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Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

Published: May 5, 2018 doi: 10.3791/57557
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit der Drosophila sensorischen Neuron - dendritischen Arborization (da) Verletzungen Modell Neuron, das in Vivo verbindet live imaging, zwei-Photonen-Laser Axotomie/Dendriotomy und die mächtigen fliegen genetische Toolbox, als eine Plattform für das screening potenzieller Projektträger und Inhibitoren der Neuroregeneration.

Abstract

Die nachwachsen Kapazität des beschädigten Nervenzellen regelt Neuroregeneration und funktionelle Wiederherstellung nach Trauma Nervensystem. In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene intrinsische und extrinsische hemmende Faktoren bei der Einschränkung der Axon Regeneration identifiziert. Jedoch reicht nicht einfach entfernen diese hemmenden Hinweise für erfolgreiche Regeneration, zeigt das Vorhandensein von zusätzlichen regulatorischen Maschinen. Drosophila Melanogaster, Drosophila, teilt sich evolutionär konservierte Gene und Signalwege mit Wirbeltiere, einschließlich des Menschen. Die Kombination der starke genetische Toolbox von Fliegen mit zwei-Photonen-Laser Axotomie/Dendriotomy, beschreiben wir hier die Drosophila sensorischen Neuron – dendritischen Arborization (da) Verletzungen Modell Neuron als Plattform für das screening von systematisch für Roman Regeneration-Regulatoren. Kurz, beinhaltet dieses Paradigma (a) die Vorbereitung der Larven, (b) Läsion Induktion, Dendrite(s) oder Axon(s) mit einem zwei-Photonen-Laser, c) lebende confocal imaging posttraumatischen und (d) Datenanalyse. Unser Modell ermöglicht hoch reproduzierbare Verletzungen single beschrifteten Neuronen Axone und Dendriten der klar definierte neuronale Subtypen im peripheren und zentralen Nervensystems.

Introduction

Die Unfähigkeit der Axone nach einer Schädigung des Zentralnervensystems (ZNS), regenerieren kann zu dauerhaften Behinderungen bei Patienten führen, und spielt auch eine Rolle in der irreversiblen neurologischen Defiziten in Neurodegenerative Krankheiten1,2 ,3,4,5. Die CNS-Umwelt, sowie die Fähigkeit der inneren Wachstum von Neuronen, bestimmt, ob Axone sind in der Lage, nach dem Trauma zu regenerieren. Extrazelluläre Faktoren von Oligodendrozyt, Astroglial und handelt Quellen haben gezeigt, dass neuronale Wachstum4,6,7,8, sondern die Beseitigung dieser Moleküle zu behindern nur ermöglicht für begrenzte sprießen5. Intrinsische Regeneration Signale beeinflussen regenerativen Erfolg5,9 und mögliche therapeutische Ziele zu vertreten, aber diese Prozesse auf molekularer Ebene noch nicht gut definiert sind. Erhöhung der trophischen Faktor Signalisierung oder Beseitigung von endogenen Bremsen, wie z. B. die Pten Phosphatase10können bei axonalen Regeneration unter bestimmten Umständen führen. Kombinationen verschiedener Methoden individuell wirksam erwiesen bieten auch nur begrenzte allgemeine Erholung bisher11,12,13,14. Deshalb dringend zusätzliche Wege für eine gezielte Therapie zu identifizieren. Neben der Einleitung eines Axon Regrowth ob und wie die Axone umverdrahtet werden an das richtige Ziel, Reform Synapse Spezifität und erreichen Funktionelle Wiederherstellung sind wichtige Fragen unbeantwortet.

Zusammenfassend lässt sich sagen ist Stand der Erkenntnisse über die Maschinen diktieren Axon Regeneration noch sehr lückenhaft. Ein Teil des Problems ist die technische Schwierigkeit des Studiums Axon Regeneration bei Säugetieren in Echtzeit, ein Ansatz, kostspielig, zeitaufwändig und anspruchsvoll für die Durchführung von umfangreichen genetischen Bildschirme ist. Drosophila Melanogaster, andererseits, erweist sich ein außerordentlich leistungsfähiges System für die Untersuchung von komplexen biologischen Fragen. Die Fruchtfliege war maßgeblich an der Definition von Genen und Signalwege, die auffallend beim Menschen konserviert sind und wurde ein erfolgreiches Modell für die Erforschung der menschlichen Bedingungen, z. B. neurodegenerativer Erkrankungen, durch die riesige Molekulargenetik-Werkzeuge gen Funktion15bearbeiten zur Verfügung. Insbesondere gelten Fruchtfliegen als ein ideales Werkzeug für die Entdeckung von Genen, die in den neuronalen Verletzungen und nachwachsen15,16. Mehrere Fliegen neuronalen Verletzung Modelle wurden entwickelt, einschließlich der Erwachsenen-Kopf oder Larven ventrale Nerv Schnur (VNC) stechen mit Nadeln, larval VNC oder Nerv Crush mit Zange, larval Neuron Laser Axotomie, olfaktorischen Rezeptor Neuron Entfernung Explantaten Hirnverletzungen, und peripheren Nerven Läsion durch Flügel Abfindung15,17,18,19,20,21,22,23. Aufregend, haben neuere Arbeit mit Drosophila Verletzungen Modelle erweitert unser Verständnis der zellulären und genetischen Wege durch das Nervensystem zum reagieren auf neuronalen Verletzungen, von denen einige gezeigt worden, um bei Säugetieren24 konserviert werden ,25. Wieder betont dies das diesem Modellorganismus für die Identifizierung neuartiger Mechanismen der neuronalen Reparatur-Dienstprogramm.

Hier beschriebene ist ein zwei-Photon Laser-basierten Drosophila Larven sensorischen Neuron Verletzungen Modell. Ein zwei-Photonen-Laser wurde zuerst verwendet, um Axone im Zebrafisch in Vivo in 200326geschnitten. Im selben Jahr wurde der erste Laser-Dendriotomy in Drosophila mit einem gepulsten Stickstoff Laser27aufgeführt. Kurz danach verwendet mehrere C. Elegans Labore Femtosekundenlaser, um Modelle von Axon Regeneration28zu etablieren. Im Jahr 2007 Wu und Kollegen verglichen und die Unterschiede zwischen Laser Verletzungen in C. Elegans induziert durch verschiedene Arten von Laser-29gemeldet. Im Jahr 2010 wurde Axon Regeneration nach Laser Axotomie erstmals gezeigt in Drosophila30auftreten. Aufbauend auf dieser umfangreichen Laser Verletzungen Literatur, entwickelten wir eine Fliege neuronalen Verletzungen-Modell mit der zwei-Photonen-Laser, der präzise Induktion Verletzungsgefahr für Ziel-Websites mit minimaler Störung benachbarter Gewebe ermöglicht, bietet eine relativ saubere System, die inneren und äußeren Eigenschaften der Neuroregeneration mit einzelligen Auflösung zu studieren. Insbesondere haben wir sowohl im peripheren Nervensystem (PNS) eine Reihe von Verletzungen Methoden zur sensorischen Neuronen dendritischen Arborization (da) gegründet und ZNS. Da Neuronen können in vier verschiedene Klassen zeichnen sich in erster Linie durch ihre Dendriten verzweigen Komplexität gruppiert werden: Klasse I bis IV31. Unsere veröffentlichten Arbeiten zeigen, dass da Neuron Regeneration Säugetier-Verletzungen Modelle phänotypische und molekulare Ebene ähnelt: da Neuronen spezifische Regeneration Klasseneigenschaften mit Klasse IV angezeigt, aber nicht Klasse I oder III da Neuronen ausstellenden Regeneration in der PNS; Klasse IV da Neuronen Axone regenerieren robust in der Peripherie, sondern ihr regeneratives Potential wird deutlich reduziert, im ZNS, so ähnlich Dorsal Root Ganglion (DRG) Neuronen bei Säugetieren; Verbesserung der mTOR Aktivität über Pten verbessert Löschung oder Akt Überexpression Axon Regeneration in der Fliege CNS19. Mit Hilfe dieser Verletzung Modell, wir haben Durchführung von genetischen Bildschirme und identifiziert RNA Verarbeitung Enzym Rtca als evolutionär konservierte hemmenden Faktor für Axon Regeneration, Verknüpfung von Axon Verletzungen mit zellulären Stresses und RNA-Modifikation20 .

Im vorgestellten-Paradigma wird die Verletzung per Laser Axotomie/Dendriotomy Larven Klasse IV oder III da Neuronen, gekennzeichnet durch Ppk-CD4-TdGFP oder 19 12 Gal4, UAS-CD4-TdGFP, Repo-Gal80, bzw. induziert. Die Schädigung erfolgt auf 2Nd , 3rd Instar Larven bei rund 48-72 h nach der Eiablage (h AEL). PNS richtet Axotomie Läsion zum Abschnitt Axon ~ 20-50 µm vom Zellkörper, CNS Axotomie auf einer Fläche von ~ 20 µm im Durchmesser an der Kommissur-Kreuzung in die VNC und Dendriotomy zu den primären dendritische Verzweigung Punkten. Die gleichen Neuron abgebildet in 8-24 h nach einer Verletzung (AI), vollständige Durchtrennung zu bestätigen und in 48-72 h AI Regeneration zu beurteilen. Durch Time-Lapse confocal Imaging können die Degeneration und Regeneration der einzelnen Axone/Dendriten, die verletzten in Vivo wurden im Laufe der Zeit überwacht werden.

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Protocol

1. Vorbereitung des Kultur-Platten und Flaschen

  1. Herstellung von Traubensaft Agarplatten
    1. Fügen Sie 10 g Agar Pulver, 200 mL Traubensaft Saft und 192 mL DdH2O in ein Becherglas und eine Mikrowelle für ca. 4-5 min, rühren, zeitweise bis Agar vollständig gelöst ist.
    2. In einer Dampfhaube Abkühlen der Lösung auf ca. 60 ° C. Fügen Sie 4,2 mL 95 % igem Ethanol und 4,0 mL Eisessig. Das Gesamtvolumen der Lösung 400 mL mit DdH2O. Mix gut anpassen.
    3. Fügen Sie für jede 35-mm-Platte ca. 2-3 mL der Lösung. Ca. 120-150 Platten für insgesamt 400 mL Traubensaft Agar Lösung zu machen.
    4. 10 min. abkühlen lassen die Platten und festigen die Agar-Lösung warten. Der Traubensaft Agarplatten in selbst verschlossenen Ziplock Beutel packen und bei 4 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.
  2. Vorbereitung von Drosophila -Kultur-Flaschen
    1. Verwenden Sie eine Klinge, um ein 1,5 cm Seite Länge dreieckiges Loch an der Wand der Drosophila -Kultur-Flasche und füllen das Loch mit einer 2-2,5 cm Durchmesser Kugel aus Baumwolle für die Belüftung.
    2. Schließen Sie die Flasche mit einem Traubensaft Agarplatte mit etwa 0,5 cm3 Hefe Paste ergänzt.

2. Sammlung von Drosophila -Larven

  1. Richten Sie die Kreuze der Erwachsenen fliegen
    1. Platz 10 jungfräulichen Weibchen und 5 männlichen Erwachsenen fliegt zusammen in einer kulturflasche mit einem Traubensaft nährbodenplatte angeschlossen.
    2. Legen Sie die Flaschenböden oben bei 25° C, so dass fliegen auf den Traubensaft nährbodenplatte Eiablage werden. Ändern Sie die Platte mit Hefe Paste mindestens einmal am Tag. Beginnen Sie für einen Zeitraum von 2-h-Sammlung, der erlaubt, die Ernte der Larven von einem homogenen Entwicklungsstadium mit mehr als 20 jungfräulichen Frauen und 10 Männer im Schritt 2.1.1.
    3. Kultur der Platte bei 25° C in einer 60 mm Petrischale mit einem feuchten Tuch, z. B. in 0,5 % Propionsäure Lösung getränkt. Ordnen Sie das Gewebe, so dass es keine Sauerstoffzufuhr blockiert.
      Hinweis: Die Propionsäure-Lösung dient zur Luftfeuchtigkeit in die Schüssel und das Wachstum von Schimmel zu vermeiden.
  2. Larven von einem bestimmten Alter zu ernten
    1. Verwenden Sie ein paar Zangen Larven der gewünschten Stufe, z. B. 2Nd , 3rd Instar Larven in 48-72 h nach der Eiablage (AEL) übertragen, um eine neue Traubensaft nährbodenplatte ohne Hefe einfügen.
    2. Entfernen der Hefe aus den Larven Haut indem man sie kriechen um auf die neue Platte, um potenzielle Störungen der Hefe Laser Axotomie und Bildgebung zu verhindern. Alternativ reinigen Sie gründlich die Larven durch in eine Schüssel mit PBS waschen und Trocknen kurz auf ein Stück Seidenpapier.

