애벌레 복 부 신경 코드 (VNC) 찌르는 바늘, 애벌레 VNC 또는 집게, 애벌레 신경 레이저 axotomy, 후 각 수용 체 신경 제거, 뇌 explants 부상, 신경 호감을 포함 한 몇 가지 비행 신경 상해 모델 개발 되었습니다. 그리고 날개 퇴직금^{15,17,18,19,20,21,,2223}여 주변 신경 병 변. 최근 작품 활용 초파리 부상 모델 excitingly, 세포와 유전자 경로 일부는 포유류^{24에에서 보존 될 표시 되었습니다 신경 부상에 대응 하는 신 경계에 의해 사용에 대 한 우리의 이해 고급 ,25}. 다시,이 신경 선의 소설 메커니즘을 식별에 대 한이 모델 생물의 유틸리티를 강조 한다.

여기에 설명 된 2-광자 초파리 애벌레 감각 신경 상해 레이저 기반 모델이 이다. 두 광자 레이저 zebrafish에서 vivo에서 2003²⁶에 축 삭을 처음 사용 되었다. 같은 해, 첫 번째 레이저 dendriotomy 초파리 ²⁷펄스 질소 레이저 사용 하 여 수행 했습니다. 잠시 후, 여러 선 충 C. 실험실 축 삭 재생²⁸의 모델을 확립 펨 레이저를 사용 합니다. 2007 년, 우 동료 비교 및 선 충 C. 레이저²⁹의 다양 한 종류에 의해 유도 된에서 레이저 부상 간의 차이점을 보고. 2010 년에 축 삭 재생 레이저 axotomy 후 처음 초파리³⁰에 표시 했다. 이 광범위 한 레이저 부상 문학에 건물, 우리는 개발 조직 이웃의 최소한의 섭 동으로 대상된 사이트에 상해의 정확한 유도 허용, 2-광자 레이저를 사용 하 여 비행 신경 상해 모델 상대적으로 깨끗 한 제공 단일 셀 해상도와 neuroregeneration의 기본 및 외부 속성을 공부 하는 시스템. 특히, 우리 모두는 말 초 신 경계 (PNS)에서 수지상 arborization (다) 감각 신경에 대 한 부상 메서드의 집합 설정한 및 CNS. 다 신경 그들의 모 수석 분기 복잡성에 의해 주로 구별 4 가지 종류로 분류 될 수 있다: 4³¹종류 I. 우리의 출판된 일 다 신경 재생 phenotypic 및 분자 수준에서 포유류 부상 모델 유사한 보여준다: 다 신경 클래스 4와 클래스 특정 재생 속성을 표시 하지만 나 III 다 신경 재생을 전시 하지 클래스는 PNS; 클래스 4 다 신경 축 삭 주변에 견고 하 게 다시 생성 하지만 그들의 재생 잠재력은 따라서 닮은 포유류; 지 루트 신경 절 (DRG) 신경, CNS에서 극적으로 감소 Pten 통해 mTOR 활동 강화 삭제 또는 Akt overexpression 비행¹⁹CNS 축 삭 재생 향상. 이 부상 모델을 활용 하 여 우리 유전 스크린을 수행 되 고 있다 식별 RNA 가공 효소 Rtca 축 삭 재생을 위한 진화론 보존된 억제 요인으로 세포 스트레스 및 RNA 수정^{20 축 삭 상해를 연결} .

제시 패러다임에서 부상 애벌레 클래스 IV 또는 III 다 신경, ppk 권총-CD4-tdGFP 또는 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80에 의해 표시 된 각각의 레이저 axotomy/dendriotomy를 통해 유도 된다. 부상 (h AEL) 누워 계란 후 약 48-72 h에 3^rd 탈피 애벌레를 2^nd 에 수행 됩니다. PNS에 대 한 axotomy 병 변 세포 체, CNS axotomy ~ 20 µ m 직경, VNC에 commissure에의 지역 및 기본 수지상 브랜치 포인트에 dendriotomy에서 축 삭 ~ 20-50 µ m의 섹션 타겟팅 됩니다. 같은 신경은 부상 (AI) 완전 한 transection, 확인 후 8-24 h 고 48-72 h 재생을 평가 하기 위해 AI에서 몇 군데. 시간 경과 confocal 영상 통해 변성 및 부상 vivo에서 개별 axons/dendrites의 재생 시간이 지남에 모니터링할 수 있습니다.

Protocol

1입니다. 문화 접시와 병의 준비 포도 주스 한 천 배지 준비 비 커와 일시적으로 agar 완전히 녹아 때까지 저 어 약 4-5 분 동안 전자 레인지에 한 천 분말, 200ml 포도 주스와 192 mL ddH2O 10 g를 추가 합니다. 약 60 ° c 솔루션 진정 연기 후드, 4.2 mL 95% 에탄올과 4.0 mL 빙 초 산을 추가 합니다. 잘 ddH2오 믹스 400 mL에 솔루션의 전체 볼륨을 조정 합니다. 각 35 m m 플?…

Representative Results

다 신경 클래스 특이성 뿐 아니라 주변 및 중앙 신경 조직 사이 잠재적인 차동 재생을 보여줍니다. 이 축 삭 재생 (를 사용 하 여 클래스 IV PNS 부상)로 (클래스 IV CNS 상해와 클래스 III PNS 부상) 재생에 대 한 금지는 그에 필요한 새로운 요소에 대 한 화면에 독특한 기회를 제공 합니다. PNS에서 축 삭 재생 <p class="jove_content" fo:keep-t…

Discussion

플라이를 설정 넘어, 여성 및 남성 사용의 수는 genotypes 및 특정 실험에 필요한 애벌레의 수에 따라 달라질 수 있습니다. WT 파리에 대 한 일반적인 크로스 10 여성 5 남성을 사용합니다. 컬렉션 창 애벌레 나이 요구의 정확도 따라 축소 수 있습니다. 예를 들어 2-h 컬렉션 기간 더 균질 인구의 애벌레를 얻을 것입니다. 이 경우에, 20 또는 더 처녀 여성을 사용 하 여 십자가를 설정 도움이 됩니다 충분 한…

Materials

Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L	VWR	97062-948
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Grape juice	Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)	VWR	64-17-5
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent