Här presenterar vi ett protokoll med de Drosophila sensoriska neuron – dendritiska arborization (da) neuron skada modell, som kombinerar i vivo live imaging, två-photon laser axotomy/dendriotomy och kraftfull flyga genetiska verktygslådan, som en plattform för screening potentiella projektansvariga och hämmare av neuroregeneration.
Återväxt kapaciteten av skadade nervceller reglerar neuroregeneration och funktionell återhämtning efter nervsystemet trauma. Under de senaste decennierna, har olika inre och yttre hämmande faktorer inblandade i begränsningen av axon förnyelse identifierats. Helt enkelt ta bort dessa hämmande signaler är emellertid otillräckliga för framgångsrika regenerering, som visar förekomsten av ytterligare reglerande maskiner. Drosophila melanogaster, bananflugan, delar evolutionärt bevarade gener och signalvägar med ryggradsdjur, inklusive människan. Kombinera kraftfull genetisk verktygslådan av flugor med två-photon laser axotomy/dendriotomy, beskriver vi här Drosophila sensoriska neuron – dendritiska arborization (da) neuron skada modell som en plattform för systematiskt screening för roman regenerering regulatorer. Kort, detta paradigm omfattar en) utarbetande av larver, b) lesion induktion till dendrite(s) eller axon(s) med en två-photon laser, c) live confocal imaging efter skada och d) dataanalys. Vår modell gör mycket reproducerbara skada enda märkt nervceller, axoner och dendriter av väldefinierade neuronala undertyper, i både perifera och centrala nervsystemet.
Axons oförmåga att regenerera efter en skada det centrala nervsystemet (CNS), kan leda till permanent funktionsnedsättning hos patienter, och spelar också en roll i de irreversibla neurologiska bortfall i neurodegenerativa sjukdomar1,2 ,3,4,5. CNS miljön, liksom inneboende tillväxt förmågan av nervceller, avgör om axoner är att regenererar efter trauma. Extracellulära faktorer från oligodendrocyte, astroglial och fibroblastic källor har visat sig hämma nervcellernas tillväxt4,6,7,8, men i eliminering av dessa molekyler endast tillåter begränsad groning5. Inneboende regenerering signaler kan påverka regenerativ framgång5,9 och representerar potentiella terapeutiska mål, men dessa processer är fortfarande inte väldefinierade på molekylär nivå. Ökningar av trofiska faktor signalering eller eliminering av endogena bromsar, såsom Pten fosfatas-10, kan resultera i axonal förnyelse under vissa omständigheter. Kombinationer av olika metoder som visat sig vara individuellt effektivt också endast ge begränsad total återhämtning hittills11,12,13,14. Därför, det finns ett desperat behov att identifiera ytterligare vägar för riktad terapi. Förutom inledande av axon återväxt, huruvida och hur axoner re-tråd till rätt mål, reformen synaps specificitet, och uppnå funktionell återhämtning är viktiga obesvarade frågor.
Sammanfattningsvis är aktuell kunskap om de maskiner som dikterar axon regenerering fortfarande mycket fragmentariska. Del av problemet är den tekniska svårigheten av att studera axon förnyelse i däggdjur i realtid, ett arbetssätt som är dyrt, tidskrävande och utmanande för att genomföra storskaliga genetiska skärmar. Drosophila melanogaster, däremot, har visat sig vara ett exceptionellt kraftfulla system för studier av komplexa biologiska frågor. Bananflugan har varit avgörande för definiera gener och signalering vägar som bevaras påfallande hos människa och har varit en framgångsrik modell för studier av människans villkor, såsom neurodegenerativa sjukdomar, genom vidsträckta molekylärgenetik verktyg tillgängliga att manipulera gen funktion15. I synnerhet anses bananflugor vara ett idealiskt verktyg för upptäckten av gener som är involverade i neurala skador och återväxt15,16. Flera flyga neurala skada modeller har utarbetats, inklusive vuxen-huvudet eller larvformer ventrala nerv sladd (VNC) stickande med nålar, larval VNC eller nerv krossa med pincett, larval neuron laser axotomy, luktreceptor neuron borttagning, bladsticklingar hjärnskada, och perifera nerver lesion av wing avgångsvederlag15,17,18,19,20,21,22,23. Excitingly, har senaste arbete utnyttja Drosophila skada modellerna avancerade vår förståelse av cellulär och genetisk vägar används av nervsystemet för att bemöta neurala skador, av vilka några har visat sig vara bevarad i däggdjur24 ,25. Igen, Detta betonar nyttan av denna modellorganism för att identifiera nya mekanismer av neurala reparation.
Beskrivs här är en två-photon laserbaserad Drosophila larval sensoriska neuron skador modell. En två-photon laser användes först klippa axoner i zebrafiskar i vivo i 200326. I samma år spelades den första laser-dendriotomy i Drosophila använder en pulsad kväve laser27. Kort därefter använde flera C. elegans labs femtosecond lasrar för att upprätta modeller av axon regenerering28. I 2007, Wu och kollegor jämfört och redovisas skillnaderna mellan laser skador i C. elegans induceras av olika typer av lasrar29. 2010 visades första gången axon förnyelse efter laser axotomy förekomma i Drosophila30. Bygga på denna omfattande laser skada litteratur, har vi utvecklat en flyga neurala skada modell med två-photon lasern, som tillåter exakta induktion av skada till riktade webbplatser med minimal störning av angränsande vävnader, som ger en relativt ren system för att studera både inre och yttre egenskaper av neuroregeneration med encelliga upplösning. Specifikt, har vi en uppsättning skada metoder för dendritiska arborization (da) sensoriska nervceller i både det perifera nervsystemet (PNS) och CNS. Da nervceller kan grupperas i fyra olika klasser kännetecknas främst av deras dendrite förgrenade komplexitet: klass I till IV31. Våra publicerade arbete visar att da neuron förnyelse liknar däggdjur skada modeller på fenotypisk och molekylär nivå: da nervceller Visa klass specifika förnyelse egenskaper, med klass IV men inte klass I eller III da nervceller uppvisar förnyelse i den PNS; klass IV da neuron axoner regenerera kraftfullt i periferin, men deras regenerativ potential reduceras dramatiskt i CNS, som därmed liknar dorsalrotsganglier ganglion (DRG) nervceller i däggdjur. förbättra mTOR aktiviteten via Pten förbättrar radering eller Akt överuttryck axon förnyelse i flugan CNS19. Utnyttja denna skada modell, vi har varit utför genetiska skärmar och har identifierat enzymet RNA bearbetning Rtca som en evolutionärt bevarade hämmande faktor för axon regenerering, länka axon skada till cellulär stress och RNA modifiering20 .
I den presenteras paradigmen induceras skadan via laser axotomy/dendriotomy av larval klass IV eller III da nervceller, märkt av ppk-CD4-tdGFP eller 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, respektive. Skadan som utförs på 2nd till 3rd instar larver på runt 48-72 h efter värpning (h AEL). För PNS är axotomy lesionen riktad till avsnittet axon ~ 20-50 µm bort från cellkroppen, för CNS axotomy till ett område ~ 20 µm i diameter vid commissure korsningen i VNC och dendriotomy till de primära dendritiska gren punkterna. Samma neuron är avbildade på 8-24 h efter skada (AI) att bekräfta fullständig transection och på 48-72 h AI att bedöma regenerering. Genom time-lapse confocal imaging, kan den degeneration och regeneration av enskilda axoner/dendriter som har varit skadade i vivo övervakas över tid.
När inställningen upp farten korsar, kan antalet honor och hanar som används variera beroende på genotyperna och antalet larver som behövs för specifika experiment. För WT flugor använder typisk cross 10 tikar och 5 hanar. Fönstret samling kan reduceras, beroende på riktigheten av den larver ålder som krävs. Exempelvis ger en 2-h kredittid larver av en mer homogen befolkning. I det här fallet hjälper använder hondjur 20 eller mer oskuld för att ställa in korsen ge tillräcklig ägg. Avkastningen från de…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Jessica Goldshteyn för teknisk support. Arbete i låt labbet finansieras av NIH bidraget R00NS088211, och de intellektuella och utvecklingsstörningar Research Center (IDDRC) nya Program Development Award.
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous | Acros Organics | AC615080010 | |
Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L | VWR | 97062-948 | |
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM | VWR | AAA10752-36 | |
Grape juice | Welch’s | ||
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) | VWR | 64-17-5 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Propionic Acid | J.T.Baker | U33007 | |
Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 mm X 22 mm |
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope | Zeiss | ||
Zen software | Zeiss | ||
Chameleon Ultra II | Coherent |