I denne protokol beskriver vi hvordan man laver Loewe additivity-baseret drug interaktion målinger for parvis og tre-vejs drug kombinationer.
En synergistisk drug kombination har en højere effektivitet i forhold til virkningerne af enkelte stoffer. Skakternet assays, hvor narkotika er kombineret i mange doser, tillader følsomme måling af lægemiddelinteraktioner. Men disse assays er dyrt og skalere ikke godt for måling interaktion blandt mange lægemidler. Flere nyere undersøgelser har rapporteret drug interaktion målinger ved hjælp af en diagonal prøveudtagning af traditionelle skakternet assay. Denne alternative metode kraftigt reducerer omkostningerne ved drug interaktion eksperimenter og giver mulighed for interaktion måling for kombinationer med mange medikamenter. Her, beskriver vi en protokol for at måle de tre parvise interaktioner og en tre-vejs interaktion blandt tre antibiotika i to eksemplarer i fem dage, ved hjælp af kun tre 96-brønd mikroplader og almindeligt laboratorieudstyr. Vi præsenterer repræsentative resultater viser, at tre-antibiotikum kombination af Levofloxacin + Nalidixic syre + Penicillin G er synergistisk. Vores protokol kan skaleres til at måle interaktioner blandt mange lægemidler og i andre biologiske sammenhænge, giver mulighed for effektiv skærme for multi drug synergier mod patogener og tumorer.
Drug kombinationer kan udstille overraskende høj eller lav effekt på en fænotype givet virkningerne af konstituerende narkotika, svarende til synergistisk eller antagonistisk lægemiddelinteraktioner, henholdsvis1,2,3. Brugen af synergistiske kombinationer kan tillade dosis-eskalering til effekten stigning og dosis-reduktion for bivirkning relief. Kombination behandlinger kan også anvende flere tilbageslag til cellulære maskiner, hvilket blokerer for potentielle evolutionære undslippe mekanismer til modstand4. Kombinationer af tre eller flere stoffer er derfor rutinemæssigt anvendes i patogen eller kræft behandling5.
Synergi og antagonisme er defineret ved en sammenligning mellem den observerede effekt af en kombination versus forventede virkning givet enkelt drug effekter. Blandt modellerne for lægemiddelinteraktioner, Loewe additivity er den strengeste og har en veldefineret null model ()figur 1)6, og afledt synergi/antagonisme interaktion er uafhængig af narkotika koncentration anvendt 6 , 7. men Loewe model er eksperimentelt dyrt selv for en parvis interaktion test. Drug interaktion assays traditionelt består af en 2D matrix af narkotika koncentration kombinationer (et skakternet assay) ()figur 2). Hvis 5 doser anvendes for hvert stof, så 25 kombinationer er nødvendige, svarer til en halvdel af en mikrotiterplade hvis eksperimenter er udført i replikeres. Omkostningerne ved denne tilgang forbyder synergi måling af Loewe additivity model for multi drug kombinationer af ()figur 3). For eksempel, for at teste en 10-vejs interaktion, ville traditionelle metoder kræve mere end 100 tusinde mikroplader, spærring eksperimentelle måling af høje synergier af den strenge, godt teoretiske og koncentration-uafhængig Loewe additivity model 8.
Aktuelle kliniske behandlinger anvender kun en brøkdel af mulige drug kombinationer. For eksempel, er den standard behandling af aktiv tuberkulose en kombination af tre antibiotika. Der er ca 20 antibiotika anvendes Mycobacterium tuberculosis (Mtb) behandling. Der er 1140 3-vejs kombinationer blandt 20 narkotika, hver med potentiale til at have en stærk synergi mod Mtb. Da der har været nogen omkostningseffektiv metode til at måle lægemiddelinteraktioner blandt mange lægemidler, forbliver potentielt livreddende synergistiske kombinationer uprøvet.
Her, vi beskriver en enkel protokol for at måle parvis og tre-vejs lægemiddelinteraktioner ved stikprøver kun diagonalen i et skakternet assay ()figur 4 og figur 5). Underliggende begrebet prøveudtagning diagonalen i et skakternet eksperiment var teoretiseret af Berenbaum i hans skelsættende arbejde i 19789. Denne tilgang har endnu, først for nylig blevet anvendt til narkotika synergy skærme10,11,12. Vi præsenterer vores protokol med Escherichia coli (E. coli) og vækst fænotype. Vi Bemærk dog, at protokollen er uafhængig af den biologiske arter og fænotype af interesse, og dermed kan anvendes til måling af høje stof synergi i andre biologiske sammenhænge.
Brugen af narkotika kombinationer mod patogener eller tumorer er attraktivt, især under omstændighederne af tørring antibiotika rørledningen. Dette potentiale er imidlertid hæmmet af mindst to problemer. Den første vanskelighed er de astronomiske antal mulige kombinationer. Der er for eksempel 4950 parvise kombinationer blandt 100 antibiotika. Alle mulige kombinationer blandt 100 antibiotika (2100) er på den samme størrelsesorden med antallet af bakterier på jorden (~ 1030). Hvordan du forudsige kraftigt synergistiske kombinationer blandt disse muligheder har været genstand for talrige beregningsmæssige undersøgelser. Det andet problem er måling af høje lægemiddelinteraktioner. Mener, at en beregningsmæssige platform kan tyde på at en bestemt 10-drug kombination er stærkt synergistiske mod en bestemt patogen. Traditionelle metoder til at teste lægemiddelinteraktioner er for dyrt at bekræfte eller afkræfte denne hypotese, derfor undersøgelse af synergi blandt mange lægemidler har været uden for grænserne for videnskabelig undersøgelse. Metoden diagonal, som blev først foreslået næsten 30 år siden og blev brugt i et par nylige synergy skærme tilvejebringe et solidt fundament for det første problem, ved at tillade afprøvning af interaktion blandt mange par. Det løser det andet problem ved en informativ prøvetagning af de traditionelle assays og giver mulighed for undersøgelse af høj-ordre lægemiddelinteraktioner.
