Un modelo de lesión de Drosophila en Vivo para el estudio de Neurorregeneración en el periférico y sistema nervioso Central

Summary

Aquí, presentamos un protocolo usando Drosophila neurona sensorial – modelo de lesión de neurona arborización dendrítica (da), que combina en vivo en vivo la proyección de imagen, dos fotones láser axotomía/dendriotomy y potentes herramientas genéticas mosca, como una plataforma para la detección de potenciales promotores e inhibidores de Neurorregeneración.

Abstract

La capacidad de regeneración de neuronas dañadas gobierna Neurorregeneración y recuperación funcional después del trauma del sistema nervioso. En las últimas décadas, se han identificado varios intrínsecos y extrínsecos inhibidoras factores implicados en la restricción de la regeneración del axón. Sin embargo, simplemente quitando estas señales inhibidoras es insuficiente para la exitosa regeneración, indicando la existencia de maquinaria reguladora adicional. Drosophila melanogaster, la mosca de la fruta, comparte genes evolutionarily conservados y vías de señalización con vertebrados, incluyendo a seres humanos. Combinando la potente caja de herramientas genética de moscas con dos fotones láser axotomía/dendriotomy, Describimos aquí la neurona sensorial de la Drosophila – modelo de lesión de la neurona arborización dendrítica (da) como una plataforma para la detección sistemática de novela reguladores de la regeneración. Brevemente, este paradigma incluye a) la preparación de las larvas, la inducción b) lesión a dendrite(s) o axon(s) usando un láser de dos fotones, c) vivo confocal imagen después de la lesión y d) análisis de datos. Nuestro modelo permite lesiones altamente reproducible de solo etiquetadas neuronas, axones y dendritas de subtipos neuronales bien definidos, en el sistema nervioso central y periférico.

Introduction

La incapacidad de los axones para regenerar después de una lesión al sistema nervioso central (SNC), puede llevar a incapacidades permanentes en los pacientes y también desempeña un papel en el déficit neurológico irreversible en enfermedades neurodegenerativas^{1,2 ,3,4,5}. El entorno de la CNS, así como la capacidad de crecimiento intrínseco de las neuronas, determina si los axones son capaces de regenerar después de trauma. Factores extracelulares de oligodendrocyte astroglial y fibroblásticas fuentes ha demostrado que impiden el crecimiento neuronal^4,6,7,8, pero la eliminación de estas moléculas sólo permite limitado brote⁵. Las señales de regeneración intrínseca pueden influir en éxito regenerativa^5,9 y representan potenciales dianas terapéuticas, pero estos procesos son todavía no bien definidos a nivel molecular. Aumento de factor trófico señalización o eliminación de frenos endógenos, tales como la fosfatasa Pten¹⁰, puede resultar en la regeneración axonal en determinadas circunstancias. Combinaciones de diferentes métodos individualmente efectivo también sólo proporcionan recuperación global limitada hasta la fecha^11,12,13,14. Por lo tanto, hay una necesidad desesperada para identificar vías adicionales de terapia dirigida. Además de la apertura del nuevo crecimiento del axon, si y cómo los axones Re-cablea el objetivo correcto, especificidad de la sinapsis de la reforma y lograr la recuperación funcional son importantes preguntas sin respuesta.

En Resumen, la comprensión actual de la maquinaria que dictan la regeneración del axón es todavía muy fragmentaria. Parte del problema es la dificultad técnica de estudiar axon regeneración en los mamíferos en tiempo real, un enfoque que es costoso, desperdiciador de tiempo y desafiante para la realización de pantallas genéticas a gran escala. Drosophila melanogaster, por el contrario, ha demostrado para ser un sistema excepcionalmente poderoso para el estudio de cuestiones biológicas complejas. La mosca de la fruta ha sido fundamental en la definición de genes y vías que sorprendentemente se conservan en los seres humanos de señalización y ha sido un modelo exitoso para el estudio de las condiciones humanas, tales como las enfermedades neurodegenerativas, a través de las herramientas de genética molecular amplia disponible para manipular genes función¹⁵. En particular, moscas de la fruta se consideran una herramienta ideal para el descubrimiento de genes implicados en lesiones neurales y rebrote^15,16. Se han desarrollado varios modelos de mosca lesiones neurales, incluyendo cabeza de adulto o larvario ventral nervio cuerda (VNC) punzante con agujas, VNC larval o aplastamiento del nervio con fórceps, neurona larvas láser axotomía, eliminación de neuronas receptoras olfatorias, explantes craneoencefálico, y lesión del nervio periférico por ala indemnización por^{15,17,18,19,20,21,22,23}. Emocionante, trabajo utilizando Drosophila lesiones modelos recientes han avanzado nuestra comprensión de las vías celulares y genéticas utilizados por el sistema nervioso para responder a lesiones neuronales, algunos de los cuales se han demostrado para ser conservado en mamíferos^{24 ,25}. Una vez más, esto pone de relieve la utilidad de este organismo modelo para identificables nuevos mecanismos de reparación neuronal.

Descrito aquí es un modelo de lesión larvas neurona sensorial de dos fotones láser Drosophila . Un láser de dos fotones primero fue utilizado para cortar axones en el pez cebra en vivo en 2003²⁶. En el mismo año, el primer dendriotomy de láser fue realizada en Drosophila utilizando un láser de nitrógeno pulsado²⁷. Poco después, varios laboratorios de C. elegans utilizan láseres de femtosegundo para establecer modelos de axón regeneración²⁸. En 2007, Wu y sus colegas compararon e informaron las diferencias entre lesiones del laser en C. elegans inducida por varios tipos de láseres²⁹. En 2010, regeneración del axón tras axotomía láser era primer demostrada en Drosophila³⁰. Basándose en esta literatura de lesión extensa láser, hemos desarrollado un modelo de mosca lesiones neurales utilizando el láser de dos fotones, que permite la inducción precisa de la lesión a sitios específicos con mínima perturbación de los vecinos de los tejidos, proporcionando un relativamente limpio sistema para el estudio de las propiedades intrínsecas y extrínsecas de Neurorregeneración con resolución unicelular. En concreto, hemos establecido un conjunto de métodos de lesión de las neuronas sensoriales de la arborización dendrítica (da) en tanto el sistema nervioso periférico (PNS) y CNS. Da las neuronas pueden agruparse en cuatro clases distintas que se distingue principalmente por su complejidad de dendrita ramificación: clase I a IV³¹. Nuestro trabajo publicado muestra que la regeneración de neuronas da se asemeja a modelos de lesión mamíferos a nivel fenotípico y molecular: las neuronas da mostrar las propiedades de regeneración específica de clase, con clase IV pero no clase I o III da neuronas exhibiendo la regeneración en el PNS; axones de neuronas de clase IV da regeneración robusta en la periferia, pero su potencial regenerativo se reduce drásticamente en el SNC, así asemejándose a las neuronas de ganglio (DRG) de la raíz dorsal en mamíferos; mejorar la actividad de mTOR través de Pten eliminación o sobreexpresión de Akt mejora la regeneración del axón en la mosca del CNS¹⁹. Utilizando este modelo de la lesión, han estado llevando a cabo pantallas genéticas y han identificado la enzima del procesamiento del RNA Rtca como factor inhibitorio evolutivamente conservado para la regeneración del axón, a lesión del axón al estrés celular y modificación de RNA²⁰ .

En el paradigma actual, la lesión es inducida por láser axotomía/dendriotomy de larvas clase IV o III da neuronas, etiquetadas por ppk-CD4-tdGFP o 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, respectivamente. La lesión se realiza en 2^nd a 3 larvas de estadio de^rd en alrededor de 48-72 h después de la postura (h AEL). Para PNS axotomía la lesión está dirigida a la sección del axón ~ 20-50 μm lejos del cuerpo celular, axotomía CNS a un área de ~ 20 μm de diámetro en el cruce de la comisura en el VNC y para dendriotomy a los puntos de ramificación dendrítica primaria. La misma neurona está reflejada en el 8-24 h después de la lesión (AI) para confirmar el transection completo y a las 48-72 h AI evaluar la regeneración. A través de la proyección de imagen confocal de lapso de tiempo, la degeneración y la regeneración de axones individuales/dendritas que han sido heridos en vivo pueden ser monitoreados en el tiempo.

Protocol

1. preparación de placas y botellas Preparación de las placas de agar jugo de uva Añadir 10 g de polvo de agar, zumo de uva 200 mL y mL 192 Dec2O en un vaso y microondas por unos 4-5 min, revolviendo intermitentemente hasta que se disuelva completamente el agar. En una campana de humos, enfriar la solución a aproximadamente 60 ° C. Añadir etanol al de 95% mL 4,2 y 4,0 mL de ácido acético glacial. Ajustar el volumen total de la solución de 400 mL con ddH2O. mezcl…

Representative Results

Las neuronas da muestran regeneración diferencial potencial entre el periférico y sistema nervioso central, así como especificidad de clase. Esto proporciona oportunidades únicas para detectar nuevos factores que se requieren para la regeneración del axón (utilizando la clase lesión IV ENP), así como aquellos que son inhibitorios para la regeneración (con lesiones de clase IV CNS y clase lesión III PNS). Regeneración del…

Discussion

Cuando cruza la configuración de vuelo, el número de hembras y machos utilizados puede variar dependiendo de los genotipos y el número de larvas para experimentos específicos. Para moscas de la WT, Cruz típico utiliza 10 hembras y 5 machos. La ventana colección puede ser reducida, dependiendo de la exactitud de la edad de las larvas requerida. Por ejemplo, un período de 2-h colección darán larvas de una población más homogénea. En este caso, utilizando 20 o más vírgenes hembras para configurar las cruces le…

Materials

Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L	VWR	97062-948
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Grape juice	Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)	VWR	64-17-5
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent