I detta protokoll beskriver vi hur man gör Loewe additivitet-baserade läkemedlet interaktion mätningar för pairwise och trevägs läkemedelskombinationer.
En synergistisk drog kombination har en högre effekt jämfört med effekterna av enskilda läkemedel. Schackrutiga analyser, där droger kombineras i många doser, möjliggöra känsliga mätning av läkemedelsinteraktioner. Men dessa analyser är kostsamma och skala inte väl för att mäta interaktionen mellan många läkemedel. Flera färska studier har rapporterat drog interaktion mätningar med en diagonal provtagning av traditionella Schackrutor analysen. Denna alternativa metod kraftigt minskar kostnaden för läkemedlet interaktion experiment och tillåter interaktion mätning för kombinationer med många läkemedel. Här beskriver vi ett protokoll för att mäta de tre parvisa interaktionerna och en tre-vägs interaktion bland tre antibiotika i två exemplar i fem dagar, med hjälp av endast tre 96 brunnar mikroplattor och vanlig laboratorieutrustning. Vi presenterar representativa resultat visar att tre-antibiotikum kombinationen av Levofloxacin + Nalidixic syra + Penicillin G är synergistiska. Våra protokoll skalas upp för att mäta interaktioner bland många droger och andra biologiska sammanhang, vilket möjliggör effektiv skärmar för flera läkemedel synergier mot patogener och tumörer.
Läkemedelskombinationer kan uppvisa överraskande hög eller låg effekt på en fenotyp som gett effekterna av konstituerande droger, motsvarar synergistiska eller antagonistiska läkemedelsinteraktioner, respektive1,2,3. Användning av synergistiska kombinationer kan dosen-eskalering för effekt ökning och dosreduktion för bieffekt lättnad. Kombinationsbehandlingar kan även gälla flera bakslag cellulära maskineriet, vilket förhindrar potentiella evolutionära fly mekanismer till motstånd4. Kombinationer av tre eller fler läkemedel används därför rutinmässigt i patogen eller cancer behandling5.
Synergi och antagonism definieras genom en jämförelse mellan den observerade effekten av en kombination kontra förväntad effekt ges enskilda läkemedelseffekter. Bland modellerna för läkemedelsinteraktioner, Loewe additivitet är de strängaste har en väldefinierad null modell ()figur 1)6och antagna synergy/antagonism samspelet är oberoende av den drog koncentration som används 6 , 7. dock Loewe modellen är experimentellt kostsamt även för en parvisa interaktionstest. Läkemedlet interaktion analyser består traditionellt av en 2D matris av läkemedelskombinationer koncentration (en schackrutiga assay) ()figur 2). Om 5 doser används för varje läkemedel, då 25 kombinationer krävs, motsvarar en halv av en mikroplattan om experiment utförs i replikera. Kostnaden för detta tillvägagångssätt förbjuder synergy mätning av Loewe additivitet modell för flera läkemedelskombinationer ()figur 3). Till exempel för att testa ett 10-vägs interaktion, skulle traditionella metoder kräva mer än 100 tusen mikroplattor, spärra experimentell mätning av hög-beställning synergier av stränga, väl theorized och koncentration-oberoende Loewe additivitet modell 8.
Aktuella kliniska behandlingar utnyttja endast en bråkdel av eventuella läkemedelskombinationer. Standardbehandling av aktiv tuberkulos är exempelvis en kombination av tre antibiotika. Det finns cirka 20 antibiotika som används inom Mycobacterium tuberculosis (Mtb) behandling. Det finns 1140 möjliga 3-vägs kombinationer bland 20 droger, alla med potential att ha en stark samverkan mot Mtb. Eftersom det har ingen kostnadseffektiv metod för att mäta läkemedelsinteraktioner bland många läkemedel, förbli potentiellt livräddande synergistiska kombinationer otestade.
Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att mäta parvisa och trevägs läkemedelsinteraktioner genom provtagning endast diagonalen av en schackrutiga assay ()figur 4 och figur 5). Det underliggande begreppet provtagning diagonalen av en schackrutiga experiment var teoretiserade av Berenbaum i hans banbrytande arbete i 19789. Detta tillvägagångssätt har ännu, först nyligen tillämpats till drogen synergy skärmar10,11,12. Vi presenterar våra protokoll med Escherichia coli (E. coli) och tillväxt fenotypen. Vi noterar dock att protokollet är oberoende av biologiska arter och fenotyp av intresse, och därmed kan användas för mätning av högsta drogen synergy i andra biologiska sammanhang.
Användning av läkemedelskombinationer mot patogener eller tumörer är en attraktiv möjlighet, särskilt under omständigheter av rörledningen snabbtorkande antibiotika. Denna potential hämmas dock av minst två svårigheter. Den första svårigheten är astronomiska antalet möjliga kombinationer. Det finns till exempel 4950 möjliga parvisa kombinationer bland 100 antibiotika. Alla möjliga kombinationer bland 100 antibiotika (2100) är av samma storleksordning med antalet bakterier på jorden (~ 1030). Hur man förutsäga starkt synergistiska kombinationer bland dessa möjligheter har varit föremål för talrika computational studier. Den andra svårigheten är mätning av hög-order läkemedelsinteraktioner. Anser att en computational plattform får föreslå att en viss 10-drogen kombination är starkt synergistisk mot vissa patogener. Traditionella metoder för att testa läkemedelsinteraktioner är för kostsamt att bekräfta eller vederlägga denna hypotes, studiet av synergi mellan många droger har därför varit utanför gränserna för vetenskaplig undersökning. Metoden diagonal, som först föreslogs nästan 30 år sedan och användes i några nyligen synergy skärmar ger en stark grund för det första problemet, genom att låta testning av interaktionen mellan många par. Det löser det andra problemet genom en informativ provtagning av de traditionella analyserna och tillåter studier av hög-order läkemedelsinteraktioner.
Vi noterar viktigast att våra protokoll använder en linjär dosering för läkemedlet interaktion mätningar, för att tillhandahålla känslighet för att upptäcka även svaga interaktioner. Upprättandet av rätt koncentration intervallet för linjär dosering är en utmanande uppgift. Genom att först utföra en seriell utspädning, fatta vi ett välgrundat beslut om Sök utrymme för linjär dosering. Dock protokollet kan ändras för att använda 2-faldig eller högre seriespädningar för läkemedel interaktion testning. En sådan ändring skulle förkorta tid som experiment och tillåter testning av fler interaktioner; Det skulle dock ha känslighet att upptäcka bara starkt synergistiska eller antagonistiska interaktioner.
Det protokoll som vi beskrivit visar mätningen av parvisa eller trevägs interaktioner. En kritisk aspekt av protokollet är att enda agenter är på samma platta som kombinationen, att minimera bias på grund av plattan variationer. Därför kan protokollet justeras för att mäta interaktioner upp till 7-vägs kombinationer av triviala modifieringar. Kombinationer av fler än 7 läkemedel kräver mer än en 96 brunnar mikroplattan och ytterligare överväganden måste vidtas för att säkerställa korrekta dataintegration, exempelvis mellan plate replikat.
En betydande begränsning av metoden diagonal är begränsningen att varje läkemedel i analysen måste hämma fenotypen av intresse. Diagonal metoden är därför inte användbart för förstå samspelet bland aktiva agenter och inert tillsatser. Sådana ‘förstärkande’ interaktioner kan studeras under alternativa modeller såsom Bliss eller högsta monoterapi modeller.
En viktig faktor för analys av högsta läkemedelsinteraktioner är null modell val för det ”förväntade IC50”. När två läkemedel kombineras, kan kombinationens effekt endast jämföras med de enda läkemedelseffekter. När tre läkemedel kombineras, kan kombinationens effekt jämföras med de enda effekter eller parvisa effekter. Exempelvis om alla parvisa kombinationer av tre läkemedel är synergistisk, kan sedan det förväntas att dessa läkemedel kommer att visa en tre-vägs synergi. En tre-vägs interaktionens avvikelse från vad som förväntas av parvisa interaktioner har kallats nyligen ”framväxande interaktion”16,17. För enkelhetens skull beskriver våra protokollet mätning av trevägs kombinationens ”net interaktionen”, som definierar den null modellen som enda läkemedelseffekter. De data som erhålls från protokollet kan dock också användas för att beräkna framväxande växelverkan av kombinationen trevägs. I vår analys definierat vi förväntade IC50 hos kombinationen tre sätt som genomsnittet av enda drogen IC50s. Alternativt kan förväntad IC50 definieras som genomsnittet av IC50s av parvisa kombinationer (~1.1-1.2). När den observerade IC50 divideras med denna alternativa förväntade IC50, föreskrivs den erhållna FIC den framväxande FIC trevägs kombinationen, som tidigare beskrivits12. Detta övervägande avslöjar att LEV + NAL + PNG är mer synergistisk än vad som skulle förväntas från parvisa interaktioner bland tre droger, visar att LEV + NAL + PNG har emergent samverkan.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av NIGMS Grant P50GM107618. Författarna vill tacka Zohar B. Weinstein för förslag på manuskriptet och insiktsfulla kommentarer.
1.5 mL Semi Micro Cuvette | VWR | 97000-586 | |
1.5 mL Eppendorf Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 4036-3204 | |
1000 µL Tips | Geneseesci | 24830 | |
14 mL Breathable Cell Culture Tube | VWR | 60819-761 | |
20 µL Tips | Geneseesci | 24804 | |
200 µL Tips | Geneseesci | 24815 | |
37 °C Incubator | Panasonic | MIR-262-PA | |
37 °C Shaker Incubator | Thermo Scientific | SHKE8000 | |
5 mL Cell Culture Serological Pipette | VWR | 53300-421 | |
96-well Microplates | VWR | 15705-066 | |
Breathable Sealing Film | USA Scientific | 2920-0010 | |
DMSO | Sigma | 41647 | |
Escherichia coli | ATCC | 700926 | |
Glycerol | Sigma | G9012 | |
LB Broth Powder | RPI | L24065 | |
Levofloxacin | Sigma | 28266 | |
Micropipette | GILSON | PIPETMAN Classic | |
Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | |
Multichannel micropipette | VistaLab | 1060 | |
Nalidixic acid | Sigma | N8878 | |
Penicillin G | Sigma | P3032 | |
Pipette Pump | Drummond | 4-000-501 | |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-658 | |
Spectrophotometer | BIO-RAD | 1702525 | |
Vortex Mixer | Fisher Scientific | 10-320-807 |