Vi Bemærk vigtigere, at vores protokol bruger en lineær dosering for drug interaktion målinger, for at give følsomhed til at afsløre selv svage interaktioner. Om oprettelse af de rigtige koncentrationsområde for lineær dosering er en udfordrende opgave. Ved først at udføre en seriel fortynding, træffe vi en informeret beslutning om søgning plads for lineær dosering. Men protokollen kan ændres til at bruge 2-fold eller højere serielle fortyndinger for drug interaktion test. Denne ændring vil forkorte tid, eksperiment og giver mulighed for afprøvning af flere interaktioner; Det ville dog have sensitivitet til at opdage kun stærkt synergistisk eller antagonistisk interaktion.
Protokollen beskrev vi, viser måling af parvise eller tre-vejs interaktioner. Et kritisk aspekt i protokollen er, at enkelt ansatte er på den samme plade som kombination, at minimere bias på grund af plade variationer. Derfor, protokollen kan justeres for at måle interaktioner op til 7-vejs kombinationer af trivielle ændringer. Kombinationer af mere end 7 narkotika vil kræve mere end én 96-brønd mikrotiterplade og yderligere overvejelser skal træffes for at sikre korrekte dataintegration, såsom indbyrdes plate replikater.
En bemærkelsesværdig begrænsning af metoden diagonal er den begrænsning, at hver enkelt drug i analysen skal hæmme Fænotypen af interesse. Derfor, metoden diagonal er ikke nyttigt for forståelse samspil mellem aktive agenter og inert adjuvanser. Sådanne ‘potentiating’ interaktioner kan studeres under alternative modeller såsom Bliss eller højeste enkelt Agent modeller.
En vigtig overvejelse for analysen af høj-ordre lægemiddelinteraktioner er null model valg for den “forventede IC50.” Når to stoffer er kombineret, kan den kombination virkning kun sammenlignes med enkelt drug effekter. Når tre stoffer er kombineret, kan den kombination virkning sammenlignes med enkelt effekter eller parvise effekter. For eksempel, hvis alle parvise kombinationer af tre lægemidler er synergistiske, kan derefter forventes at disse stoffer vil vise en tre-vejs synergi. En tre-vejs interaktion afvigelse fra hvad der forventes af parvise interaktioner er blevet for nylig kaldt “emergent interaktion”16,17. For enkelhed beskriver vores protokol måling af den tre-vejs kombination “netto interaktion,” som definerer den null model som enkelt drug effekter. De data, der er fremstillet af protokollen kan dog også bruges til at beregne den emergente interaktion af den tre-vejs kombination. I vores analyse definerede vi de forventede IC50 for tre-vejs kombination som gennemsnittet af de enkelt drug IC50s. Alternativt, den forventede IC50 kan defineres som et gennemsnit af IC50s af parvise kombinationer (~1.1-1.2). Når den observerede IC50 divideres med denne alternative forventede IC50, ydes opnåede FIC emergent FIC trevejs-kombination, som tidligere beskrevet12. Denne betragtning afslører, at LEV + NAL + PNG er mere synergistiske end hvad ville forventes af parvise interaktionerne mellem tre lægemidler, demonstrerer, at LEV + NAL + PNG har emergent synergi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af NIGMS Grant P50GM107618. Forfatterne takke Zohar B. Weinstein indsigtsfulde kommentarer og forslag om håndskriftet.
1.5 mL Semi Micro Cuvette | VWR | 97000-586 | |
1.5 mL Eppendorf Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 4036-3204 | |
1000 µL Tips | Geneseesci | 24830 | |
14 mL Breathable Cell Culture Tube | VWR | 60819-761 | |
20 µL Tips | Geneseesci | 24804 | |
200 µL Tips | Geneseesci | 24815 | |
37 °C Incubator | Panasonic | MIR-262-PA | |
37 °C Shaker Incubator | Thermo Scientific | SHKE8000 | |
5 mL Cell Culture Serological Pipette | VWR | 53300-421 | |
96-well Microplates | VWR | 15705-066 | |
Breathable Sealing Film | USA Scientific | 2920-0010 | |
DMSO | Sigma | 41647 | |
Escherichia coli | ATCC | 700926 | |
Glycerol | Sigma | G9012 | |
LB Broth Powder | RPI | L24065 | |
Levofloxacin | Sigma | 28266 | |
Micropipette | GILSON | PIPETMAN Classic | |
Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | |
Multichannel micropipette | VistaLab | 1060 | |
Nalidixic acid | Sigma | N8878 | |
Penicillin G | Sigma | P3032 | |
Pipette Pump | Drummond | 4-000-501 | |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-658 | |
Spectrophotometer | BIO-RAD | 1702525 | |
Vortex Mixer | Fisher Scientific | 10-320-807 |