Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Drosophila i Vivo skade modell for å studere Neuroregeneration i tilleggsutstyret og sentralnervesystemet

doi: 10.3791/57557 Published: May 5, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll med Drosophila sensoriske Nevron - dendrittiske arborization (da) Nevron skade modellen, som kombinerer i vivo live bildebehandling, to-fotonet laser axotomy/dendriotomy og kraftig fly genetisk verktøykassen, som en plattform for screening potensielle arrangører og hemmere av neuroregeneration.

Abstract

Gjenvekst kapasiteten av skadet neurons styrer neuroregeneration og funksjonelle utvinning etter nervesystemet traumer. De siste tiårene, har blitt identifisert ulike indre og ytre hemmende faktorer involvert i begrensning av axon gjenfødelse. Men er å fjerne disse hemmende signaler utilstrekkelig for vellykket gjenfødelse, indikerer eksistensen av ytterligere regulatoriske maskiner. Drosophila melanogaster, frukt fly, deler evolusjonært bevarte gener og signalveier med virveldyr, inkludert mennesker. Kombinerer kraftig genetisk verktøykassen fluer med to-fotonet laser axotomy/dendriotomy, beskriver vi her Drosophila sensoriske Nevron-dendrittiske arborization (da) Nevron skade modellen som en plattform for systematisk screening for romanen gjenfødelse regulatorer. Kort, dette paradigmet inkluderer en) utarbeidelse av larver, b) lesjon induksjon dendrite(s) eller axon(s) med en to-fotonet laser, c) live AC confocal tenkelig etter skade og d) dataanalyse. Vår modell gjør det svært reproduserbar skade enkelt merket nerveceller, axons og dendrites av veldefinerte neuronal subtyper, både i perifere og sentralnervesystemet.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Manglende evne til axons å regenerere etter en skade sentralnervesystemet (CNS), kan føre til permanente funksjonshemminger hos pasienter, og spiller også en rolle i irreversible nevrologiske underskuddene i nevrodegenerative sykdommer1,2 ,3,4,5. CNS miljøet, samt indre vekst muligheten av neurons, bestemmer om axons skal kunne generere etter traumer. Ekstracellulære faktorer fra oligodendrocyte, astroglial og fibroblastic kilder har vist seg å hemme dannes hemmer nevronal vekst4,6,7,8, men eliminere disse molekylene bare gir begrenset spirende5. Iboende gjenfødelse signaler kan påvirke regenerativ suksess5,9 og representerer potensielle terapeutiske mål, men disse prosessene er fortsatt ikke godt definert på molekylært nivå. Økninger i trophic faktor signalering eller eliminering av endogene bremser, for eksempel Pten fosfatase10, kan medføre axonal gjenfødelse i visse tilfeller. Kombinasjoner av metoder som er funnet for å være individuelt effektiv også bare gi begrenset total utvinning hittil11,12,13,14. Derfor er det desperat behov for å identifisere flere veier for målrettet terapi. Initiering av axon gjenvekst, om og hvordan axons re-wire til riktig mål, reform synapse spesifisitet, og oppnå funksjonelle utvinning er viktig ubesvarte spørsmål.

I sammendraget er nåværende forståelse av maskineriet dikterer axon gjenfødelse fortsatt svært fragmentert. Del av problemet er teknisk vanskeligheten med å studere axon gjenfødelse i pattedyr i sanntid, en tilnærming som er kostbar, tidkrevende og utfordrende for å gjennomføre omfattende genetisk skjermer. Drosophila melanogaster, derimot, har vist seg for å være en veldig kraftig system for studier av komplekse biologiske spørsmål. Har vært instrumentell definere gener og signalnettverk trasé som er påfallende bevart i mennesker og har vært en vellykket modell for studiet av menneskelige forhold, for eksempel nevrodegenerative sykdommer, gjennom store molekylær arvelighetsforskning verktøy tilgjengelig å manipulere gen funksjon15. Spesielt anses frukt fluer å være et ideelt verktøy for oppdagelsen av gener involvert i neural skade og gjenvekst15,16. Flere fly neural skade modeller har blitt utviklet, inkludert voksen-hodet eller larver ventrale nerve ledningen (VNC) knivstikking med nåler, larver VNC eller nerve forelsket med tang, larver Nevron laser axotomy, olfactory reseptor Nevron fjerning, explants hjerneskade, og eksterne nerve lesjon av vingen etterlønn15,17,18,19,20,21,22,23. Spennende, har siste arbeid utnytte Drosophila skade modeller avansert vår forståelse av mobilnettet og genetiske veier brukt av nervesystemet for å svare på neural skader, noen som har vist seg å være bevart i pattedyr24 ,25. Igjen, dette understreker nytten av denne modellen organisme for identifiserende romanen mekanismer av nevrale reparasjon.

Beskrevet her er to-fotonet laser-basert Drosophila larver sensoriske Nevron skade modell. En to-fotonet laser ble først brukt til å kutte axons i sebrafisk i vivo i 200326. Samme år, ble den første laser dendriotomy utført i Drosophila bruker en pulserende nitrogen laser27. Like etter brukt flere C. elegans labs femtosecond lasere for å etablere modeller av axon gjenfødelse28. I 2007, Wu og kolleger forhold og rapporterte forskjellene mellom laser skader i C. elegans indusert av ulike typer lasere29. I 2010, axon regenerasjon etter laser axotomy ble først vist oppstår i Drosophila30. Bygge på denne omfattende laser skade litteraturen, har vi utviklet et fly neural skade modellen med to-fotonet laser, som tillater presis induksjon av skade målrettede nettsteder med minimal forstyrrelsene for nærliggende vev, gir en relativt ren system for å studere både indre og ytre egenskapene til neuroregeneration med én celle oppløsning. Spesielt, har vi etablert et sett av skade dendrittiske arborization (da) sensoriske neurons i begge perifere nervesystemet (PNS) og CNS. Da neurons kan grupperes i fire forskjellige klasser fremstående primært av deres dendrite forgrening kompleksiteten: klasse I til IV31. Våre publisert arbeid viser at da Nevron gjenfødelse ligner pattedyr skade modeller på fenotypiske og molekylære: da neurons vise egenskaper for bestemte gjenfødelse, med klasse IV, men ikke klasse I eller III da neurons viser fornyelse i de PNS; klasse IV da Nevron axons regenerere robust i periferien, men regenerativ potensialet er dramatisk redusert i CNS dermed ligner dorsal root ganglion (DRG) nerveceller i pattedyr; forbedre mTOR aktivitet via Pten forbedrer sletting eller Akt overuttrykte axon gjenfødelse fly CNS19. Utnytte denne skade modellen, vi har vært å utføre genetiske skjermer og har identifisert RNA behandling enzymet Rtca som et evolusjonært bevarte hemmende faktor for axon gjenfødelse, knytte axon skade til mobilnettet stress og RNA modifisering20 .

I presentert paradigmet, er skaden indusert via laser axotomy/dendriotomy larver klasse IV eller III da neurons, merket med ppk-CD4-tdGFP eller 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, henholdsvis. Skaden utføres på 2nd til 3rd skikkelsen larver på rundt 48-72 h etter egglegging (h AEL). For PNS er axotomy lesjonen rettet mot delen av axon ~ 20-50 µm unna cellen kroppen, CNS axotomy til et område på ~ 20 µm i diameter på commissure krysset i VNC og dendriotomy til primære dendrittiske gren poeng. Samme Nevron er fotografert ved 8-24 h etter skade (AI) for å bekrefte komplett transection og 48-72 h AI å vurdere gjenfødelse. Gjennom time-lapse AC confocal avbildning, kan degenerasjon og regeneration av personlige axons/dendrites som har vært skadet i vivo overvåkes over tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse av kultur plater og flasker

  1. Utarbeidelse av druesaft agar plater
    1. Legge til 10 g agar pulver, 200 mL drue juice og 192 mL ddH2O i et beaker og mikrobølgeovn for ca 4-5 minutter, røring og til agar er fullstendig oppløst.
    2. I avtrekksvifte, avkjølt løsningen på ca 60 ° C. Legg 4,2 mL 95% etanol og 4.0 mL iseddik. Juster det totale volumet av løsningen på 400 mL med ddH2O. Mix også.
    3. For hver 35 mm plate, legge ca 2-3 mL av løsningen. Lage ca 120-150 platene totalt 400 mL druesaft agar løsning.
    4. Vent i 10 min å kjøle ned platene og stivne agar løsningen. Pakke druesaft agar plater i selv forseglet ziplock poser og lagre på 4 ° C for fremtidig bruk.
  2. Utarbeidelse av Drosophila kultur flasker
    1. Bruk et blad til å slå et 1,5 cm side lengde trekantet hull på en vegg av Drosophila kultur flasken og fylle hullet med en 2-2.5 cm diameter ball av bomull for ventilasjon.
    2. Koble flasken med en druesaft agar plate supplert med om 0,5 cm3 gjær lim.

2. samling av Drosophila larver

  1. Definere krysser voksen fluer
    1. Sted 10 virgin kvinner og 5 mannlig voksen flyr sammen i en kultur flaske koblet med en druesaft agar plate.
    2. Plass flaske bunnen opp ved 25° C, slik at fluer vil legge egg på druesaft agar platen. Endre platen med gjær lim inn minst en gang om dagen. En 2-h samling periode, som tillater høsting av larver av en homogen utviklingsstadiet, start med mer enn 20 jomfru kvinner og 10 menn i trinn 2.1.1.
    3. Kultur plate ved 25° C i en 60 mm Petriskål med et vått papir, for eksempel dynket i 0,5% propionsyre acid løsning. Ordne vev slik at den ikke blokkerer oksygen.
      Merk: Propionsyre acid løsningen brukes til å vedlikeholde fuktighet i retten og unngå vekst av mold.
  2. Høste larver av en bestemt alder
    1. Bruke et par pinsett for å overføre larver av ønskede scenen, for eksempel 2nd til 3rd skikkelsen larver på 48-72 h etter egglegging (jel), til en ny druesaft agar plate uten gjær pasta.
    2. Fjerne gjær fra Larvens huden ved å la dem krype rundt på ny plate, hindre potensielle forstyrrer gjær laser axotomy og bildebehandling. Alternativt, rengjør Larvene vaske dem i et fat med PBS og tørking kort på et stykke papir.

3. to-fotonet skader og AC Confocal Imaging

  1. Mikroskopet oppsett
    Merk: En AC confocal laserskanning mikroskop med en to-fotonet laser ble brukt til dette eksperimentet, men andre systemer med en tilsvarende oppsett vil også nok. To-fotonet laser (930 nm) ble brukt for å skade og en Argon laser (488 nm) ble brukt ved AC confocal avbildning av GFP.
    1. På begynnelsen av hver økt, slå på to-fotonet laser og/eller AC confocal laser(s) og mikroskopet. Åpne tenkelig programvare.
    2. For to-fotonet skade, definere følgende parametere for imaging GFP med to-fotonet laser på 930 nm (1950 mW).
      1. Velg linjen skannemodus. Åpne hullet helt. Øke laser intensiteten til ~ 20% (390 mW).
      2. Velg 512 x 512 som ramme skanningen. Bruk maksimal skannehastighet (vanligvis med pixel holdetiden på 0.77 µs). Kontroller at gjennomsnittlig antall er 1 og bitdybde er 8 biter.
      3. Angi gevinst ~ 750 og Motkonto til 0.
      4. Lagre denne pre-set eksperimentelle protokollen som 2 P GFP 930 ablasjon, muliggjør enkel gjenbruk i fremtiden eksperimenter.
    3. AC confocal bildebehandling, satt opp følgende parametere for imaging GFP med Argon laser ved 488 nm:
      1. Velg oppkjøpet kategorien og deretter Z-stack.
      2. Under "Laser", slå på strømmen for 488 nm Argon laser.
      3. Gå til kanaler, Velg 488 mm laser, og øke laser makt til 5-10%. Hullet, bruke 1-2 luftige enheten (AU). Justere forsterkningen til 650.
      4. Inne Vinningen måte, Velg 1024 x 1024 som ramme skanningen, bruker maksimal skannehastighet, en gjennomsnittlig antall 2 og bitdybde på 8 Bit.
      5. Lagre denne pre-set eksperimentelle protokollen som GFP Imaging.
  2. Larvene anestesi med diethyl ether og montering
    1. Plassere et 60 mm glass rett i en 15 cm plast Petriskål avtrekksvifte. Brett og lå et stykke papir på bunnen av glasset fatet, deretter plassere en druesaft agar plate på vev. Legge til diethyl Eter i glass fatet, til et punkt der silkepapiret gjennomvåt og det er et lag med flytende Eter igjen i fatet. Holde lokket hele tiden.
    2. Forberede et glass lysbilde med en dråpe halocarbon 27 olje i midten. Legge til 4 flekker av vakuum fett på de fire hjørnene av lysbildet senere støtte til dekkglassvæske.
    3. Bruk tang til å plukke opp en renset Larven og plassere den på agar platen i 60 mm glass parabolen. Dekke glass parabolen med sin lokk og vent til Larvene stopper flytter. PNS skade tenkelig, ta ut Larven snarest halen stopper rykninger. For CNS vente til hele Larven blir urørlig, spesielt hodet segmentene.
      Merk: Timingen Eter eksponering er kritiske. Se diskusjon.
    4. Forsiktig plukke opp bedøvet Larven og plasser den hodet-stående i halocarbon oljedråpen på lysbildet. Legge til en dekkglassvæske på lysbildet. Bruke lett trykk for å presse på dekkglassvæske, til det berører Larven (figur 1A).
    5. Justere av Larvenes posisjon ved å forsiktig trykke dekkglassvæske mot venstre eller høyre for å rulle Larvene lever slik at Nevron/axon/dendrite rundt øverst og nærmest mikroskop linsen.
    6. For PNS skade, Monter Larven dorsal side opp, slik at begge tracheas er synlige. Deretter rulle Larven ~ 30 grader til venstre for skadet klasse III da Nevron axons (figur 1B og 1 C), 90 grader på skadet klasse IV da Nevron axons (figur 1B og 1E) eller ~ 30 grader for skadet klasse IV da Nevron dendrites ( Figur 2A).
    7. For CNS skade, plasser Larven skal perfekt ventral side opp (figur 3A), slik at området rundt er nærmest til mikroskopet objektivet i z-flyet.
  3. Skade ved to-fotonet laser
    1. Plasser lysbildet med Larven under mikroskopet og sikre det på plass med lysbildeholderen på scenen. 10 X (0,3 NA) mål å finne Larven.
    2. Legge til 1 dråpe objektive olje på dekkglassvæske, bytte til 40 X (1,3 NA) mål og justere fokus.
    3. Bytte til modus for skanning og gjenbruke eksperimentelle protokollen 2 P GFP 930 ablasjon. Kontroller at hullet er åpnet helt.
      Merk: Konfigurasjonen må optimaliseres basert på enkelte systemer.
    4. Start Live -modus for å finne området rundt (ROI), og finjustere innstillingene for å oppnå god bildekvalitet med passende zoom.
      Merk: Hensikten med dette trinnet er å finne den Nevron/axon/dendrite å skade, i stedet for å ta best bilderesultat. Derfor bruke Minimmumsinnstillinger tilstrekkelig til å visualisere målområdet, for å unngå overeksponering eller photobleaching.
    5. Stopp Live skanning, slik at Beskjær -knappen blir tilgjengelig. La stillbildet som veikart. Velg beskjæringsfunksjonen og Juster vinduet skanning å fokusere på målet å bli skadet.
    6. Redusere Avkastningen skal størrelsen på webområdet potensielle skader. For eksempel bare dekk bredden av en axon eller en dendrite, å sikre presisjonen av skaden og redusere skade nærliggende vev. Hvis ønskelig, zoom inn på Avkastningen før beskjæring, slik at mer presis skade.
    7. Åpne et nytt vindu for bildebehandling. Redusere skannehastighet og øke laser intensitet. Bestemme økningen i laser intensitet basert på vev fluorescens signalet skannet i Live modus.
    8. Vanligvis angi to-fotonet laser intensitet fra 25% for PNS skader og 50-100% for VNC skade. For PNS axon skade, påse at laser intensiteten er ~ 480 mW og pixel holdetiden er 8.19 μs. Til VNC axon skaden, kontroller at laser intensitet og pixel holdetiden er vanligvis 965-1930 mW og 8.19-32.77 μs, henholdsvis.
    9. Start kontinuerlig skanning. La markøren holdes over knappen Fortløpende . Holde et øye på bildet og stoppe overflateskanningen når en drastisk økning i fluorescens er observert.
      Merk: Utseendet til fluorescens innsamlingslageret skyldes auto-fluorescens på skade området.
    10. Bytt tilbake til Live-modus ved å bruke innstillingene. Finne regionen rundt det var bare mål ved å justere fokus.
      Merk: En god indikasjon på vellykket skade er utseendet på en liten krateret, ring-lignende struktur eller lokaliserte rusk rett ved skade området.
    11. Flytte til neste Nevron gjenta fra trinn 3.3.5, til skade flere nerveceller i en enkelt dyr. Eller gjenta trinn 3.3.5 mens gradvis makt og/eller redusere skannehastighet hvis første skaden var utilstrekkelig.
      Merk: I tilfelle at laser makt er også høy, et stort skadet område vises i bildet etter skade live skanning. For mye skade kan føre til at larvene.
    12. Gjenopprette Larven nøye fjerne dekkglassvæske og overføre skadet Larven på en ny plate med gjær lime. Grøft flere grotter på agar tallerkenen med tang; Alternativt kan du ta en øy av agar i stedet for med hele platen, for å redusere muligheten for Larven krypende ut av platen.
    13. Plasser platen i en 60 mm Petriskål med papir (fuktet med 0,5% propionsyre acid løsning) og kultur i romtemperatur eller 25° C.
      Merk: Larven vil forbli i larvestadiet for ca en ekstra dag ved romtemperatur (22° C) sammenlignet på 25° C.
  4. Etter skade AC confocal imaging
    1. Bilde skadet Larven på ønsket tidspunkt ved å forberede Larven bruke den samme fremgangsmåten anestesi og montering i trinn 3.2, deretter tenkelig med AC confocal laser.
      Merk: Image Larven 24 timer etter skade (AI) å bekrefte axonal skade og 48t AI (klasse IV da nevroner) eller 72 h AI (klasse III da nevroner) å vurdere gjenfødelse.
    2. Finn Larven med 10 X målet, deretter bytte til en 25 X (0,8 NA) mål. Bruke eksperimentelle protokollen GFP Imaging.
    3. Klikk Live og finne samme Nevron skadet tidligere.
    4. Angi de første og siste Z stillingene i vinduet live skanning. Trykk stopp og klikk Start eksperimentere for å erverve en Z-stack bilde.
      Merk: Sørg for at en normalisering punkt (axon konvergerende punktet) er inkludert når du tar bilder slik at kvantifisering av gjenfødelse er mulig (figur 1 d, 1F)-Dette er omtalt i delen data analyse.
    5. Bytte til Image Processing, velge bildet bare tatt og generere en maksimale intensitet projeksjon. Lagre både z stabel og maksimale intensitet projeksjon bilder.

4. dataanalyse

  1. Behandle og kvantifisere bilder ved hjelp av enten tenkelig programvare eller ImageJ.
  2. Kvantifisering av axon gjenfødelse PNS
    1. Beregne gjenfødelse prosentandelsom refererer til prosent av regenererende axons blant alle axons som var lesioned. Resultat en axon som regenererer så lenge det regrows utover skade området.
    2. Mål gjenfødelse lengde, som er økningen i axon lengde. Hvis kvantifisere med ImageJ, bruk Segmentert linje -verktøyet til å spore Spartments axon og bruke mål i rullegardinmenyen analyser for å få lengden på linjen som representerer Spartments axon.
    3. Beregne Gjenfødelse indeksen, som er økningen i normalisert axon lengde.
      Merk: Axon lengde er normalisert av avstanden mellom celle kroppen og axon konvergerende punkt (DCAC)-axon lengde/DCAC (figur 1 d og 1F). Denne verdien hjelper konto for alle axonal vekst som skyldes larver skalering. En positiv verdi representerer gjenfødelse, verdien 0 betyr ingen gjenfødelse, og en negativ verdi betyr retraksjon.
  3. Kvantifisering av dendrite gjenfødelse
    1. Beregne gjenfødelse, som er prosent av da neurons blant alle de kuttet som viser åpenbare dendrite gjenvekst.
      Merk: Dendrite gjenvekst er scoret som positivt om nytt dendrites regrow ut fra trukket inn dendrittiske stammen og utover skade området. Skade området er bestemt av landemerker, og i noen tilfeller, er synlig på grunn av den gjenværende skade-indusert autofluorescence.
    2. Beregne øke gren poeng, som teller tillegg av nye dendrittiske gren poeng etter skader.
    3. Beregne øke totale dendrite lengde, som er den akkumulerte lengden for alle nye dendrites lagt etter skader.
  4. Kvantifisering av axon fornyelse i CNS
    Merk: Hvis en lesjon nettstedet viser degenerasjon på første gang punktet fotografert (figur 3B), vil det inkluderes i analysen av gjenfødelse lengde og hastighet.
    1. Mål gjenfødelse lengde, som er regrowing axon.
      Merk: Regrowing axon av en enkelt lesjon området identifiseres som det kommer av den opprinnelige axon ruten før skaden.
    2. Beregne Normalized gjenfødelse lengde, som normaliserer gjenfødelse lengden lengden på commissure segment - langsgående avstanden mellom commissures ("Y" i figur 3A og 3B).
      Merk: Denne verdien hjelper riktig for effekten av larver størrelse forskjeller.
    3. Beregne gjenfødelse rate, som er prosent av regenererende segmenter blant alle segmentene som var lesioned, å reflektere gjenfødelse kapasiteten til et bestemt genotype.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Da neurons viser differensial gjenfødelse potensial mellom perifere og sentrale nervesystemet, samt klasse spesifisitet. Dette gir unike muligheter til skjermen for romanen faktorer som kreves for axon gjenfødelse (med klasse IV PNS skade), i tillegg til de som er hemmende for gjenfødelse (med klasse IV CNS skade og klasse III PNS skade).

Axon gjenfødelse PNS

Som et eksempel, er karakterisering av regenerering av klasse III og klasse IV da neurons beskrevet. Disse neurons ligger bilateralt i hver kropp segmentet. Flere neurons kan bli skadet i samme Larven; vanligvis 3-4 nerveceller i høyre side av abdominal segmenter A7-A2. Klasse III og klasse IV da neurons kan visualiseres 19-12-Gal4, UAS-CD4tdGFP, repo-Gal80 og ppk-CD4tdGFP, henholdsvis. Bedøve og montere 48-72 h AEL larver som beskrevet, justerer plasseringen til Larvene slik at da neurons rundt vender (figur 1A og 1B). Vi skade vanligvis klasse III ddaF og klasse IV v'ada neurons (figur 1 c og 1E). Utføre axotomy og gjenopprette larver som beskrevet. Kort tid etter skade (AI), vil Larvene ha utvinnes fra kirurgi og utstillingen normal bevegelse. Her er typisk over 80%. Kast larver som er døde eller syk. Monter resten som beskrevet og vurdere degenerasjon. På 24 h AI, distale axons bør ha fullført degenerasjon denne tidspunkt19og axon stammen vil være synlig (figur 1 d og 1F). Reimage samme Larvene 48t AI for klasse IV da nerveceller eller 72 h AI klasse III da neurons å vurdere gjenfødelse. Vi ønsker vanligvis å vurdere minst 20 skadet neurons per eksperimentelle betingelse. I (wild type) WT dokumentert dyr, mens vanligvis ~ 70% av kuttet klasse IV da neurons vil ha regenerert utover skade området (figur 1F), klasse III da neurons mislykkes å regrow, av vekst cone stoppet (figur 1 d).

Dendrite fornyelse

Vi utfører vanligvis dendriotomy på klasse IV da neurons ddaC (figur 2A). Som vist i skjematisk diagram, er skaden rettet mot primære dendrittiske forgreningspunktet. Basert på erfaring, når skadet på 48t AEL, generere ~ 50% av ddaC neurons sin dendrites (figur 2B). I de resterende 50%, nærliggende dendrites invadere og dekke den ledige plassen. I tillegg reduseres gjenfødelse potensialet av disse neurons hvis skadet på en senere utviklingsstadiet.

Axon fornyelse i CNS

For VNC axon skade, overlevelse av Larvene varierer betydelig og avhenger av alder som skader er indusert. Basert på erfaring, larvene 48-72 h AEL har vanligvis den høyest overlevelsesgraden (> 60%) blant de ulike fasene testet. Larvene yngre enn 48t AEL overleve dårlig etter skader, mens de eldre enn 72 h AEL er det vanskelig å innføre skade i VNC. Videre er det enklere å indusere skader på de bakre commissure segmentene enn det fremre, disse bakre segmentene VNC er nærmere ventrale overflaten og dermed mer tilgjenglig for laser (figur 3A).

For å skade klasse IV da Nevron axons i CNS, montere Larvene som beskrevet tidligere (figur 3A). Under mikroskopet, finne stigen-lignende strukturen av axon bunter som inngår VNC (figur 3A), og utfør axotomy som beskrevet. Degenerasjon bekreftes på 8 h AI og regeneration vurderes på 24 og 72 h AI. Som vist i figur 3B, axons på 8 h AI har allerede begynt å degenerert, og på 24 h AI, axon gjenfødelse er observert mens axon rusk kan fortsatt bli funnet rundt webområdene skade. WT axons vise begrenset gjenvekst i VNC og klarer å koble hullene generert av skaden (figur 3B). For å kvantifisere gjenfødelse evne til skadde axons, brukes hvor gjenvekst etter skade måles og lengden på commissure segmentet (Y i figur 3A) for normalisering (Figur 3 c).

Figure 1
Figur 1: Da Nevron axon gjenfødelse i periferien viser klasse spesifisitet. (A og B) Skjematisk tegning viser plasseringen av larvene. (C) skjematisk tegning av klasse III da neurons. (D) Axons av klasse III da neurons ddaF, merket med 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80 / +, ikke regrow. (E) skjematisk tegning av klasse IV da neurons. (F) Axons av klasse IV da neurons v'ada, merket med ppk-CD4-tdGFP / +, regrow utenfor lesjon området. (D og F) Rød linje angir axon lengden mens grønne stiplet linje markerer avstanden mellom celle kroppen og axon konvergerende punkt (DCAC). Den blå prikken markerer axon konvergerende poenget. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Da neuron dendrite gjenfødelse. (A) illustrerende representasjon av klasse IV da neurons. (B) illustrerende representasjon av dendrite fornyelse i klasse IV da neuron ddaC, merket med ppk-CD4-tdGFP / +. Laser ablasjon er rettet mot primære forgreningspunktet og er gjennomført på 48 h AEL. På 24 h AI skade transection av neurite er bekreftet, og på 72 h AI gjenfødelse er kvantifisert. Dendrites av ddaC neurons viser betydelig gjenvekst, med nye dendrittiske grener spirende fra kuttet stammen å flis den ledige plassen. Det er verdt å merke seg at nye terminal grener legges kontinuerlig til uskadet dendrites på denne utviklingsstadiet. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Da Nevron axon gjenfødelse VNC. (A) skjematisk tegning av en Drosophila Larven montert på et lysbilde og fotografert under mikroskopet. Klasse IV da Nevron axons i VNC visualisert i en ppk-CD4tdGFP / + larve. To kandidaten commissure segmenter vises i zoomet inn bildet og skjematisk tegning. Hver av dem har to skade områder (røde sirkler). (B) AC Confocal bilder av en skadet segmentet fotografert på 8, 24 og 72 h etter skade (AI). Røde linjer viser regrowing axons. (C) måling og normalisering av Etterveksten axons. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Når definere fly krysser, kan antallet hunner og hanner brukt variere avhengig av genotyper og antall Larvene trengs for spesifikke eksperimenter. WT fluer bruker typisk tvers 10 kvinner og 5 menn. Vinduet samling kan være smalere, avhengig av nøyaktigheten av Larvene alderen som kreves. En 2-h samling perioden vil for eksempel gi larver av mer homogene innbyggere. I dette tilfellet vil bruker 20 eller mer jomfru kvinner til å definere kors bidra til å gi tilstrekkelig egg. Avkastning fra første dag som regel er liten, så samle platen med egg to eller flere dager etter å sette opp kammeret. Når ytterligere dyrking platen med egg, anbefales det å suge vevet i 60 mm Petriskål i 0,5% propionsyre acid løsning i stedet for vann, som ikke bare hjelpe opprettholde fuktighet i parabolen men også unngå vekst av mold.

Når enhetene for Larvene anestesi og montering, må du bruke et glass rett fordi Eter smelter gjennom plast. Glass rett ligger i en 15 cm plast Petriskål ved en lekkasje. Silkepapiret beholder Eter i parabolen slik at larvene kan bli effektivt slått ut av Eter damp. Gult slippe flasker for å lagre dele Eter og legge til ether i dråper med glass dropper anbefales. Fylle Eter og alltid holde et lag med flytende Eter på bunnen av parabolen for optimal effekt.

Tidspunktet for Eter eksponering er kritisk: under anestesi vil føre til Larven utvinning i midten av tenkelig økt og ustø bilder; en bedøvelse overdose, eller direkte kontakt med Eter væsken, får dødelighet. For å maksimere overlevelse og suksessrate, vår tommelfingerregel er som følger: PNS skade tenkelig, ta ut Larven snarest halen stopper rykninger; for CNS vente til hele Larven blir urørlig, spesielt hodet segmentene. Selv en liten bevegelse vil forstyrre skader og avbilding av VNC axons. Eldre Larvene tendens til å ta lengre tid å slå ut. Det tar vanligvis mindre enn 2 minutter for Larvene yngre enn 72 h AEL og 2-5 minutter for Larvene eldre enn 72 h AEL.

Når du setter opp intensiteten av to-fotonet laser for skade, bestemmes verdien av vev fluorescens signalet fra "Live" skanningen. Skaden er introdusert av "Kontinuerlig" skanning som i trinn 3.3. Skade-indusert økning i fluorescens skyldes autofluorescence på skade området og fungerer som en god indikator på etterlønn av neurite. Vanligvis tar det 1-10 s se fluorescens innsamlingslageret. Det er viktig å kontrollere skanningen tid når fluorescens er opphøyet. For PNS skade er det viktig å stoppe skanning umiddelbart. Langvarig eksponering vil forstørre skaden nettstedet og skade nærliggende vev. Dette gir imidlertid muligheten til å justere skanning og manipulere alvorlighetsgraden av skaden. En vellykket skade bør ha en lesjon størrelse diameter mindre enn 3-4 μm. For VNC axon skade, VNC axons er innebygd mye dypere forhold til da Nevron PNS axons/dendrites, som er rett under huden, og dermed krever høyere laser intensitet. Vi la vanligvis skanningen på i noen sekunder. Dette er å sikre at hele axon bunt er kuttet. Hvis radius av webområdene lesjon er mer enn halvparten av bredden av commissure bunt, regnes slike skader nettsteder som mislykket. Slike Larven har en lav overlevelse og vil ikke bli inkludert i analysen.

