Un modello di ferita Drosophila In Vivo per lo studio della neurorigenerazione la periferica e del sistema nervoso centrale

Summary

Qui, presentiamo un protocollo utilizzando la drosofila neurone sensoriale – modello di lesione del neurone arborization dentritico (da), che combina in vivo live imaging, due fotoni laser assotomia/dendriotomy e il potente toolbox di volare genetica, come una piattaforma per lo screening di potenziali promotori e inibitori della neurorigenerazione.

Abstract

La capacità di ricrescita di neuroni danneggiati governa neurorigenerazione ed il recupero funzionale dopo trauma del sistema nervoso. Negli ultimi decenni, sono stati identificati diversi fattori inibitori intrinseche ed estrinseche coinvolti nella restrizione di rigenerazione dell’assone. Tuttavia, semplicemente rimuovendo questi spunti inibitori è insufficiente per successo di rigenerazione, che indica l’esistenza di ulteriori normative macchine. Drosophila melanogaster, il moscerino della frutta, condivide evolutivamente conservati geni e vie di segnalazione con vertebrati, compreso gli esseri umani. Combinando la casella degli strumenti genetico potente di mosche con due fotoni laser assotomia/dendriotomy, descriviamo qui il neurone sensoriale di Drosophila – modello di lesione del neurone arborization dentritico (da) come una piattaforma per lo screening sistematico per il romanzo regolatori di rigenerazione. Brevemente, questo paradigma include un) la preparazione di larve, induzione b) lesione di dendrite(s) o axon(s) utilizzando un laser del due-fotone, c) dal vivo confocale imaging post-infortunio e d) analisi dei dati. Il nostro modello consente altamente riproducibile lesioni di singoli neuroni con etichettati, assoni e dendriti dei sottotipi neuronali ben definiti, nel sistema nervoso centrale e periferico.

Introduction

L’incapacità degli assoni di rigenerarsi dopo una lesione al sistema nervoso centrale (CNS), può portare a disabilità permanenti nei pazienti e svolge anche un ruolo nei deficit neurologici irreversibili in neurodegenerative malattie^{1,2 ,3,4,5}. L’ambiente del CNS, come pure la capacità intrinseche di crescita dei neuroni, determina se gli assoni sono in grado di rigenerare dopo il trauma. Fattori extracellulari da oligodendrociti, astroglial e fibroblastici fonti sono stati indicati per impedire la crescita neuronale^4,6,7,8, ma l’eliminazione di queste molecole consente solo limitata⁵di germogliatura. Segnali di rigenerazione intrinseca possono influenzare il successo rigenerativa^5,9 e rappresentano potenziali bersagli terapeutici, ma questi processi sono ancora non ben definiti a livello molecolare. Aumenti in fattore trofico segnalazione o eliminazione dei freni endogeni, quali la fosfatasi Pten¹⁰, possono causare la rigenerazione assonale in determinate circostanze. Combinazioni di diversi metodi trovati per essere singolarmente efficace forniscono anche solo limitato recupero complessivo ad oggi^11,12,13,14. Di conseguenza, c’è un disperato bisogno per identificare ulteriori vie per la terapia mirata. Oltre l’inizio della ricrescita dell’assone, se e come gli assoni ricollegherai alla destinazione corretta, specificità di sinapsi di riforma e realizzare il recupero funzionale sono importanti domande senza risposta.

In sintesi, comprensione corrente del macchinario dettando la rigenerazione dell’assone è ancora molto frammentaria. Parte del problema è la difficoltà tecnica di studiare assone rigenerazione nei mammiferi in tempo reale, un approccio che è costosa, richiede tempo e stimolante per lo svolgimento di schermi genetici su larga scala. Drosophila melanogaster, d’altra parte, ha dimostrato di essere un sistema eccezionalmente potente per lo studio delle complesse questioni biologiche. Moscerino della frutta è stato determinante nella definizione di geni e vie che sono straordinariamente conservate negli esseri umani di segnalazione ed è stato un modello di successo per lo studio delle condizioni umane, come le malattie neurodegenerative, attraverso gli strumenti di genetica molecolare vasto disponibili per manipolare gene funzione¹⁵. In particolare, sono considerate uno strumento ideale per la scoperta di geni coinvolti in lesioni neurali e ricrescita^15,16mosche della frutta. Sono stati sviluppati diversi modelli di lesioni neurali volare, compreso adulto-testa o nervo ventrali larvale cavo (VNC) lancinante con aghi, larvale VNC o schiacciamento del nervo con forcipe, neurone larvale laser assotomia, rimozione di neuroni recettori olfattivi, espianti trauma cranico, e la lesione del nervo periferico di ala severance^{15,17,18,19,20,21,22,23}. Eccitante, recente lavoro che utilizzano modelli di lesione Drosophila hanno avanzato la nostra comprensione delle vie cellulari e genetiche utilizzati dal sistema nervoso per rispondere alle lesioni neurali, alcuni dei quali sono stati indicati per essere conservata nei mammiferi^{24 ,25}. Ancora una volta, questo sottolinea l’utilità di questo organismo di modello per identificazione di nuovi meccanismi di riparazione neurale.