3. zwei-Photon Verletzungen und Confocal Imaging

  1. Mikroskop-setup
    Hinweis: Ein konfokale Laser-scanning-Mikroskop mit einem zwei-Photonen-Laser wurde für dieses Experiment verwendet, aber andere Systeme mit einer gleichwertigen Einrichtung werden auch genügen. Die zwei-Photonen-Laser (930 nm) diente für die Bereitstellung von Verletzungen und ein Argonlaser (488 nm) diente für die konfokale Bildgebung der GLP.
    1. Schalten Sie zu Beginn jeder Sitzung die zwei-Photonen-Laser und/oder die konfokale Laser und das Mikroskop. Öffnen Sie die imaging-Software.
    2. Für zwei-Photonen-Verletzungen, richten Sie die folgenden Parameter für imaging GFP mit der zwei-Photonen-Laser bei 930 nm (1.950 mW).
      1. -SELECT-Kanal-Scan-Modus. Das Loch ganz eröffnen. Laserintensität auf ~ 20 % zu erhöhen (390 mW).
      2. Wählen Sie den Frame Scan 512 x 512. Maximale Scan-Geschwindigkeit (in der Regel mit der Pixel-Verweilzeit auf 0,77 µs) verwenden. Stellen Sie sicher, dass die durchschnittliche Anzahl 1 und Bit-Tiefe 8 Bit ist.
      3. Verstärkung bis ca. 750 und den Versatz auf 0 festlegen.
      4. Speichern Sie diese voreingestellte experimentelle Protokoll als 2P GFP 930 Ablation, erlaubt einfache Wiederverwendung in Zukunft experimentiert.
    3. Für die konfokale Bildgebung, richten Sie die folgenden Parameter für imaging-GLP mit dem Argon-Laser bei 488 nm:
      1. Wählen Sie die Registerkarte " Erwerb " und dann Z-Stapel.
      2. Schalten Sie unter "Laser" für den 488 nm Argonlaser.
      3. Gehen Sie auf Kanäle, wählen Sie den Laser 488 mm, und die Laserleistung auf 5-10 % zu erhöhen. Benutzen Sie für das Loch, 1-2 luftig (AU). Passen Sie die Verstärkung auf 650.
      4. Wählen Sie im Akquisitionsmodus1024 x 1024 als Frame Scan aus, verwenden Sie die maximale Scan-Geschwindigkeit, eine durchschnittliche Anzahl von 2 und Bittiefe von 8 Bit.
      5. Speichern Sie diese voreingestellte experimentelle Protokoll als GFP Imaging.
  2. Larven Narkose mit Diethylether und Montage
    1. Legen Sie unter einem Abzug einer 60 mm Glasschale in einem 15 cm Kunststoff Petrischale. Falten und legen ein Stück Seidenpapier am unteren Rand der Glasschale, dann legen Sie eine Agarplatte Traubensaft auf das Gewebe. Fügen Sie Diethylether in der Glasschale, bis zu dem Punkt wo das Seidenpapier ist durchnässt und gibt eine Schicht flüssigen Äther noch in die Schüssel. Halten Sie den Deckel auf, zu allen Zeiten.
    2. Bereiten Sie einen Objektträger mit einem Tropfen Halocarbon 27 Öl in der Mitte. Fügen Sie 4 Spots Vakuum Fett auf den vier Ecken der Folie, um später das Deckglas zu unterstützen.
    3. Verwenden Sie Zange zu holen eine gereinigte Larve und legen Sie es auf der Agarplatte in 60 mm Glasschale. Bedecken Sie die Glas Schüssel mit Deckel und warten Sie, bis die Larve nicht bewegt mehr. Nehmen Sie für PNS Verletzungen/Imaging die Larve, sobald seine Rute zucken aufhört. Für die CNS warten, bis die gesamte Larve bewegungslos und wird vor allem der Kopf Segmente.
      Hinweis: Das Timing der Äther Exposition ist entscheidend. Siehe Diskussion.
    4. Vorsichtig den narkotisierten Larve abholen und Kopf aufrecht in den Tropfen Öl Halocarbon auf die Folie legen. Fügen Sie ein Deckglas auf der Folie. Verwenden Sie sanften Druck auf das Deckglas nach unten drücken, bis es die Larve (Abbildung 1A) berührt.
    5. Passen Sie die Larve Position durch leichten Druck das Deckglas in Richtung links oder rechts, die Larve zu Rollen, damit das Neuron/Axon/Dendriten von Interesse auf der Oberseite und am nächsten an das Mikroskop-Objektiv ist.
    6. Montieren Sie für PNS Verletzungen die Larve dorsalen Seite, so dass beide die Tracheas sichtbar sind. Dann Rollen Sie die Larve ~ 30 Grad nach links, um verletzte Klasse III da Neuronen Axone (Abbildung 1 b und 1 C), 90 Grad für Klasse IV da Neuronen Axone (Abbildung 1 b und 1E) zu verletzen oder ~ 30 Grad für Klasse IV da Neuron Dendriten (zu verletzen Abbildung 2A).
    7. Positionieren Sie für CNS Verletzungen die Larve zu perfekt ventralen Seite nach oben (Abb. 3A), so, dass die Region von Interesse am nächsten an das Mikroskop-Objektiv in der Z-Ebene ist.
  3. Verletzungen durch zwei-Photonen-laser
    1. Legen Sie die Folie mit der Larve unter dem Mikroskop und befestigen Sie es mit den Diahalter auf der Bühne. Verwendung der 10 X (0,3 NA) Ziel der Larve zu finden.
    2. Geben Sie 1 Tropfen des objektiven Öl auf das Deckglas, wechseln Sie zu den 40 X (1,3 NA) Ziel und den Fokus einzustellen.
    3. Wechseln Sie in den Scan-Modus und wiederverwenden Sie das experimentelle Protokoll 2P GFP 930 Ablation. Stellen Sie sicher, dass das Loch ganz geöffnet ist.
      Hinweis: Die Konfiguration muss optimiert werden, basierend auf einzelnen Systemen.
    4. Starten Sie den Live -Modus, um die Region of Interest (ROI) zu finden und die Feinabstimmung der Einstellungen um gute Bildqualität mit den entsprechenden Zoom zu erreichen.
      Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist das Neuron/Axon/Dendrit zu verletzen, anstatt die bestmögliche Bildqualität zu finden. Verwenden Sie daher die minimalen Einstellungen ausreichen, um das Zielgebiet zu visualisieren, zur Vermeidung von Überbelichtung oder Immunofluoreszenz.
    5. Live Scan zu stoppen, so dass die Schaltfläche Zuschneiden verfügbar sein werden. Lassen Sie das Standbild als Fahrplan dienen. Wählen Sie die Crop -Funktion und passen Sie das Scanfenster zu konzentrieren das Ziel verletzt werden.
    6. Verringern Sie den ROI die Größe des zukünftigen Standortes Verletzungsgefahr. Zum Beispiel nur decken Sie die Breite von einem Axon oder einem Dendriten, die Präzision der Verletzung zu gewährleisten und Schäden an benachbarten Geweben zu reduzieren. Falls gewünscht, vergrößern Sie den ROI vor dem Ausschnitt, ermöglicht eine präzisere Verletzungen.
    7. Öffnen Sie ein neues imaging Fenster. Reduzieren Sie die Scangeschwindigkeit und steigern Sie Laserintensität. Bestimmen Sie die Erhöhung in Laserintensität basierend auf das Gewebe-Fluoreszenz-Signal im Live -Modus gescannt.
    8. In der Regel stellen Sie die zwei-Photonen-Laserintensität ab 25 % für PNS Verletzungen und 50-100 % für VNC Verletzungen. Für PNS Axon Verletzungen, sicherzustellen, dass die Laserstärke ~ 480 mW und Pixel Verweilzeit beträgt 8,19 μs. Sicherzustellen Sie für den VNC Axon Verletzungen, dass die Laser Intensität und Pixel Verweilzeit in der Regel 965-1930 mW und 8.19-32,77 μs, beziehungsweise.
    9. Starten Sie kontinuierliches Scan. Lassen Sie den Cursor über die Schaltfläche " Continuous " schweben. Halten Sie ein wachsames Auge auf das Bild und stoppen Sie den Scan zu, sobald eine drastische Zunahme der Fluoreszenz beobachtet wird.
      Hinweis: Die Darstellung der Fluoreszenz-Spike ist durch Auto-Fluoreszenz am Verletzung Aufstellungsort.
    10. Wechseln Sie zurück zu den Live-Modus durch die Wiederverwendung der Einstellungen. Finden Sie die Region von Interesse, die nur durch eine Anpassung des Fokus bestimmt waren.
      Hinweis: Ein guter Indikator für erfolgreiche Verletzungen ist das Aussehen eines kleinen Krater, ringförmige Struktur oder lokalisierte Schmutz direkt am Verletzung Aufstellungsort.
    11. Verschieben Sie an die nächste Nervenzelle und wiederholen Sie ab Schritt 3.3.5, um mehrere Neuronen in ein einziges Tier zu verletzen. Oder wiederholen Sie Schritt 3.3.5 und schrittweise Erhöhung der Leistung und/oder Scan-Geschwindigkeit verringern, wenn die ursprüngliche Verletzung nicht ausreichte.
      Hinweis: In dem Fall, dass die Laserleistung zu hoch, beschädigte großflächig in der posttraumatischen live Bild sichtbar werden. Zuviel Verletzungen verursachen den Tod von der Larve.
    12. Wiederherstellen Sie die Larve durch sorgfältig herausnehmen das Deckglas und die verletzte Larve auf eine neue Platte mit Hefe Paste. Graben Sie mehrere Höhlen auf der Agarplatte mit Zange; Stellen Sie alternativ eine Insel der Agar in der Platte anstatt die ganze Platte, um die Möglichkeit, die Larve kriecht aus der Platte zu reduzieren.
    13. Setzen Sie die Platte in einer 60 mm Petrischale mit feuchten Tuch (mit 0,5 % Propionsäure Lösung getränkt) und Kultur bei Raumtemperatur oder 25° C.
      Hinweis: Die Larve bleibt im Larvenstadium ungefähr einen Tag bei Raumtemperatur (22 ° C) im Vergleich zu bei 25 ° C.
  4. Nach der Verletzung konfokale Bildgebung
    1. Bild der verletzten Larve zu gewünschten Zeitpunkten durch die Vorbereitung der Larve mit dem gleichen Verfahren der Anästhesie und Montage wie in Schritt 3.2, dann mit der konfokalen Laser imaging.
      Hinweis: Bild die Larve bei 24 h nach einer Verletzung (AI), axonale Schädigung zu bestätigen und in 48 h AI (Klasse IV da Neuronen) oder 72 h AI (Klasse III da Neuronen) Regeneration zu beurteilen.
    2. Suchen Sie die Larve mit der 10 X-Objektiv, dann wechseln Sie zu einem 25 X (NA 0,8) Ziel. Wiederverwenden Sie das experimentelle Protokoll GFP Imaging.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche " Live " und finden Sie die gleichen Neuron zuvor verletzt.
    4. Legen Sie die ersten und letzten Z-Positionen im Fenster "live-Bild". Drücken Sie Stopp, und klicken Sie auf Start zu experimentieren , um ein Z-Stapel-Bild zu erhalten.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass ein Normalisierung Punkt (dem Axon konvergierenden) enthalten ist, wenn Bilder zu erfassen, so dass Quantifizierung der Regeneration möglich ist (Abbildung 1, 1F) – Dies wird diskutiert weiter im Datenabschnitt-Analyse.
    5. Wechseln Sie zur Bildverarbeitung, wählen Sie das Bild einfach genommen und generieren Sie eine maximale Intensität Projektion zu. Speichern Sie die Z-Stapel und die maximale Intensität Projektion von Bildern.

(4) Datenanalyse

  1. Verarbeiten und Quantifizierung der Bilder mit der imaging-Software oder ImageJ.
  2. Quantifizierung der Axon Regeneration im PNS
    1. Prozentsatz der Regeneration, der bezieht sich auf den Prozentsatz der regenerierende Axone unter die Axone, die lesioned waren zu berechnen. Punkten Sie einem Axon als regenerieren, solange es über Verletzung Aufstellungsort nachwächst.
    2. Maßnahme Regeneration Länge, die die Zunahme der Axon Länge ist. Wenn mit ImageJ quantifizieren, verwenden Sie Segmentierte Linien -Werkzeug, um die regenerierten Axon verfolgen und verwenden Sie Messen in die Analyze -Drop-Down-Menü, um die Länge der Linie, die die regenerierte Axon zu erhalten.
    3. Regeneration-Index, ist die Zunahme der normalisierten Axon Länge zu berechnen.
      Hinweis: Axon Länge wird durch den Abstand zwischen den Zellkörper und Axon konvergierenden Punkt (DCAC) – Axon Länge/DCAC (Abbildung 1 und 1F) normalisiert. Dieser Wert hilft jedem axonale Wachstum durch Larven Skalierung. Ein positiver Wert steht Regeneration, ein Wert von 0 bedeutet keine Regeneration und ein negativer Wert bedeutet einfahren.
  3. Quantifizierung der Dendrit regeneration
    1. Berechnen Sie Regeneration Prozentsatz, der den Prozentsatz der da Neuronen unter all jenen durchtrennt ist, die offensichtlich Dendrit Nachwachsen zu zeigen.
      Hinweis: Dendrit nachwachsen wird bewertet, wie positive, wenn neue Dendriten, aus den eingefahrenen dendritischen Stamm und darüber hinaus die Verletzung Aufstellungsort nachwachsen. Verletzung Aufstellungsort ist bestimmt von Sehenswürdigkeiten und in einigen Fällen, ist gut sichtbar durch die restliche Verletzungen-induzierte Autofluoreszenz.
    2. Berechnen Sie der Verzweigungspunkte zu erhöhen, die die Hinzufügung der neuen dendritische Verzweigungspunkte nach Verletzung zählt.
    3. Berechnung der gesamten Dendrit Länge zu erhöhen, ist die kumulative Länge die neue Dendriten, die nach einer Verletzung hinzugefügt.
  4. Quantifizierung der Axon Regeneration im ZNS
    Hinweis: Ein läsionsort Degeneration am ersten Zeitpunkt abgebildet (Abb. 3 b) zeigt, werden bei der Analyse der Regeneration Länge und Höhe aufgenommen werden.
    1. Maßnahme Regeneration Länge, die die Länge der nachwachsenden Axon ist.
      Hinweis: Die nachwachsenden Axon einer einzigen Läsion Website wird identifiziert, da es von der ursprünglichen Route der Axon vor der Verletzung entsteht.
    2. Normalized Regeneration Länge, die die Regeneration Länge auf die Länge des Segments Kommissur - der longitudinalen Abstand zwischen Kommissuren ("Y" in Abbildung 3A und 3 b) normalisiert zu berechnen.
      Hinweis: Dieser Wert hilft für die Wirkung der Larven Größenunterschiede korrekt.
    3. Regeneration-Rate, die den Prozentsatz der regenerierenden Segmente zwischen den Segmenten, die lesioned, entsprechend das Regenerationsvermögen von einem bestimmten Genotyp waren zu berechnen.

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Representative Results

Da Neuronen weisen differenzielle Regeneration zwischen den peripheren und zentralen Nervensystems sowie Klasse Spezifität. Dies bietet einzigartige Möglichkeiten für neue Faktoren auf den Bildschirm, die für Axon-Regeneration (mit Klasse IV PNS Verletzungen) sowie die hemmenden zur Regeneration (mit Klasse IV CNS Verletzung und Klasse III PNS Verletzungen) erforderlich sind.

Axon Regeneration im PNS

Als Beispiel wird die Charakterisierung der Regeneration der Klasse III und Klasse IV da Neuronen beschrieben. Diese Neuronen befinden sich bilateral in jedem Körpersegment. Mehrere Neuronen können in der gleichen Larve verletzt werden; in der Regel 3-4 Neuronen in der rechten Seite der Abdominalsegmente A7-A2. Klasse III und Klasse IV da Neuronen können durch 19-12-Gal4, FH-CD4tdGFP, Repo-Gal80 und Ppk-CD4tdGFP, visualisiert werden. Zu betäuben und 48-72 h AEL Larven wie beschrieben Anpassen der Position der Larven, so dass die da Neuronen von Interesse (Abb. 1A und 1 b) gerichtet sind, zu montieren. Wir verletzen in der Regel die Klasse III DdaF und Klasse IV v'ada Neuronen (Abbildung 1 und 1E). Führen Sie Axotomie und erholen Sie Larven zu, wie beschrieben. Kurz nach einer Verletzung (AI) haben die Larven von Chirurgie und Ausstellung normalen Fortbewegung erholt. Hier die Überlebensrate beträgt in der Regel mehr als 80 %. Entsorgen Sie Larven, die tot oder krank sind. Montieren Sie den Rest wie beschrieben und beurteilen Sie Degeneration zu. Bei 24 h AI die distale Axone sollten Degeneration dieser Zeitpunkt19abgeschlossen haben, und der Axon-Stamm werden gut sichtbar (Abb. 1 und 1F). Image der gleichen Larven bei 48 h AI für Klasse IV da Neuronen oder 72 h AI für Klasse III da Neuronen Regeneration zu beurteilen. Wir wollen in der Regel mindestens 20 Verletzte Neuronen pro versuchsbedingung zu beurteilen. In (Wildtyp) WT, während in der Regel ~ 70 % der abgetrennten Klasse IV da Neuronen über Verletzung Aufstellungsort (Abb. 1F), Klasse III da Nervenzellen regeneriert haben werden nicht nachwachsen, Tiere, durch Wachstum Kegel ins Stocken geraten (Abbildung 1) belegt.

Dendrit-regeneration

Wir führen in der Regel Dendriotomy auf Klasse IV da Neuronen DdaC (Abbildung 2A). Wie in der schematischen Abbildung dargestellt, ist die Verletzung auf den primären dendritische Verzweigungspunkt ausgerichtet. Basierend auf Erfahrung, wenn Sie bei 48 h AEL verletzt, regenerieren ~ 50 % der DdaC Nervenzellen ihre Dendriten (Abb. 2 b). In den verbleibenden 50 % benachbarten Dendriten einzudringen und den leeren Raum zu decken. Darüber hinaus wird das Regenerationspotenzial dieser Neuronen reduziert, wenn in einem später Entwicklungsstadium verletzt.

Axon Regeneration im ZNS

Für VNC Axon Verletzungen die Überlebensrate der Larven erheblich variiert und hängt von dem Alter bei dem Schädigung induziert wird. Basierend auf Erfahrung, Larven von 48-72 h AEL haben in der Regel die höchste Überlebensrate (> 60 %) unter den verschiedenen Phasen getestet. Jünger als 48 h AEL Larven überleben schlecht nach einer Verletzung, während in die älter als 72 h AEL es schwierig ist, Verletzungen in der VNC einzuführen. Darüber hinaus ist es leichter zu Verletzungen an der hinteren Kommissur Segmente als die vorderen, induzieren diese hintere Segmente der VNC näher an der ventralen Oberfläche und somit mehr mit Laser (Abbildung 3A) erreichbar sind.

Um Klasse IV da Neuronen Axone im ZNS zu verletzen, montieren Sie die Larven wie oben beschrieben (Abb. 3A). Suchen Sie unter dem Mikroskop die Leiter-artige Struktur von Axon Bundles, die Bestandteil der VNC (Abbildung 3A), und durchführen Sie Axotomie, wie beschrieben. Degeneration ist bei 8 h bei 24 und 72 h AI AI und Regeneration bewertet werden bestätigt. Wie in Abbildung 3 bgezeigt, Axone um 8 Uhr AI haben bereits begonnen zu degenerieren, und bei 24 h AI, Axon Regeneration beobachtet während Axon Trümmer noch um die Verletzung Stätten zu finden. WT Axone begrenzt Regrowth in den VNC zeigen und nicht schließen die Lücken, die durch die Verletzung (Abb. 3 b) erzeugt. Um die Regenerationsfähigkeit des verletzten Axone zu quantifizieren, die nachwachsen nach Verletzung gemessen wird und die Länge des Segments Kommissur (Y in Abbildung 3A) dient zur Normalisierung (Abbildung 3).

Figure 1
Abbildung 1: Da Neuron Axon Regeneration in der Peripherie zeigt Klasse Spezifität. (A und B) Schematische Zeichnung zeigt die Position der Larven. (C) schematische Zeichnung der Klasse III da Neuronen. (D) Axone der Klasse III da Neuronen DdaF, beschriftet mit 19 12 Gal4, UAS-CD4-TdGFP, Repo-Gal80 / +, nicht nachwachsen. (E) schematische Zeichnung der Klasse IV da Neuronen. (F) Axone der Klasse IV da Neuronen v'ada, beschriftet mit Ppk-CD4-TdGFP / +, jenseits der läsionsort nachwachsen. (D und F) Rote Linie zeigt Axon Länge, während die grüne gestrichelte Linie markiert den Abstand zwischen den Zellkörper und Axon konvergierenden Punkt (DCAC). Der blaue Punkt markiert den Axon konvergierenden Punkt. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Da Neuron Dendrit Regeneration. (A) anschauliche Darstellung der Klasse IV da Neuronen. (B) anschauliche Darstellung der Dendrit Regeneration in Klasse IV da Neuron DdaC, gekennzeichnet durch Ppk-CD4-TdGFP / +. Laser-Ablation richtet sich an die primäre Verzweigungspunkt und erfolgt in 48 h AEL. Bei 24 h AI Verletzungen Durchtrennung der Neurit bestätigt wird, und bei 72 h AI Regeneration quantifiziert. Dendriten der DdaC Neuronen zeigen erhebliche nachwachsen mit neuen dendritischen Zweige sprießen aus dem abgetrennten stengel den leeren Raum anordnen. Es ist erwähnenswert, dass die unverletzten Dendriten in diesem Entwicklungsstadium kontinuierlich neue Endäste hinzugefügt werden. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Da Neuron Axon Regeneration in den VNC. (A) schematische Zeichnung der Drosophila Larve montiert auf einer Folie und unter dem Mikroskop abgebildet. Klasse IV da Neuronen Axone in das VNC visualisiert eine Ppk-CD4tdGFP / + Larve. Zwei Kandidaten Kommissur Segmente sind in das vergrößerte Bild und der schematischen Zeichnung dargestellt. Jeder von ihnen hat zwei Standorte in Verletzungen (rote Kreise). (B) konfokale Bilder aus einem verletzten Segment bei 8, 24 und 72 h nach einer Verletzung (AI) abgebildet. Rote Linien zeigen die nachwachsenden Axone. (C) Messung und Normalisierung der nachwachsenden Axone. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Beim Einrichten von Fly kreuzt, variieren je nach den Genotypen und die Anzahl der Larven für bestimmte Experimente benötigt die Anzahl der Weibchen und Männchen verwendet. Für WT fliegen nutzt typische Kreuz 10 Hündinnen und 5 Rüden. Das Sammlungsfenster kann eingeschränkt werden, abhängig von der Genauigkeit der Larven Alter erforderlich. Beispielsweise wird ein 2-h Abholfrist Larven einer homogeneren Bevölkerung Ausbeute. In diesem Fall hilft mit 20 oder mehr jungfräulichen Weibchen die Kreuze einrichten ausreichende Eiern ergeben. Die Rendite ab dem ersten Tag ist in der Regel knapp, so sammeln die Platte mit Eiern mindestens zwei Tage nach dem Einrichten der Kammers. Wenn die Platte mit Eiern weiter zu züchten, empfiehlt es sich, das Gewebe in der Petrischale 60 mm in 0,5 % Propionsäure Lösung anstelle von Wasser, genießen die wird nicht nur helfen, Feuchtigkeit in die Schüssel halten, sondern auch das Wachstum von Schimmel zu vermeiden.

Beim Einrichten der Geräte für Larven Anästhesie und Montage stellen Sie sicher, eine Glasschale zu verwenden, weil Äther durch Kunststoffe schmelzen wird. Die Glasschale befindet sich in einem 15 cm Kunststoff Petrischale im Falle eines Lecks. Das Seidenpapier hilft Äther in die Schüssel zu bewahren, damit die Larve effektiv von der Äther Dampf geschlagen werden kann. Mit Bernstein Flaschen zum Speichern von Aliquoten Ether löschen und Hinzufügen von Äther in Tröpfchen mit der Glas-Pipette wird empfohlen. Nachfüllen des Äthers und halten Sie immer eine Schicht aus flüssigem Äther in den Boden der Schale für eine optimale Wirkung.

Das Timing der Äther Exposition ist entscheidend: unter Narkose wird zur Genesung führen, Larve in der Mitte der bildgebenden Sitzung und verwackelte Bilder; eine Narkose Überdosierung oder direkten Kontakt mit der Flüssigkeit, die Äther wird Letalität führen. Zur Maximierung der überleben und die Erfolgsquote unserer Faustregel lautet wie folgt: für PNS Verletzungen/Imaging, nehmen Sie die Larve, sobald seine Rute zucken stoppt; für die CNS warten, bis die gesamte Larve bewegungslos und wird vor allem der Kopf Segmente. Sogar eine leichte Bewegung stören den Verletzungen und Bildgebung von VNC Axonen. Ältere Larven neigen dazu, länger, knock out. Es dauert normalerweise weniger als 2 min für Larven jünger als 72 h AEL und 2-5 min für Larven älter als 72 h AEL.

Bei der Einrichtung der Intensität der zwei-Photonen-Laser für Verletzungen richtet sich der Wert durch das Gewebe Fluoreszenz-Signal von der "Live" Scan erhalten. Die Verletzung wird durch "Continuous" Scan wie in Schritt 3.3 eingeführt. Verletzungen-induzierten Anstieg der Fluoreszenz ist aufgrund Autofluoreszenz am Verletzung Aufstellungsort und dient als ein guter Indikator für die Abfindung der Neurit. In der Regel dauert es 1-10 s, die Fluoreszenz-Spitze zu sehen. Es ist wichtig, die Scan-Zeit wenn Fluoreszenz erhöht ist zu kontrollieren. Für PNS Verletzungen unbedingt Scannen sofort anhalten. Längerer Exposition wird Verletzung Aufstellungsort zu vergrößern und benachbarte Gewebe schädigen. Allerdings dies bieten die Möglichkeit, Scan-Zeit einstellen und die Schwere der Verletzung zu manipulieren. Eine erfolgreiche Verletzung sollte einen Läsion Größe Durchmesser kleiner als 3 bis 4 μm haben. Für VNC Axon Verletzungen, die VNC-Axone sind viel tiefer eingebettet im Vergleich zu den da-Neuron PNS laser Axone/Dendriten, die direkt unter der Haut, und erfordern daher höhere Intensität. Wir lassen Sie in der Regel den Scan für ein paar Sekunden. Dies soll sicherstellen, dass das gesamte Axon Bündel durchtrennt wird. Wenn der Radius der Läsion Seiten mehr als die Hälfte der Breite des Kommissur Bundles ist, werden solche Verletzungen-Sites so erfolglos gezählt. Diese Larven haben eine geringe Überlebensrate und werden nicht in die Analyse einbezogen werden.

Für Axon Regeneration ähnelt der Regenerationsfähigkeit über Larvenstadien. Aber für Dendrit Regeneration nach einem einzigen Dendrit-Schnitt, ist die mögliche Regeneration nach 72 h AEL19reduziert. Axon Verletzung ist somit in der Regel in 48 h - 72 h AEL und Dendrit Verletzungen bei 48 h AEL, mit der Beurteilung der Regeneration bei 120 h AEL durchgeführt. Larven von 24h AEL können auch verwendet werden, aber sie erfordern mehr Sorgfalt, aufgrund ihrer kleineren Größe. Larven verpuppen sich nach 120 h AEL, imaging, schwieriger machen. Daher ist unser Endpunkt in der Regel 120 h AEL.

Was ist die Wechselbeziehung zwischen Degeneration und Regeneration? Für PNS Verletzungen, bei 24 h AI hat normalerweise die distalen Axon/Dendriten in WT Wallersche Degeneration abgeschlossen, während Regeneration nicht zu diesem Zeitpunkt begonnen hat. Daher glauben wir, dass in WT-Larven, Degeneration der abgetrennten Neuriten nur einen sehr begrenzten Einfluss auf die Regeneration, hat, wenn überhaupt. Für VNC Verletzungen Axone um 8 Uhr AI haben bereits begonnen zu degenerieren, und bei 24 h AI, Axon Regeneration beobachtet während Axon Trümmer noch um die Verletzung Stätten gefunden werden konnte. Die Trümmer scheint nicht zu blockieren, Regeneration. Es ist jedoch möglich, dass unter bestimmten Umständen möglicherweise eine Überlappung oder sogar ein Übersprechen zwischen Degeneration und Regeneration. In der Tat wurde berichtet, dass in alten Mäusen, Schutt Clearance nach periphere Nervenschädigung langsamer als die bei jungen Tieren ist. Begleitend wurde langsamer Reinnervation der neuromuskulären Synapse beobachtet, die die größere Anzahl von Hindernissen regenerierende Axone Begegnung in den alten Tieren zugeschrieben werden können. Überraschenderweise jedoch Axone aus alter Tiere schnell regenerieren und reinnervate neuromuskulären Websites effizient, wenn Sie nicht mit Schutt32konfrontiert. Dies deutet darauf hin, dass Schutt Abstand zu erleichtern eine mögliche Strategie zur Förderung der Regeneration ist.

Im Vergleich zu anderen Modellen Neuroregeneration, hat das Fliegen sensorischen Neuron Verletzungen Modell einzigartige Vorteile. Maus-Modellen in der Regel dauert Wochen bis Monate, um durchzuführen und eignen sich nicht für die Durchführung von umfangreichen genetischen Bildschirme; C. Elegans hat nur ein primitive zentralen Nervensystem, das nicht genau die Regeneration Barrieren im Säugetier-ZNS rekapitulieren kann. anders als bei Säugetieren, regenerieren Zebrafisch CNS Axone robust. Den schnellen Lebenszyklus von fliegen, die Vielseitigkeit der Fliege Genetik, Zugänglichkeit und Stereotype Strukturierung von Axone/Dendriten der Fliege sensorischen Neuronen und die charakteristischen Regeneration Eigenschaften der Fliege sensorischen Neuronen-Subtyp spezifische Regeneration in der PNS und begrenzte Regeneration im ZNS – machen Drosophila da Neuronen ein attraktives Modell für das Studium Neuroregeneration. Darüber hinaus schlagen aktuelle Studien aus zerkleinerten Maus retinalen Ganglienzellen (Routinggruppenconnectors) auch, dass neuronale Subtypen deutliche Regeneration Kompetenz tragen; Einige RGC Subtypen können sich regenerieren, während andere in die scheinbar homogenen Nervenbündel Scheitern33nachwachsen. Diese wichtige Erkenntnis legt nahe, dass neuronale Typ-spezifische Strategien zur Förderung der Regeneration und funktionellen Erholung genutzt werden sollte und stark argumentiert, dass die Induktion von Axon Verletzungen und anschließende Regeneration Analyse soll, in durchgeführt werden einem neuronale Subtyp-spezifisch. Darüber hinaus bleiben die zellulären und molekularen Determinanten für diese Regeneration Typ-Spezifität weitgehend unbekannt19,33. Da Neuron Verletzungen Modell bietet daher die ideale Paradigma um diese Probleme zu bewältigen.

Im Vergleich zu Axon Regeneration, sind Studien mit Schwerpunkt auf Dendrit Erneuerung viel knapper. Dendrit Verletzung tritt auf, z. B. Schädel-Hirn-Verletzungen, Schlaganfall und viele Formen der Neurodegeneration, noch über Dendriten Fähigkeit zu reparieren und Nervenverbindungen zu reformieren ist fast nichts bekannt. Das da Neuron Verletzungen Modell bietet wieder ein sehr zugängliches System, das stereotype Muster, Klasse Spezifität und zeitliche Regelung19, wird angezeigt, um diese Richtung zu erkunden.

Es ist auch erwähnenswert, dass es ist, zwar möglich, ein beschriftetes einziges Axon in der PNS zu verletzen die Art und Weise Verletzungen in der CNS-Ergebnisse in der Läsion aus einem Bündel von Axonen durchgeführt wird. Falls gewünscht, kann MARCM34 oder der FLP-Klon35 Ansatz verwendet werden, um einzelne Axone im ZNS zu beschriften. Darüber hinaus Wenn Gliazellen gleichzeitig mit mRFP (Repo-Gal4, UAS-mRFP) gekennzeichnet sind, wird die Ansammlung von Glia Prozesse speziell auf den läsionsort beobachtet. Darüber hinaus die Expression von Ptp99A, die fliegen Homolog von Chondroitin Sulfat Proteoglykan (CSPG) Phosphacan / PTPRZ1, an der Stelle der Läsion ist oben geregelt. Ptp99A Co mit Gliazellen lokalisiert und umgibt die Verletzung Aufstellungsort bilden eine ringförmige Struktur ähnlich wie was für Astroglial Narben in Säugetieren19,36,37berichtet wird. Die da Verletzungen Modell Neuron, in Kombination mit Marker für andere Zelltypen wie Gliazellen oder Immunzellen, lassen abschließend in Vivo Echtzeit-Überwachung der vielzelligen Wechselwirkungen zwischen einem verletzten Neuron und Umgebung Umgebung.

Während dieses Fliegenlarven sensorischen Neuron Verletzungen Modell uns Möglichkeiten bietet, potenzielle Neuroregeneration Regulatoren sowohl in der PNS und ZNS zu finden, hat es noch einige Einschränkungen. Erstens ist es nicht der hohe Durchsatz zum jetzigen Zeitpunkt. In der Regel könnte 5-6 Genotypen von einer Person innerhalb einer Woche gezeigt. Es muss optimiert werden, um eine unvoreingenommene Bildschirm durchzuführen. Zweitens die Äther Betäubung auf Larven von mehreren Minuten auf nicht mehr als 20 min dauern kann, ist es nicht optimal für die langfristige Bildgebung. Damit sind bestimmte Zeitpunkte, die repräsentativ für Axon Degeneration und Regeneration bzw. für die Bildgebung ausgewählt. Drittens, obwohl dieses Protokoll einen Weg, um Axone genau verletzen einführt, nicht die Möglichkeit der Beschädigung der umgebenden Gewebe vollständig auszuschließen. In der VNC kann diese Gewebe Gliazellen, Axone und Dendriten von anderen Neuronen. Zur Minimierung von diesem möglichen Vorbehalt wir minimieren die Verletzung Websites, Laser macht möglichst anwenden und führen Sie die gleichen Verfahren parallel steuern sowohl für Gruppen zu experimentieren. Viertens: bei der Einrichtung der CNS Verletzung Paradigma, verschiedene Verletzungen Websites wurden getestet, einschließlich der Standorte nahe an der Axon-Termini, die wir gewählt haben, zu verwenden und den Eintrag Punkt der Axone in den VNC. Die Einstiegspunkte erwiesen sich schwieriger zu verletzen, weil sie tiefer in das Gewebe sind und eher bewegen. So entscheiden wir uns für diesen praktischen Gründen für die aktuelle Methode, die mehr im Einklang, besser kontrolliert und gut für größere Experimente ist. Eine mögliche Sorge, besteht wie oben dargelegt, die Möglichkeit der benachbarten Geweben, wie z. B. die postsynaptischen Komponenten und die Gliazellen zu verletzen. Auf der anderen Seite ist es eine hervorragende Frage wie das beschädigte umliegende Gewebe der Degeneration und Regeneration von Axonen beeinflussen. Zum Beispiel wie die glial Narbe Axon Regeneration auswirkt. Dies stellt einen weiteren Grund, warum unsere Verletzungen Modell Verletzungen Modelle bei Säugetieren, ähneln kann bei der Axone und Gewebe um die läsionsorte in der Regel gleichzeitig verletzt sind.

Laser Verletzungen gefolgt von Zeitraffer-Mikroskopie ist ein sensibler Assay für Axon/Dendrit Regeneration zu studieren. Allerdings ist ein Hauptanliegen des Assays die wahrgenommenen Kosten, die von <$ 10 K für Low-End-Festkörper-Laser, $25-100 K für Femtosekundenlaser, >$ 100 K für zwei-Photonen-Laser reicht. Es gibt mehrere gute Diskussionen über verschiedene Lasersysteme zur Axotomie29,38,39,40,41,42,43, 44 , 45. Zusammenfassend herkömmliche Laser sind optimal für Schneiden Axone in über 30-50 µm von der Oberfläche. Es werden mehr Kollateralschäden mit der Nano- und Pico zweiten Laser im Vergleich mit dem Femtosekundenlaser, zumal die Tiefe des Zielbereichs45erhöht. Für Axone in das VNC zu verletzen, die eine Tiefe von ist in der Regel etwa 50-100 µm, es ist wichtig, um Gewebeschäden zu minimieren. In diesem Fall der zwei-Photonen-Laser ist ideal, konzentriert sich die Leistung des Lasers auf der Brennebene, Verringerung der Sicherheiten Gewebeschäden ohne kompromittierende Gewebe eindringen. Zusammenfassend, die zwei-Photonen-System ist teuer, aber bietet die beste Präzision und Gewebe. Jedoch, wenn nur die PNS Axone das Ziel für Axotomie sind, möglicherweise konventionelle Laser eine günstiger Alternative.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken Jessica Goldshteyn für den technischen Support. Arbeit im Labor Song wird von der NIH Grant R00NS088211, und die intellektuelle und Developmental Disabilities Research Center (IDDRC) neue Program Development Award finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous Acros Organics AC615080010
Halocarbon 27 Oil Genesee Scientific 59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L VWR 97062-948 
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM VWR AAA10752-36
Grape juice Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) VWR 64-17-5
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Propionic Acid J.T.Baker U33007
Cover Glasses: Rectangles Fisher Scientific 12-544-D 50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope Zeiss
Zen software Zeiss
Chameleon Ultra II Coherent

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References

  1. Yakura, J. S. Recovery following spinal cord injury. , (1996).
  2. Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury? Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
  3. Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
  4. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
  5. Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
  6. Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
  7. Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
  8. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  9. He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
  10. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
  11. Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
  12. Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
  13. Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
  14. Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
  15. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
  16. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  17. Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
  18. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
  19. Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
  20. Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
  21. Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
  22. Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
  23. Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
  24. Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
  25. Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
  26. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
  27. Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
  28. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
  29. Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
  30. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
  31. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
  32. Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
  33. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
  34. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  35. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
  36. Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
  37. McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
  38. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
  39. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
  40. Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
  41. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
  42. O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
  43. Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
  44. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
  45. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).

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Li, D., Li, F., Guttipatti, P., Song, Y. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. (135), e57557, doi:10.3791/57557 (2018).

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