For axon regenerasjon er gjenfødelse like over larver stadier. Men for dendrite regenerasjon etter et enkelt dendrite kutt, fornyelse potensielle reduseres etter 72 h AEL19. Dermed utføres vanligvis axon skade på 48 h - 72 h AEL og dendrite skader på 48t AEL, med vurdering av gjenfødelse på 120 timer AEL. Larvene 24 h AEL kan også brukes, men de krever mer forsiktig håndtering, gitt sin mindre størrelse. Larvene forpuppe seg etter 120 h AEL, gjør imaging mer utfordrende. Derfor er våre endepunkt vanligvis 120 timer AEL.

Hva er sammenhengen mellom degenerasjon og regeneration? For PNS skade, på 24 h AI, har normalt den distale axon/dendrite i WT gjennomført Wallerian degenerasjon mens gjenfødelse ikke startet på dette tidspunkt. Derfor tror vi at WT larvene, degenerasjon av kuttet neurites bare har en svært begrenset innvirkning på gjenfødelse, hvis aktuelt. For VNC skade, axons på 8 h AI har allerede begynt å degenerert, og på 24 h AI, axon gjenfødelse er observert mens axon rusk kan fortsatt bli funnet rundt webområdene skade. Rusk synes ikke å blokkere gjenfødelse. Det er imidlertid mulig at under visse omstendigheter, kan det være en overlapping eller selv en crosstalk mellom degenerasjon og regeneration. Faktisk har det blitt rapportert at i alderen mus, rusk klaring etter eksterne nerveskader er tregere enn i små dyr. Samtidig, ble tregere reinnervation av nevromuskulær krysset observert, som kan knyttes til større antall hindringer regenererende axons møte i gamle dyrene. Overraskende, men axons fra alderen dyr regenerere raskt og reinnervate nevromuskulær krysset nettsteder effektivt når ikke konfrontert med rusk32. Dette tyder på at tilrettelegge rusk klaring kan være en potensiell strategi å fremme regenerering.

Sammenlignet med andre neuroregeneration modeller, har fly sensoriske Nevron skade modellen unike fordeler. Musen modeller vanligvis tar uker å måneder å utføre og egner seg ikke for å gjennomføre omfattende genetisk skjermbildene. C. elegans bare har en primitiv sentralnervesystemet som ikke kanskje er tett recapitulate gjenfødelse barrierene i pattedyr CNS; forskjellig fra pattedyr, sebrafisk CNS axons regenerere robust. Rask livet syklus av fluer, allsidighet av fly genetikk, tilgjengelighet og stereotype mønstre axons/dendrites av fly sensoriske neurons, og de karakteristiske regenerering av fly sensoriske neurons-undertype bestemt fornyelse i de PNS og begrenset gjenfødelse CNS-gjør Drosophila da neurons en attraktiv modell for å studere neuroregeneration. Videre foreslå studier fra knust musen retinal ganglieceller (RGCs) også at neuronal subtyper bærer tydelig gjenfødelse kompetanse; noen RGC undertyper kan regenerere, mens andre i tilsynelatende homogen nerve bundle mislykkes å regrow33. Dette viktig funn antyder at neuronal spesifikk strategier skal utnyttes for å fremme regenerering og funksjonelle utvinning og argumenterer sterkt at induksjon av axon skade og påfølgende fornyelse analyse skal utføres i en neuronal undertype-spesifikk måte. Videre forblir cellulære og molekylære determinants for denne gjenfødelse type-spesifisitet hovedsakelig ukjent19,33. Derfor, da Nevron skade modellen tilbyr ideelle paradigmet for å håndtere disse spørsmålene.

Sammenlignet med axon gjenfødelse, er studier med fokus på dendrite gjenfødelse mye knappere. Dendrite skader oppstår, som traumatisk hjerneskade, slag og mange former for neurodegeneration, men nesten ingenting er kjent om dendrites' evne til å reparere og reformere nevrale forbindelser. Da Nevron skade modellen igjen gir en svært tilgjengelig system som viser stereotype mønstre, klasse spesifisitet og tidsmessige regulering19, for å utforske denne retningen.

Det er også verdt å nevne at det er mulig å skade et merket enkelt axon i PNS, måten skaden er utført i CNS fører til lesjonen av masse axons. Eventuelt MARCM34 eller FLP ut klone35 tilnærming kan brukes til å merke ett axons i CNS. I tillegg når gliacellene samtidig merket med mRFP (Repo-Gal4, UAS-mRFP), er akkumulering av glia prosesser observert spesielt på lesjon området. Videre uttrykk for Ptp99A, den fly homolog av chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG) phosphacan / PTPRZ1, er opp-regulert på lesjon området. Ptp99A co regionaliserer med gliacellene og omgir skade området, danner en ring-lignende struktur lik hva er rapportert for astroglial arr i pattedyr19,36,37. Avslutningsvis gjør da Nevron skade modellen, kombinert med markører for andre celletyper som gliacellene eller immunceller, i vivo sanntids overvåking flercellet interaksjonene mellom en skadet Nevron og dens omkringliggende miljø.