Un modello del due-fotone basato su laser Drosophila larvale neurone sensoriale lesioni è descritto qui. Un laser del due-fotone fu usato per tagliare gli assoni in zebrafish in vivo nel 2003²⁶. Nello stesso anno, il primo laser dendriotomy è stato effettuato in Drosophila utilizzando un laser pulsato azoto²⁷. Poco dopo, diversi laboratori di c. elegans utilizzato con laser a femtosecondi per stabilire modelli di assone rigenerazione²⁸. Nel 2007, Wu e colleghi rispetto e segnalato le differenze fra le lesioni laser in c. elegans indotte da vari tipi di laser²⁹. Nel 2010, la rigenerazione assonale dopo lesione assonale laser era primo indicata per accadere in Drosophila³⁰. Sulla base di questa letteratura di lesioni ampie laser, abbiamo sviluppato un modello di lesioni neurali volare utilizzando il laser del due-fotone, che permette la precisa induzione della lesione per siti mirati con minima perturbazione della vicina tessuti, fornendo un ambiente relativamente pulito sistema per lo studio di entrambe le proprietà intrinseche ed estrinseche della neurorigenerazione con cella singola ad alta risoluzione. In particolare, abbiamo stabilito un insieme di metodi di pregiudizio per i neuroni sensoriali arborization dentritico (da) in entrambi sistema nervoso periferico (PNS) e sistema nervoso centrale. Da neuroni possono essere raggruppati in quattro distinte classi distingue principalmente per la loro complessità ramificazione dendrite: classe I a IV³¹. Nostro lavoro pubblicato dimostra che da rigenerazione di neurone assomiglia a modelli di lesione dei mammiferi a livello molecolare e fenotipico: neuroni da visualizzare le proprietà di rigenerazione specifico di classe, con la classe IV ma non di classe I o neuroni da III che esibiscono rigenerazione nella PNS; assoni di neuroni di classe IV da rigenerano robustamente nella periferia, ma il loro potenziale rigenerativo è drasticamente ridotto nel SNC, così simile a neuroni gangliari (DRG) radice dorsale nei mammiferi; migliorante l’attività di mTOR tramite Pten eliminazione o iperespressione di Akt migliora la rigenerazione assonale nel moscerino della CNS¹⁹. Utilizzando questo modello di ferita, ci hanno suonato schermi genetici e hanno identificato l’enzima di elaborazione del RNA Rtca come fattore inibitorio evolutivamente conservato per rigenerazione dell’assone, che collega ferita dell’assone di stress cellulare e modifica di RNA²⁰ .

Nel paradigma presentato, il pregiudizio è indotta tramite laser assotomia/dendriotomy di larvale classe IV o III da neuroni, etichettati da ppk-CD4-tdGFP o 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, rispettivamente. La ferita viene eseguita su 2^nd a 3^rd instar larve a circa 48-72 h dopo (h AEL) la deposizione delle uova. PNS assotomia la lesione è destinato alla sezione dell’assone ~ 20-50 µm lontano dal corpo cellulare, per CNS assotomia ad un’area di ~ 20 µm di diametro allo svincolo commissura in VNC e per dendriotomy ai punti di ramo dendritico primario. Il neurone stesso è imaged a 8-24 h dopo la lesione (AI) per confermare il transection completo e a 48-72 h per valutare la rigenerazione. Attraverso la formazione immagine confocal time-lapse, degenerazione e rigenerazione degli assoni/dendriti individuali che sono stati feriti in vivo possono essere monitorati nel tempo.

Protocol

1. preparazione delle piastre di coltura e delle bottiglie Preparazione delle piastre di agar di succo d’uva Aggiungere 10 g di agar in polvere, succo di uva 200ml e 192 mL ddH2O in un becher e forno a microonde per circa 4-5 minuti, mescolando in modo discontinuo fino a quando l’agar è dissolto completamente. In una cappa, raffreddare la soluzione a circa 60 ° C. Aggiungere 4,2 mL di etanolo al 95% e 4,0 mL di acido acetico glaciale. Regolare il volume totale della soluzione da …

Representative Results

Neuroni da mostrano il differenziale rigenerazione potenziale tra la periferica e del sistema nervoso centrale, come pure la specificità di classe. Questo offre l’opportunità unica di screen per nuovi fattori che sono necessari per la rigenerazione dell’assone (utilizzando la classe lesioni IV PNS), come pure quelli che sono inibitori per la rigenerazione (con lesioni snc di IV classe e classe lesione III PNS). Rigenerazione asso…

Discussion

Quando attraversa la configurazione di volo, il numero di femmine e maschi utilizzati può variare a seconda dei genotipi e il numero di larve necessarie per gli esperimenti specifici. Per le mosche WT, tipica croce utilizza 10 femmine e 5 maschi. La finestra di raccolta può essere ristretta, a seconda della precisione dell’età larve. Ad esempio, un periodo di 2 h raccolta produrrà le larve di una popolazione più omogenea. In questo caso, utilizzando 20 o più vergine femmine per impostare le croci aiuterà a produrr…

Materials

Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L	VWR	97062-948
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Grape juice	Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)	VWR	64-17-5
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent