Burada, duyusal nöron – vivo içinde birleştirir dendritik arborization (da) nöron yaralanma modeli, canlı görüntüleme Drosophila , İki fotonlu lazer axotomy/dendriotomy ve güçlü sinek genetik araç, olarak bir iletişim kuralı’nı mevcut olası rehberleri ve neuroregeneration inhibitörleri süzmek için bir platform.
Hasarlı nöronlar büyütme kapasitesi neuroregeneration ve fonksiyonel iyileşme sinir sistemi travmadan sonra yönetir. Son birkaç on yıl boyunca, çeşitli içsel ve dışsal inhibitör faktörleri axon rejenerasyon sınırlama içinde yer tespit edilmiştir. Ancak, sadece Bu inhibitör ipuçlarını kaldırma ek yasal makine varlığını gösteren başarılı rejenerasyon için yeterli değil. Drosophila melanogaster, meyve sineği örümceklerle korunmuş genler ve sinyal yollar insanlar da dahil omurgalılar ile paylaşır. Sineklerin Tanrısı güçlü genetik araç kutusu iki fotonlu lazer axotomy/dendriotomy ile birleştirerek, biz burada Drosophila duyusal nöron-dendritik arborization (da) nöron yaralanma modeli sistematik olarak roman için eleme için bir platform olarak tarif rejenerasyon düzenleyiciler. Kısaca, bu paradigma bir) hazırlanması larva, b) lezyon indüksiyon dendrite(s) veya axon(s) kullanarak bir iki fotonlu lazer, c) canlı confocal görüntüleme sonrası yaralanma ve d) veri analizi için içerir. Bizim modeli son derece tekrarlanabilir yaralanma tek etiketli nöronlar, akson ve periferik ve santral sinir sistemi iyi tanımlanmış nöronal türlerinden dendrites olanak verir.
Merkezi sinir sistemi (MSS), bir yaralanma sonra yeniden akson ve yetersizlik hastalarda kalıcı engelli yol açabilir ve aynı zamanda geri dönüşü olmayan nörolojik açıkları nörodejeneratif hastalıkları1,2’deki bir rol oynar ,3,4,5. CNS çevre gibi yaşarsan, içsel büyüme yetenek aksonlar travmadan sonra yeniden oluşturmak mümkün olup olmadığını belirler. Oligodendrocyte, astroglial ve fibroblastic kaynakları hücre dışı etkenler engel nöronal büyüme4,6,7,8, ama bu moleküller ortadan kaldırılması gösterilmiştir Sadece5çimlenme limited için izin verir. İçsel rejenerasyon sinyalleri rejeneratif başarı5,9 etkisi ve potansiyel tedavi hedefleri temsil, ama bu işlemler moleküler düzeyde hala iyi tanımlanmış. Trofik faktör sinyal veya Pten fosfataz10gibi endojen frenler ortadan kaldırılması artışlar aksonal rejenerasyon bazı durumlarda neden olabilir. Farklı yöntemler tek tek etkili olduğu bulundu kombinasyonları da sadece11,12,13,14bugüne kadar sınırlı genel kurtarma sağlar. Bu nedenle, ek yollar hedefe yönelik tedavi tanımlamak için umutsuz bir ihtiyaç vardır. Axon büyütme girişimi ek olarak, olup olmadığını ve nasıl aksonlar reformu synapse özgüllük, doğru hedefe yeniden tel ve elde fonksiyonel iyileşme önemli cevapsız sorular vardır.
Özet olarak, geçerli axon rejenerasyon dikte makine hala çok bölük pörçük anlaşılmasıdır. Sorunun bir parçası olduğunu axon eğitim teknik zorluk içinde gerçek-zaman memelilerde rejenerasyon, pahalı, zaman alıcı ve büyük ölçekli genetik ekranlar yürütmek için zorlu bir yaklaşım. Drosophila melanogaster, öte yandan, karmaşık biyolojik soruların incelenmesi için son derece güçlü bir sistem olduğu ispatlanmıştır. Meyve sineği genler tanımlama ve çarpıcı insanlarda korunmuş yolları sinyal vesile olmuştur ve nörodejeneratif hastalıklar, büyük moleküler genetik araçları aracılığıyla gibi insan koşulları çalışma için başarılı bir model olmuştur Gen işlev15işlemek kullanılabilir. Özellikle, meyve sinekleri genlerin sinir yaralanma ve büyütme15,16dahil keşfi için ideal bir araç olarak kabul edilir. Yetişkin kafa veya larva ventral sinir kablosu (VNC) iğneler, larva VNC veya sinir ezmek ile forseps, larva nöron lazer axotomy, koku reseptör nöron kaldırma, beyin explants yaralanma ile bıçak gibi de dahil olmak üzere birkaç sinek sinirsel hasar modelleri geliştirilmiştir, ve periferik sinir lezyonu kanat kıdem15,17,18,19,20,21,22,23tarafından. Heyecan verici, son iş kullanarak Drosophila yaralanma modelleriyle yanıt vermek için sinir yaralanmaları, bazıları24 memelilerde korunmuş gösterilen sinir sistemi tarafından kullanılan hücresel ve genetik yollar bizim anlayış gelişmiş var. ,25. Yine, bu model organizma tanımlayıcı roman mekanizmaları, sinirsel onarma yardımcı programı vurgular.
Burada açıklanan bir iki fotonlu Lazer tabanlı Drosophila larva duyusal nöron yaralanma modelidir. İki fotonlu lazer ilk Zebra balığı vivo içinde 200326aksonlar kesmek için kullanılmıştır. Aynı yıl, ilk lazer dendriotomy pulsed azot lazer27kullanarak Drosophila içinde gerçekleştirildi. Kısa süre sonra birkaç C. elegans labs femtosecond lazer axon rejenerasyon28modelleri oluşturmak için kullanılan. 2007’de, Wu ve meslektaşları ile karşılaştırıldığında ve lazerler29türleri tarafından indüklenen C. elegans lazer yaralanmaları arasındaki farklar bildirdi. 2010 yılında, akson yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra lazer axotomy ilk Drosophila30‘ u gerçekleşmesi için gösterildi. Bu geniş lazer yaralanma edebiyat bina, yaralanma hedeflenen sitelere kesin indüksiyon ile komşu dokulara az pertürbasyon sağlar, İki fotonlu lazer kullanarak bir sinek sinir yaralanma modeli nispeten temiz sağlayan geliştirdiğimiz Sistem neuroregeneration tek hücreli çözünürlük ile içsel ve dışsal özelliklerini incelemek için. Özellikle, biz her iki periferik sinir sistemi (PNS) bir dizi yaralanma yöntem dendritik arborization (da) duyusal nöronlar için kurduk ve CNS. Öncelikle kendi dendrite dallanma karmaşıklığı tarafından seçkin dört farklı sınıflara da nöronların gruplandırılabilir: sınıf ı IV31. Yayımlanmış çalışmalarımız da nöron rejenerasyonu memeli yaralanma modelleri fenotipik ve moleküler düzeyde benzer gösterir: da nöronların sınıf IV ile sınıf belirli rejenerasyon özelliklerini görüntülemek ama ben veya III da nöronların yenilenme içinde sergilenmesi sınıf PNS; sınıf IV da nöron aksonlar sağlam çevre içinde yeniden ama rejeneratif potansiyellerini önemli ölçüde böylece dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar memelilerde benzeyen MSS azaltılır; mTOR etkinlik Pten yoluyla artırılması silme veya Akt overexpression akson rejenerasyon anında CNS19içinde geliştirir. Bu yaralanma modeli kullanmak, genetik ekranlar sahne olmuştur ve RNA işleme enzim Rtca akson hasarı hücresel stres ve RNA modifikasyon20 bağlanma axon rejenerasyon, evrimsel korunmuş bir inhibitör faktörü olarak belirledik .
Sunulan paradigmada, yaralanma lazer axotomy/dendriotomy yolu ile larva sınıf IV veya III da nöronların, ppk-CD4-tdGFP veya 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo Gal80, sırasıyla etiketli indüklenen. Yaralanma 3rd INSTAR larvaları yaklaşık 48-72 saat için 2nd (h AEL) döşeme yumurta sonra gerçekleştirilir. PNS için axotomy lezyon axon ~ 20-50 µm hücre vücuttan, CNS axotomy ~ 20 µm çapında komissür Kavşağı’nda VNC adlı bir alanı için ve dendriotomy için birincil dendritik şube noktaları bölümüne hedeflenmektedir. Aynı nöron 8-24 h sonra yaralanma (AI) tam transeksiyon onaylamak için ve 48-72 h rejenerasyon değerlendirmek için AI görüntüsü. Hızlandırılmış confocal görüntüleme yoluyla zamanla dejenerasyon ve rejenerasyon yaralı vivo içinde olmuştur bireysel aksonlar/dendrites izlenebilir.
Sinek kurma geçer zaman, dişi ve erkek kullanılan sayısı genotip ve belirli deneyler için gerekli larva sayısı bağlı olarak değişebilir. WT sinekler için tipik çapraz 10 kadın ve 5 erkek kullanır. Toplama penceresi, larva yönlendirmesiyle doğruluğunu bağlı olarak daralmış. Örneğin, 2-h koleksiyon dönem larva daha homojen bir nüfus ortaya çıkarır. Bu durumda, haçlar ayarlamak için 20 veya daha fazla bakire kadın kullanmak yeterli yumurta verim yardımcı olur. İlk günden verimidir genell…
The authors have nothing to disclose.
Jessica Goldshteyn teknik destek için teşekkür ederiz. Şarkı laboratuvar çalışmalarında NIH grant R00NS088211 ve entelektüel ve Gelişme Bozuklukları Araştırma Merkezi (IDDRC) Yeni Program Geliştirme Ödülü tarafından finanse edilmektedir.
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous | Acros Organics | AC615080010 | |
Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L | VWR | 97062-948 | |
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM | VWR | AAA10752-36 | |
Grape juice | Welch’s | ||
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) | VWR | 64-17-5 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Propionic Acid | J.T.Baker | U33007 | |
Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 mm X 22 mm |
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope | Zeiss | ||
Zen software | Zeiss | ||
Chameleon Ultra II | Coherent |