Mens denne fly larver sensoriske Nevron skade modellen gir oss muligheter til å finne potensielle neuroregeneration regulatorer både i PNS og CNS, likevel har flere begrensninger. Først, det er ikke av høy gjennomstrømning på det nåværende utviklingstrinn. Vanligvis kan 5-6 genotyper bli vist av en person i en uke. Det må være optimalisert for å utføre en upartisk skjermen. Andre, som Eter narkose på Larvene kan vare fra flere min til mer enn 20 min, er det ikke optimalt for langsiktig bildebehandling. Dermed er bestemte tidspunkt som er representant for axon degenerasjon og regeneration henholdsvis valgt for bildebehandling. Fullstendig tredje, selv om denne protokollen introduserer en måte å skade axons nøyaktig, muligheten for skade på omkringliggende vev kan ikke utelukkes. I VNC kan disse vev gliacellene axons og dendrites av andre neurons. For å minimere denne potensielle påminnelse, vi minimere skade nettsteder, bruke lavest laser makt mulig og utføre de samme fremgangsmåtene parallelt med både kontrollere og eksperimentere grupper. Fjerde, i ferd med å sette opp CNS skade paradigmet, ulike skade områder ble testet, inkludert områdene nær axon termini at vi valgte å bruke og posten peker på axons VNC. Inngangspunkter ble funnet for å være vanskeligere å skade fordi de dypere i vevet og mer sannsynlig å flytte. Dermed disse praktiske årsaker velger vi den gjeldende metoden, som er mer konsekvent bedre kontrollert og bra for større skala eksperimenter. En potensiell bekymring, er som nevnt ovenfor, muligheten for skade nærliggende vev, som postsynaptic komponentene og gliacellene. På den annen side, er det en enestående spørsmålet hvordan skadet omkringliggende vev påvirke degenerasjon og regeneration av axons. For eksempel hvordan glial arret påvirker axon gjenfødelse. Dette gir en annen grunn til hvorfor våre skade modellen kan likne skade modeller i pattedyr, der axons og vev rundt webområdene lesjon er vanligvis skadet samtidig.

Laser skade etterfulgt av time-lapse mikroskopi er en følsom analysen for å studere axon/dendrite gjenfødelse. Et hovedanliggende for denne analysen er imidlertid oppfattet prisen, som spenner fra <$ 10K for low-end SSD puls lasere, $25-100K for femtosecond lasere til >$ 100K på to-fotonet lasere. Det er flere gode diskusjoner om ulike laser systemer brukes for axotomy29,38,39,40,41,42,43, 44 , 45. for å oppsummere, konvensjonelle lasere er optimale for skjæring axons innenfor om 30-50 µm fra overflaten. Det vil være flere sivile tap med de nano og pico andre lasere sammenlignet med femtosecond laser, særlig ettersom dybden på målområdet øker45. For skadet axons i VNC, dybden som er vanligvis rundt 50-100 µm, er det viktig å minimere skade på vev. I dette tilfellet to-fotonet laseren er ideell, som fokuserer laser makt til fokalplanet, redusere sivile vevsskade uten akkord vev penetrasjon. Som konklusjon, to-fotonet systemet er kostbar, men tilbyr beste presisjon og vev bevaring. Men hvis bare PNS axons er målet for axotomy, kan konvensjonelle puls lasere være et rimeligere alternativ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Jessica Goldshteyn for kundestøtte. Arbeid i sangen lab er finansiert av NIH grant R00NS088211, og de intellektuelle og utviklingsmål funksjonshemminger Research Center (IDDRC) ny Program Development Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous Acros Organics AC615080010
Halocarbon 27 Oil Genesee Scientific 59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L VWR 97062-948 
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM VWR AAA10752-36
Grape juice Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) VWR 64-17-5
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Propionic Acid J.T.Baker U33007
Cover Glasses: Rectangles Fisher Scientific 12-544-D 50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope Zeiss
Zen software Zeiss
Chameleon Ultra II Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yakura, J. S. Recovery following spinal cord injury. (1996).
  2. Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury? Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
  3. Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
  4. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
  5. Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. (2010).
  6. Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
  7. Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
  8. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  9. He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
  10. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
  11. Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
  12. Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
  13. Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
  14. Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
  15. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
  16. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  17. Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
  18. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
  19. Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
  20. Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
  21. Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
  22. Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
  23. Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
  24. Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
  25. Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
  26. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
  27. Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
  28. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
  29. Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
  30. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
  31. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
  32. Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
  33. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
  34. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  35. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
  36. Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
  37. McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
  38. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
  39. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
  40. Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
  41. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
  42. O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (2009).
  43. Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
  44. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
  45. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. (2011).
<em>Drosophila i Vivo</em> skade modell for å studere Neuroregeneration i tilleggsutstyret og sentralnervesystemet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, D., Li, F., Guttipatti, P., Song, Y. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. (135), e57557, doi:10.3791/57557 (2018).More

Li, D., Li, F., Guttipatti, P., Song, Y. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. (135), e57557, doi:10.3791/57557 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter