En Drosophila In Vivo skada modell för att studera Neuroregeneration i perifera och centrala nervsystemet

Summary

Här presenterar vi ett protokoll med de Drosophila sensoriska neuron – dendritiska arborization (da) neuron skada modell, som kombinerar i vivo live imaging, två-photon laser axotomy/dendriotomy och kraftfull flyga genetiska verktygslådan, som en plattform för screening potentiella projektansvariga och hämmare av neuroregeneration.

Abstract

Återväxt kapaciteten av skadade nervceller reglerar neuroregeneration och funktionell återhämtning efter nervsystemet trauma. Under de senaste decennierna, har olika inre och yttre hämmande faktorer inblandade i begränsningen av axon förnyelse identifierats. Helt enkelt ta bort dessa hämmande signaler är emellertid otillräckliga för framgångsrika regenerering, som visar förekomsten av ytterligare reglerande maskiner. Drosophila melanogaster, bananflugan, delar evolutionärt bevarade gener och signalvägar med ryggradsdjur, inklusive människan. Kombinera kraftfull genetisk verktygslådan av flugor med två-photon laser axotomy/dendriotomy, beskriver vi här Drosophila sensoriska neuron – dendritiska arborization (da) neuron skada modell som en plattform för systematiskt screening för roman regenerering regulatorer. Kort, detta paradigm omfattar en) utarbetande av larver, b) lesion induktion till dendrite(s) eller axon(s) med en två-photon laser, c) live confocal imaging efter skada och d) dataanalys. Vår modell gör mycket reproducerbara skada enda märkt nervceller, axoner och dendriter av väldefinierade neuronala undertyper, i både perifera och centrala nervsystemet.

Introduction

Axons oförmåga att regenerera efter en skada det centrala nervsystemet (CNS), kan leda till permanent funktionsnedsättning hos patienter, och spelar också en roll i de irreversibla neurologiska bortfall i neurodegenerativa sjukdomar^{1,2 ,3,4,5}. CNS miljön, liksom inneboende tillväxt förmågan av nervceller, avgör om axoner är att regenererar efter trauma. Extracellulära faktorer från oligodendrocyte, astroglial och fibroblastic källor har visat sig hämma nervcellernas tillväxt^4,6,7,8, men i eliminering av dessa molekyler endast tillåter begränsad groning⁵. Inneboende regenerering signaler kan påverka regenerativ framgång^5,9 och representerar potentiella terapeutiska mål, men dessa processer är fortfarande inte väldefinierade på molekylär nivå. Ökningar av trofiska faktor signalering eller eliminering av endogena bromsar, såsom Pten fosfatas-¹⁰, kan resultera i axonal förnyelse under vissa omständigheter. Kombinationer av olika metoder som visat sig vara individuellt effektivt också endast ge begränsad total återhämtning hittills^11,12,13,14. Därför, det finns ett desperat behov att identifiera ytterligare vägar för riktad terapi. Förutom inledande av axon återväxt, huruvida och hur axoner re-tråd till rätt mål, reformen synaps specificitet, och uppnå funktionell återhämtning är viktiga obesvarade frågor.

Sammanfattningsvis är aktuell kunskap om de maskiner som dikterar axon regenerering fortfarande mycket fragmentariska. Del av problemet är den tekniska svårigheten av att studera axon förnyelse i däggdjur i realtid, ett arbetssätt som är dyrt, tidskrävande och utmanande för att genomföra storskaliga genetiska skärmar. Drosophila melanogaster, däremot, har visat sig vara ett exceptionellt kraftfulla system för studier av komplexa biologiska frågor. Bananflugan har varit avgörande för definiera gener och signalering vägar som bevaras påfallande hos människa och har varit en framgångsrik modell för studier av människans villkor, såsom neurodegenerativa sjukdomar, genom vidsträckta molekylärgenetik verktyg tillgängliga att manipulera gen funktion¹⁵. I synnerhet anses bananflugor vara ett idealiskt verktyg för upptäckten av gener som är involverade i neurala skador och återväxt^15,16. Flera flyga neurala skada modeller har utarbetats, inklusive vuxen-huvudet eller larvformer ventrala nerv sladd (VNC) stickande med nålar, larval VNC eller nerv krossa med pincett, larval neuron laser axotomy, luktreceptor neuron borttagning, bladsticklingar hjärnskada, och perifera nerver lesion av wing avgångsvederlag^{15,17,18,19,20,21,22,23}. Excitingly, har senaste arbete utnyttja Drosophila skada modellerna avancerade vår förståelse av cellulär och genetisk vägar används av nervsystemet för att bemöta neurala skador, av vilka några har visat sig vara bevarad i däggdjur^{24 ,25}. Igen, Detta betonar nyttan av denna modellorganism för att identifiera nya mekanismer av neurala reparation.

Beskrivs här är en två-photon laserbaserad Drosophila larval sensoriska neuron skador modell. En två-photon laser användes först klippa axoner i zebrafiskar i vivo i 2003²⁶. I samma år spelades den första laser-dendriotomy i Drosophila använder en pulsad kväve laser²⁷. Kort därefter använde flera C. elegans labs femtosecond lasrar för att upprätta modeller av axon regenerering²⁸. I 2007, Wu och kollegor jämfört och redovisas skillnaderna mellan laser skador i C. elegans induceras av olika typer av lasrar²⁹. 2010 visades första gången axon förnyelse efter laser axotomy förekomma i Drosophila³⁰. Bygga på denna omfattande laser skada litteratur, har vi utvecklat en flyga neurala skada modell med två-photon lasern, som tillåter exakta induktion av skada till riktade webbplatser med minimal störning av angränsande vävnader, som ger en relativt ren system för att studera både inre och yttre egenskaper av neuroregeneration med encelliga upplösning. Specifikt, har vi en uppsättning skada metoder för dendritiska arborization (da) sensoriska nervceller i både det perifera nervsystemet (PNS) och CNS. Da nervceller kan grupperas i fyra olika klasser kännetecknas främst av deras dendrite förgrenade komplexitet: klass I till IV³¹. Våra publicerade arbete visar att da neuron förnyelse liknar däggdjur skada modeller på fenotypisk och molekylär nivå: da nervceller Visa klass specifika förnyelse egenskaper, med klass IV men inte klass I eller III da nervceller uppvisar förnyelse i den PNS; klass IV da neuron axoner regenerera kraftfullt i periferin, men deras regenerativ potential reduceras dramatiskt i CNS, som därmed liknar dorsalrotsganglier ganglion (DRG) nervceller i däggdjur. förbättra mTOR aktiviteten via Pten förbättrar radering eller Akt överuttryck axon förnyelse i flugan CNS¹⁹. Utnyttja denna skada modell, vi har varit utför genetiska skärmar och har identifierat enzymet RNA bearbetning Rtca som en evolutionärt bevarade hämmande faktor för axon regenerering, länka axon skada till cellulär stress och RNA modifiering²⁰ .

I den presenteras paradigmen induceras skadan via laser axotomy/dendriotomy av larval klass IV eller III da nervceller, märkt av ppk-CD4-tdGFP eller 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, respektive. Skadan som utförs på 2^nd till 3^rd instar larver på runt 48-72 h efter värpning (h AEL). För PNS är axotomy lesionen riktad till avsnittet axon ~ 20-50 µm bort från cellkroppen, för CNS axotomy till ett område ~ 20 µm i diameter vid commissure korsningen i VNC och dendriotomy till de primära dendritiska gren punkterna. Samma neuron är avbildade på 8-24 h efter skada (AI) att bekräfta fullständig transection och på 48-72 h AI att bedöma regenerering. Genom time-lapse confocal imaging, kan den degeneration och regeneration av enskilda axoner/dendriter som har varit skadade i vivo övervakas över tid.

Protocol

1. beredning av kultur tallrikar och flaskor Beredning av druvsaft agarplattor Tillsätt 10 g agar pulver, 200 mL grape juice och 192 mL ddH2O i en bägare och mikrovågsugn i ca 4-5 min, under omrörning emellanåt tills ägarn är helt upplöst. I ett dragskåp, kyla ner lösningen till ca 60 ° C. Lägga till 4,2 mL 95% etanol och 4,0 mL isättika. Justera den totala volymen av lösningen på 400 mL med ddH2O. Blanda väl. För varje 35 mm plåt, Lägg till…

Representative Results

Da nervceller visar differentiell föryngring potential mellan den perifera och centrala nervsystemet samt klass specificitet. Detta ger unika möjligheter till skärmen för romanen faktorer som krävs för axon regenerering (med klass IV PNS skada), samt de som är hämmande för regenerering (med klass IV CNS skada och klass III PNS skada). Axon förnyelse i PNS Som ex…

Discussion

När inställningen upp farten korsar, kan antalet honor och hanar som används variera beroende på genotyperna och antalet larver som behövs för specifika experiment. För WT flugor använder typisk cross 10 tikar och 5 hanar. Fönstret samling kan reduceras, beroende på riktigheten av den larver ålder som krävs. Exempelvis ger en 2-h kredittid larver av en mer homogen befolkning. I det här fallet hjälper använder hondjur 20 eller mer oskuld för att ställa in korsen ge tillräcklig ägg. Avkastningen från de…

Materials

Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L	VWR	97062-948
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Grape juice	Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%)	VWR	64-17-5
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent