再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル
Summary
ここでは、としてショウジョウバエ感覚ニューロンの樹状分枝 (da) ニューロン損傷モデルは、体内を組み合わせたライブ イメージング、2 光子レーザー膠/dendriotomy、および強力なハエの遺伝的ツールボックス,を使用してプロトコルを提案します。潜在的なプロモーターと再生に関する阻害物質をスクリーニングするためのプラットフォームです。
Abstract
破損した細胞の再生能力には、神経系の外傷後支配する再生に関すると機能回復が。過去数十年間、さまざまな組み込みと外因性抑制に関与する因子軸索再生の制限が特定されています。しかし、単にこれらの抑制のキューを削除する再生が成功する、追加規制機械の存在を示すため不十分です。キイロショウジョウバエ、フルーツ フライは、ヒトを含む脊椎動物の進化上保存された遺伝子とシグナル伝達経路を共有します。2 光子レーザー膠/dendriotomy とハエの遺伝子の強力なツールボックスを組み合わせること、ここで述べたいショウジョウバエ感覚ニューロン-樹状分枝 (da) ニューロン損傷モデル体系的に小説のスクリーニングのためのプラットフォームとして再生レギュレータ。簡単に言えば、このパラダイムには) dendrite(s) または axon(s) 2 光子レーザー、c) ライブの共焦点イメージング受傷後、d) データ分析を使用する幼虫、巣 b) 誘導の準備が含まれます。私たちのモデルにより、末梢および中枢神経系の適切に定義された神経細胞の樹状突起、軸索、単一標識細胞の再現性の高い傷害です。
Introduction
軸索の中枢神経系 (CNS) への損傷の後で再生することができない患者では、永続的な障害につながる可能性があります、また神経変性疾患1,2 で不可逆的な神経障害の役割を果たしています。 ,3,4,5。神経細胞の本質的な成長能力と同様に、中枢神経系の環境では、軸索が外傷の後で再生することができるかどうかを決定します。神経成長4,6,7、8、しかし、これらの分子の除去を阻害するオリゴデンドロ サイト、グリア、および線維芽ソースから細胞外の要因が示されています。発芽5限定のみことができます。本質的な再生信号することができます再生成功5,9に影響し、潜在的な治療上のターゲットを表すが、これらのプロセスは分子レベルでまだよく定義されていません。栄養因子の役割や Pten のホスファターゼ10などの内因性のブレーキの除去の増加は、特定の状況における軸索再生で起因できます。個別に有効にする別のメソッドの組み合わせはまた、唯一11,12,13,14まで限られた全体的な回復を提供します。そのため、標的療法の追加の経路を識別するために絶望的な必要性があります。軸索再生の開始、かどうか、および軸索再改革シナプス特異性、正しいターゲットに線を達成するためにどのように機能回復も重要な未解答の質問。
要約すると、軸索の再生を口述機械の現在の理解は非常に断片的です。問題の部分は軸索の勉強が困難であったリアルタイムで哺乳類の再生がかかり、時間がかかり、大規模な遺伝子スクリーニングを実施するために挑戦的なアプローチ。その一方で、キイロショウジョウバエは複雑な生物学的問題の研究のための非常に強力なシステムであると証明しました。ショウジョウバエの遺伝子を定義し、人間の驚くほど保存されているパスウェイに尽力されているし、広大な分子遺伝学ツールを介して、神経変性疾患など、人間の条件の調査のための成功モデルをされています。遺伝子機能15の操作に使用できます。特に、ショウジョウバエは、神経損傷と再生15,16にかかわる遺伝子の発見のための理想的なツールと見なされます。大人頭または幼虫 VNC または鉗子、幼虫ニューロン レーザー膠、嗅覚受容ニューロンの除去、脳外植体損傷と神経ときめきの針で刺すような幼虫の腹側神経コード (VNC) を含むいくつかのフライ神経障害モデルを開発されています。翼退職15,17,18,19,20,21,22,23によって末梢神経病変。最近仕事利用したショウジョウバエ傷害モデルが哺乳類24 に保存されると示されているいくつかの神経損傷に応答する神経システムで使用される細胞と遺伝経路の私達の理解を高度な興奮して、 ,25。繰り返しますが、これは神経修復の識別機構のこのモデル有機体の有用性を強調します。
ショウジョウバエ幼虫の感覚ニューロン損傷モデルをレーザーを用いた 2 光子は、ここで説明しました。2 光子レーザーは、ゼブラフィッシュのの体内2003年26軸索を切断する最初に使用されました。同じ年、最初のレーザー dendriotomy はショウジョウバエパルス窒素レーザー27を使用で行われました。まもなく、いくつかc. の elegansのラボは、軸索再生28のモデルを確立するのにフェムト秒レーザーを使用しました。2007 年に呉と同僚は比較、各種レーザー29による線虫のレーザー損傷間の相違点を報告します。2010 年レーザー膠後軸索再生最初ショウジョウバエ30で発生する示されました。この豊富なレーザー損傷文献上に構築された開発した隣接する組織の最小限の摂動による対象サイトへの損傷の正確な誘導を可能にする 2 光子レーザーを用いたフライ神経損傷モデル比較的きれいなを提供すること単一セルの解像度で再生に関するの組み込みと外因性の両方の特性を調査するシステムです。具体的には、我々 両方末梢神経系 (PNS) の感覚ニューロンは樹状パターン形成 (da) の傷害メソッドのセットを設け、中枢神経系。Da ニューロンが、樹状突起の分岐の複雑さによって主に 4 つのクラスにグループ化できます: IV31種します。私たちの出版された仕事は da ニューロン再生表現型および分子レベルで哺乳類の損傷モデルに似ている示しています: da ニューロン クラス IV のクラス特定の再生プロパティを表示がないクラス III da 細胞で再生するか、PNS;クラス IV da ニューロン軸索再生周辺で力強く、従って哺乳類; 後根神経節 (DRG) ニューロンに似た中枢神経系の再生の可能性を大幅に削減Pten による mTOR の活性を促進させる削除や Akt の発現は、飛ぶ CNS19軸索の再生を向上させます。遺伝子スクリーニングを行っている私たち細胞ストレスおよび RNA の修飾20 へ軸索損傷のリンク軸索再生、進化上保存された阻害要因として RNA プロセシング酵素 Rtca を識別したこの損傷モデルを活用し、.
提示のパラダイムでは、傷害がレーザー膠/幼虫クラス IV または III da ニューロン、 ppk CD4 tdGFPまたは19-12-Gal4、UAS-CD4-tdGFP、レポ Gal80、それぞれラベルの dendriotomy を介して誘導されます。傷害、2nd約 48-72 時間で 3rdの幼虫に産卵 (h AEL) 後に実行されます。PNS の膠病変は、VNC で交連交差点 ~ 20 μ m の領域に中枢神経系膠と主樹状突起分岐ポイントに dendriotomy の細胞体から軸索 20 ~ 50 μ m のセクション ターゲットです。8-24 h 完全断裂を確認する (AI) の負傷後、48-72 時間再生を評価するために AI を使用して同じニューロンのイメージを作成します。タイムラプス顕微鏡を用いたイメージングを通じて、変性および生体内で負傷されている個々 の軸索/樹状の再生時間の経過と共に監視できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
フライのセットアップを通過するとき女性と男性の使用数、遺伝子型と特定の実験に必要な幼虫の数によって異なります。WT ハエには、典型的なクロスは、女性 10 名、男性 5 を使用します。コレクション ウィンドウは、必要な幼虫時代の精度によって絞り込まれる可能性があります。たとえば、2 h コレクション期間より同種の人口の幼虫が得られます。この場合、十字架を設定する 20 また…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジェシカ Goldshteyn は、テクニカル サポートを感謝いたします。歌ラボでの仕事は NIH グラント R00NS088211 と知的・発達障害研究センター (IDDRC) 新しいプログラム開発賞によって資金を供給します。
Materials
| Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous | Acros Organics | AC615080010 | |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L | VWR | 97062-948 | |
| Agar powder, Alfa Aesar, 500GM | VWR | AAA10752-36 | |
| Grape juice | Welch’s | ||
| Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) | VWR | 64-17-5 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Propionic Acid | J.T.Baker | U33007 | |
| Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 mm X 22 mm |
| Zeiss LSM 880 laser scanning microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Chameleon Ultra II | Coherent |
References
- Yakura, J. S. . Recovery following spinal cord injury. , (1996).
- Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury?. Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
- Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
- Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
- Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
- He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
- Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
- Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
- Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
- Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
- MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
- Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
- Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
- McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).
