Drosophila i Vivo skade modell for å studere Neuroregeneration i tilleggsutstyret og sentralnervesystemet

Summary

Her presenterer vi en protokoll med Drosophila sensoriske Nevron – dendrittiske arborization (da) Nevron skade modellen, som kombinerer i vivo live bildebehandling, to-fotonet laser axotomy/dendriotomy og kraftig fly genetisk verktøykassen, som en plattform for screening potensielle arrangører og hemmere av neuroregeneration.

Abstract

Gjenvekst kapasiteten av skadet neurons styrer neuroregeneration og funksjonelle utvinning etter nervesystemet traumer. De siste tiårene, har blitt identifisert ulike indre og ytre hemmende faktorer involvert i begrensning av axon gjenfødelse. Men er å fjerne disse hemmende signaler utilstrekkelig for vellykket gjenfødelse, indikerer eksistensen av ytterligere regulatoriske maskiner. Drosophila melanogaster, frukt fly, deler evolusjonært bevarte gener og signalveier med virveldyr, inkludert mennesker. Kombinerer kraftig genetisk verktøykassen fluer med to-fotonet laser axotomy/dendriotomy, beskriver vi her Drosophila sensoriske Nevron-dendrittiske arborization (da) Nevron skade modellen som en plattform for systematisk screening for romanen gjenfødelse regulatorer. Kort, dette paradigmet inkluderer en) utarbeidelse av larver, b) lesjon induksjon dendrite(s) eller axon(s) med en to-fotonet laser, c) live AC confocal tenkelig etter skade og d) dataanalyse. Vår modell gjør det svært reproduserbar skade enkelt merket nerveceller, axons og dendrites av veldefinerte neuronal subtyper, både i perifere og sentralnervesystemet.

Introduction

Manglende evne til axons å regenerere etter en skade sentralnervesystemet (CNS), kan føre til permanente funksjonshemminger hos pasienter, og spiller også en rolle i irreversible nevrologiske underskuddene i nevrodegenerative sykdommer^{1,2 ,3,4,5}. CNS miljøet, samt indre vekst muligheten av neurons, bestemmer om axons skal kunne generere etter traumer. Ekstracellulære faktorer fra oligodendrocyte, astroglial og fibroblastic kilder har vist seg å hemme dannes hemmer nevronal vekst^4,6,7,8, men eliminere disse molekylene bare gir begrenset spirende⁵. Iboende gjenfødelse signaler kan påvirke regenerativ suksess^5,9 og representerer potensielle terapeutiske mål, men disse prosessene er fortsatt ikke godt definert på molekylært nivå. Økninger i trophic faktor signalering eller eliminering av endogene bremser, for eksempel Pten fosfatase¹⁰, kan medføre axonal gjenfødelse i visse tilfeller. Kombinasjoner av metoder som er funnet for å være individuelt effektiv også bare gi begrenset total utvinning hittil^11,12,13,14. Derfor er det desperat behov for å identifisere flere veier for målrettet terapi. Initiering av axon gjenvekst, om og hvordan axons re-wire til riktig mål, reform synapse spesifisitet, og oppnå funksjonelle utvinning er viktig ubesvarte spørsmål.

I sammendraget er nåværende forståelse av maskineriet dikterer axon gjenfødelse fortsatt svært fragmentert. Del av problemet er teknisk vanskeligheten med å studere axon gjenfødelse i pattedyr i sanntid, en tilnærming som er kostbar, tidkrevende og utfordrende for å gjennomføre omfattende genetisk skjermer. Drosophila melanogaster, derimot, har vist seg for å være en veldig kraftig system for studier av komplekse biologiske spørsmål. Har vært instrumentell definere gener og signalnettverk trasé som er påfallende bevart i mennesker og har vært en vellykket modell for studiet av menneskelige forhold, for eksempel nevrodegenerative sykdommer, gjennom store molekylær arvelighetsforskning verktøy tilgjengelig å manipulere gen funksjon¹⁵. Spesielt anses frukt fluer å være et ideelt verktøy for oppdagelsen av gener involvert i neural skade og gjenvekst^15,16. Flere fly neural skade modeller har blitt utviklet, inkludert voksen-hodet eller larver ventrale nerve ledningen (VNC) knivstikking med nåler, larver VNC eller nerve forelsket med tang, larver Nevron laser axotomy, olfactory reseptor Nevron fjerning, explants hjerneskade, og eksterne nerve lesjon av vingen etterlønn^{15,17,18,19,20,21,22,23}. Spennende, har siste arbeid utnytte Drosophila skade modeller avansert vår forståelse av mobilnettet og genetiske veier brukt av nervesystemet for å svare på neural skader, noen som har vist seg å være bevart i pattedyr^{24 ,25}. Igjen, dette understreker nytten av denne modellen organisme for identifiserende romanen mekanismer av nevrale reparasjon.

Beskrevet her er to-fotonet laser-basert Drosophila larver sensoriske Nevron skade modell. En to-fotonet laser ble først brukt til å kutte axons i sebrafisk i vivo i 2003²⁶. Samme år, ble den første laser dendriotomy utført i Drosophila bruker en pulserende nitrogen laser²⁷. Like etter brukt flere C. elegans labs femtosecond lasere for å etablere modeller av axon gjenfødelse²⁸. I 2007, Wu og kolleger forhold og rapporterte forskjellene mellom laser skader i C. elegans indusert av ulike typer lasere²⁹. I 2010, axon regenerasjon etter laser axotomy ble først vist oppstår i Drosophila³⁰. Bygge på denne omfattende laser skade litteraturen, har vi utviklet et fly neural skade modellen med to-fotonet laser, som tillater presis induksjon av skade målrettede nettsteder med minimal forstyrrelsene for nærliggende vev, gir en relativt ren system for å studere både indre og ytre egenskapene til neuroregeneration med én celle oppløsning. Spesielt, har vi etablert et sett av skade dendrittiske arborization (da) sensoriske neurons i begge perifere nervesystemet (PNS) og CNS. Da neurons kan grupperes i fire forskjellige klasser fremstående primært av deres dendrite forgrening kompleksiteten: klasse I til IV³¹. Våre publisert arbeid viser at da Nevron gjenfødelse ligner pattedyr skade modeller på fenotypiske og molekylære: da neurons vise egenskaper for bestemte gjenfødelse, med klasse IV, men ikke klasse I eller III da neurons viser fornyelse i de PNS; klasse IV da Nevron axons regenerere robust i periferien, men regenerativ potensialet er dramatisk redusert i CNS dermed ligner dorsal root ganglion (DRG) nerveceller i pattedyr; forbedre mTOR aktivitet via Pten forbedrer sletting eller Akt overuttrykte axon gjenfødelse fly CNS¹⁹. Utnytte denne skade modellen, vi har vært å utføre genetiske skjermer og har identifisert RNA behandling enzymet Rtca som et evolusjonært bevarte hemmende faktor for axon gjenfødelse, knytte axon skade til mobilnettet stress og RNA modifisering²⁰ .

I presentert paradigmet, er skaden indusert via laser axotomy/dendriotomy larver klasse IV eller III da neurons, merket med ppk-CD4-tdGFP eller 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, henholdsvis. Skaden utføres på 2^nd til 3^rd skikkelsen larver på rundt 48-72 h etter egglegging (h AEL). For PNS er axotomy lesjonen rettet mot delen av axon ~ 20-50 µm unna cellen kroppen, CNS axotomy til et område på ~ 20 µm i diameter på commissure krysset i VNC og dendriotomy til primære dendrittiske gren poeng. Samme Nevron er fotografert ved 8-24 h etter skade (AI) for å bekrefte komplett transection og 48-72 h AI å vurdere gjenfødelse. Gjennom time-lapse AC confocal avbildning, kan degenerasjon og regeneration av personlige axons/dendrites som har vært skadet i vivo overvåkes over tid.

Protocol

1. forberedelse av kultur plater og flasker Utarbeidelse av druesaft agar plater Legge til 10 g agar pulver, 200 mL drue juice og 192 mL ddH2O i et beaker og mikrobølgeovn for ca 4-5 minutter, røring og til agar er fullstendig oppløst. I avtrekksvifte, avkjølt løsningen på ca 60 ° C. Legg 4,2 mL 95% etanol og 4.0 mL iseddik. Juster det totale volumet av løsningen på 400 mL med ddH2O. Mix også. For hver 35 mm plate, legge ca 2-3 mL av løsningen. Lage…

Representative Results

Da neurons viser differensial gjenfødelse potensial mellom perifere og sentrale nervesystemet, samt klasse spesifisitet. Dette gir unike muligheter til skjermen for romanen faktorer som kreves for axon gjenfødelse (med klasse IV PNS skade), i tillegg til de som er hemmende for gjenfødelse (med klasse IV CNS skade og klasse III PNS skade). Axon gjenfødelse PNS Som et e…

Discussion

Når definere fly krysser, kan antallet hunner og hanner brukt variere avhengig av genotyper og antall Larvene trengs for spesifikke eksperimenter. WT fluer bruker typisk tvers 10 kvinner og 5 menn. Vinduet samling kan være smalere, avhengig av nøyaktigheten av Larvene alderen som kreves. En 2-h samling perioden vil for eksempel gi larver av mer homogene innbyggere. I dette tilfellet vil bruker 20 eller mer jomfru kvinner til å definere kors bidra til å gi tilstrekkelig egg. Avkastning fra første dag som regel er li…

Materials

Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L	VWR	97062-948
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Grape juice	Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)	VWR	64-17-5
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent