इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे pairwise और तीन तरह के दवा संयोजनों के लिए Loewe additivity आधारित दवा बातचीत माप बनाने के लिए का वर्णन ।
एक synergistic दवा संयोजन व्यक्तिगत दवाओं के प्रभाव की तुलना में एक उच्च प्रभावकारिता है । चेकरबोर्ड परख, जहां दवाओं कई खुराकों में संयुक्त कर रहे हैं, दवा बातचीत के संवेदनशील माप की अनुमति दें । हालांकि, इन परख महंगा है और कई दवाओं के बीच बातचीत को मापने के लिए अच्छी तरह से पैमाने पर नहीं है । कई हाल के अध्ययनों की रिपोर्ट है दवा संपर्क माप पारंपरिक चेकरबोर्ड परख के एक तिरछे नमूने का उपयोग कर । इस वैकल्पिक पद्धति बहुत दवा बातचीत प्रयोगों की लागत कम हो जाती है और कई दवाओं के साथ संयोजन के लिए बातचीत माप की अनुमति देता है. यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए तीन pairwise बातचीत और डुप्लिकेट में तीन एंटीबायोटिक दवाओं के बीच १ ३ तरह की बातचीत को मापने, पांच दिनों में, केवल ३ ९६-well microplates और मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर । हम मौजूद प्रतिनिधि परिणाम दिखा रहा है कि Levofloxacin के तीन एंटीबायोटिक संयोजन + Nalidixic एसिड + पेनिसिलिन जी synergistic है । हमारे प्रोटोकॉल को तराजू कई दवाओं के बीच बातचीत और अंय जैविक संदर्भों में उपाय, बहु के लिए कुशल स्क्रीन रोगजनकों और ट्यूमर के खिलाफ दवा सहयोग के लिए अनुमति देता है ।
दवा संयोजन एक घटक दवाओं के प्रभाव दिया phenotype पर आश्चर्यजनक रूप से उच्च या कम प्रभाव प्रदर्शन कर सकते हैं, synergistic या विरोधी दवा बातचीत करने के लिए इसी, क्रमशः1,2,3. synergistic संयोजनों के उपयोग की अनुमति दे सकता है प्रभावकारिता वृद्धि और खुराक के लिए वृद्धि-पक्ष-प्रभाव राहत के लिए कमी. संयोजन उपचार भी सेलुलर मशीनरी के लिए कई असफलताओं लागू कर सकते हैं, जिससे प्रतिरोध4के लिए संभावित विकासवादी भागने तंत्र को अवरुद्ध । इसलिए, तीन या अधिक दवाओं के संयोजन नियमित रूप से रोगज़नक़ या कैंसर के उपचार में प्रयोग किया जाता है5।
सिनर्जी और विरोध एक अपेक्षित व्यक्तिगत दवा प्रभाव को देखते हुए प्रभाव बनाम एक संयोजन के प्रभाव के बीच तुलना द्वारा परिभाषित कर रहे हैं । दवा बातचीत के लिए मॉडलों के अलावा, Loewe additivity सबसे कड़े है और एक अच्छी तरह से परिभाषित नल मॉडल (चित्रा 1)6है, और आस्थगित सिनर्जी/विरोध बातचीत दवा इस्तेमाल किया एकाग्रता के स्वतंत्र है 6 , 7. हालांकि, Loewe मॉडल एक pairwise बातचीत परीक्षण के लिए भी प्रयोग महंगा है । दवा बातचीत परख परंपरागत रूप से दवा एकाग्रता संयोजन (एक चेकरबोर्ड परख) (चित्रा 2)के एक 2d मैट्रिक्स के शामिल हैं । अगर 5 खुराकों प्रत्येक दवा के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, तो 25 संयोजनों की आवश्यकता है, एक microplate के एक आधे के लिए इसी अगर प्रयोग दोहराने में आयोजित की जाती हैं । इस दृष्टिकोण की लागत बहु दवा संयोजन (चित्रा 3)के लिए Loewe additivity मॉडल द्वारा सिनर्जी माप पर प्रतिबंध लगाता है । उदाहरण के लिए, एक 10 तरह की बातचीत का परीक्षण करने के लिए, पारंपरिक तरीकों से अधिक १००,००० microplates की आवश्यकता होगी, कड़े, अच्छी तरह से theorized और एकाग्रता-स्वतंत्र Loewe additivity मॉडल द्वारा उच्च क्रम के तालमेल के प्रायोगिक माप को छोडक़र 8.
वर्तमान नैदानिक उपचार केवल संभव दवा संयोजन का एक अंश का उपयोग । उदाहरण के लिए, सक्रिय तपेदिक के मानक उपचार तीन एंटीबायोटिक दवाओं का एक संयोजन है । वहाँ लगभग 20 माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) उपचार में इस्तेमाल एंटीबायोटिक दवाओं रहे हैं । वहां ११४० संभव 3 तरह संयोजन 20 दवाओं, एमटीबीके खिलाफ एक मजबूत तालमेल की क्षमता के साथ प्रत्येक के बीच कर रहे हैं । के रूप में वहां कोई कीमत प्रभावी विधि कई दवाओं के बीच दवा बातचीत को मापने के लिए किया गया है, संभावित जीवन रक्षक synergistic संयोजन untested रहते हैं ।
यहां, हम एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए pairwise और तीन तरह के एक चेकरबोर्ड परख (चित्रा 4 और चित्रा 5)के केवल विकर्ण नमूना द्वारा दवा बातचीत उपाय । एक चेकरबोर्ड प्रयोग के विकर्ण नमूना की अंतर्निहित अवधारणा १९७८9में अपने प्राथमिक काम में Berenbaum द्वारा theorized था । फिर भी, यह दृष्टिकोण ही हाल ही में दवा सिनर्जी स्क्रीन10,11,12पर लागू किया गया है । हम ई कोलाई (ई. कोलाई) और विकास phenotype के साथ हमारे प्रोटोकॉल उपस्थित । तथापि, हम ध्यान दें कि प्रोटोकॉल जैविक प्रजातियों और ब्याज की phenotype से स्वतंत्र है, और इसलिए अंय जैविक संदर्भों में उच्च आदेश दवा तालमेल की माप के लिए लागू किया जा सकता है ।
रोगज़नक़ों या ट्यूमर के खिलाफ दवा संयोजनों का उपयोग एक आकर्षक संभावना है, विशेष रूप से सुखाने एंटीबायोटिक पाइप लाइन की परिस्थितियों में । हालांकि, इस क्षमता को कम दो कठिनाइयों से प्रभावित है । पहली कठिनाई संभव संयोजनों की खगोलीय संख्या है । वहां रहे हैं, उदाहरण के लिए, १०० एंटीबायोटिक दवाओं के बीच ४९५० संभव pairwise संयोजन । १०० एंटीबायोटिक (2१००) के बीच सभी संभव संयोजन पृथ्वी पर बैक्टीरिया की संख्या के साथ परिमाण के एक ही आदेश पर है (~ 1030) । कैसे इन संभावनाओं के बीच दृढ़ता से synergistic संयोजन की भविष्यवाणी करने के लिए कई गणना अध्ययन का विषय रहा है । दूसरी कठिनाई उच्च आदेश दवा बातचीत का माप है । विचार है कि एक गणना मंच का सुझाव है कि एक निश्चित 10 दवा संयोजन दृढ़ता से एक निश्चित रोगज़नक़ के खिलाफ synergistic है हो सकता है । दवा बातचीत का परीक्षण करने के लिए परंपरागत तरीकों को सत्यापित करना या इस परिकल्पना का खंडन करना भी महँगा पड़ता है, इसलिए कई दवाओं के बीच तालमेल का अध्ययन वैज्ञानिक जाँच की सीमाओं से बाहर रहा है. विकर्ण विधि है, जो पहले लगभग 30 साल पहले का प्रस्ताव किया गया था और कुछ हाल ही में तालमेल स्क्रीन में इस्तेमाल पहली समस्या के लिए एक मजबूत आधार प्रदान करते हैं, कई जोड़े के बीच बातचीत के परीक्षण की अनुमति देकर । यह पारंपरिक परख के एक जानकारीपूर्ण नमूना द्वारा दूसरी समस्या हल करती है और उच्च आदेश दवा बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है ।
हम महत्वपूर्ण बात ध्यान दें कि हमारे प्रोटोकॉल दवा बातचीत माप के लिए एक रैखिक खुराक का उपयोग करता है, भी कमजोर बातचीत का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता प्रदान करने के लिए. रैखिक खुराक के लिए सही एकाग्रता रेंज की स्थापना एक चुनौतीपूर्ण काम है । पहले एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करके, हम रैखिक खुराक के लिए खोज अंतरिक्ष के बारे में एक सूचित निर्णय करते हैं । हालांकि, प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता 2-गुना या उच्चतर सीरियल कमजोर पड़ने दवा बातचीत परीक्षण के लिए. इस तरह के एक संशोधन प्रयोग समय को कम करने और अधिक बातचीत के परीक्षण की अनुमति होगी; हालांकि, यह केवल दृढ़ता से synergistic या विरोधी बातचीत का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता होगी ।
प्रोटोकॉल हम वर्णित pairwise या तीन तरह की बातचीत का माप दिखाता है । प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि एकल एजेंट संयोजन के रूप में एक ही थाली पर हैं, थाली विविधताओं के कारण पूर्वाग्रह को कम करने के लिए । इसलिए, प्रोटोकॉल को बातचीत के उपाय करने के लिए समायोजित किया जा सकता 7-तुच्छ संशोधनों द्वारा तरह संयोजनों । 7 से अधिक दवाओं के संयोजन की आवश्यकता होगी अधिक से अधिक १ ९६-अच्छी तरह से microplate और अतिरिक्त विचार सही डेटा एकीकरण सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए, जैसे इंटर प्लेट प्रतिकृति.
विकर्ण विधि की एक उल्लेखनीय सीमा प्रतिबंध है कि परख में प्रत्येक दवा ब्याज की phenotype को बाधित करना चाहिए है । इसलिए, विकर्ण विधि सक्रिय एजेंटों और निष्क्रिय adjuvants के बीच बातचीत को समझने के लिए उपयोगी नहीं है । इस तरह के ‘ potentiating ‘ बातचीत आनंद या उच्चतम एकल एजेंट मॉडल के रूप में वैकल्पिक मॉडल के तहत अध्ययन किया जा सकता है ।
उच्च आदेश दवा बातचीत के विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण विचार के लिए नल मॉडल पसंद है “अपेक्षित IC50.” जब दो दवाओं संयुक्त कर रहे हैं, संयोजन के प्रभाव केवल एक दवा प्रभाव की तुलना में किया जा सकता है । जब तीन दवाओं संयुक्त कर रहे हैं, संयोजन प्रभाव एकल प्रभाव या pairwise प्रभाव की तुलना में किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यदि तीन औषधियों के सभी pairwise युग्म synergistic हैं, तो आशा की जा सकती है कि इन औषधियों में तीन तरह का तालमेल दिखाई देगा. क्या pairwise बातचीत से उंमीद है कि तीन तरह से है बातचीत विचलन हाल ही में डब किया गया है “आपात बातचीत”16,17। सादगी के लिए, हमारे प्रोटोकॉल तीन तरह संयोजन की “नेट बातचीत,” जो एकल दवा प्रभाव के रूप में नल मॉडल को परिभाषित करता है की माप का वर्णन । हालांकि, डेटा प्रोटोकॉल से प्राप्त की है कि तीन तरह के संयोजन के आकस्मिक बातचीत की गणना करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है । हमारे विश्लेषण में, हम तीन तरह के संयोजन की उंमीद IC50 एकल दवा IC50s के औसत के रूप में परिभाषित किया । वैकल्पिक रूप से, अपेक्षित IC50 pairwise संयोजनों (~ 1.1-1.2) के IC50s के औसत के रूप में परिभाषित किया जा सकता है । जब मनाया IC50 इस विकल्प की उंमीद IC50 द्वारा विभाजित है, प्राप्त FIC तीन तरह के संयोजन के लिए आपात FIC प्रदान करता है, के रूप में पहले12वर्णित है । इस विचार से पता चलता है कि लेव + NAL + png क्या तीन दवाओं के बीच pairwise बातचीत से उंमीद की जाएगी से अधिक synergistic है, का प्रदर्शन है कि लेव + NAL + png आपात तालमेल है ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम NIGMS ग्रांट P50GM107618 द्वारा वित्त पोषित किया गया । लेखकों ने पांडुलिपि पर व्यावहारिक टिप्पणियों और सुझावों के लिए सोहर बी Weinstein का शुक्रिया अदा किया ।
1.5 mL Semi Micro Cuvette | VWR | 97000-586 | |
1.5 mL Eppendorf Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 4036-3204 | |
1000 µL Tips | Geneseesci | 24830 | |
14 mL Breathable Cell Culture Tube | VWR | 60819-761 | |
20 µL Tips | Geneseesci | 24804 | |
200 µL Tips | Geneseesci | 24815 | |
37 °C Incubator | Panasonic | MIR-262-PA | |
37 °C Shaker Incubator | Thermo Scientific | SHKE8000 | |
5 mL Cell Culture Serological Pipette | VWR | 53300-421 | |
96-well Microplates | VWR | 15705-066 | |
Breathable Sealing Film | USA Scientific | 2920-0010 | |
DMSO | Sigma | 41647 | |
Escherichia coli | ATCC | 700926 | |
Glycerol | Sigma | G9012 | |
LB Broth Powder | RPI | L24065 | |
Levofloxacin | Sigma | 28266 | |
Micropipette | GILSON | PIPETMAN Classic | |
Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | |
Multichannel micropipette | VistaLab | 1060 | |
Nalidixic acid | Sigma | N8878 | |
Penicillin G | Sigma | P3032 | |
Pipette Pump | Drummond | 4-000-501 | |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-658 | |
Spectrophotometer | BIO-RAD | 1702525 | |
Vortex Mixer | Fisher Scientific | 10-320-807 |