このプロトコルでは、作り方ロエベ加法性基づかせていた薬剤の相互作用の測定ペアと 3 ウェイの薬物の組み合わせについて説明します。
相乗効果薬の組み合わせは、個々 の薬剤の効果と比較して高い治療効果をが。市松模様の試金、多くの用量で薬を結合し、薬物相互作用の高感度測定を許可します。ただし、これらの試金は高価であり、よく多くの薬剤間の相互作用を測定するスケールは変更されません。いくつかの最近の研究は、伝統的な市松模様の試金の斜めサンプリングを用いた薬物相互作用の測定を報告しています。この代替方法論は大きく薬物相互作用実験のコストを削減し、多くの薬剤の組み合わせの相互作用測定が可能します。ここでは、我々 だけの 3 つの 96 ウェル マイクロ プレートと標準的な実験装置を使用して 3 対相互作用および 5 日に、重複での 3 つの抗生物質間 1 つ 3 ウェイの相互作用を測定するためのプロトコルをについて説明します。ペニシリン G + ナリジクス酸レボフロキサシン 3 抗生物質の組み合わせが相乗効果を示す代表的な結果を提案します。我々 のプロトコルは、多くの薬剤の中で、病原体や腫瘍に対する多剤の相乗効果で効率的な画面を可能にする、他の生物学的文脈での相互作用を測定するスケール アップ。
薬剤の組み合わせは、驚くほどハイまたはローに及ぼす相乗的あるいは敵対的薬物相互作用、それぞれ1,2,3に対応する成分の薬剤の効果を与えられた表現型を表わすかもしれない。相乗的な組み合わせの使用は、有効性の増加のための増量と副作用救済のため線量低減可能です。組み合わせ治療も細胞機械装置、それにより抵抗4潜在的な進化のエスケープ機構をブロックする複数挫折を適用可能性があります。したがって、3 つ以上の薬剤の組み合わせは、病原体や癌治療5で日常的に使用されます。
拮抗作用との相乗効果は、個々 の薬剤の効果を与えられて期待される効果と組み合わせの観察された効果の比較によって定義されます。薬物相互作用のなかでは、ロエベ加法では最も厳しい、明確に定義された null モデル(図 1)6と推論されるシナジー/拮抗作用は使用薬物濃度に依存しません。6,7します。 しかし、ロエベ モデルは実験的ペア相互作用実験のため高価な。薬物濃度の組み合わせ (チェッカー ボードの試金) の 2次元マトリックスの伝統的薬物相互作用アッセイを構成する(図 2)。5 用量が、それぞれの薬に使用される場合は 25 の組み合わせが必要で、1 つに対応する複製の実験を行った場合のマイクロ プレートの半分。このアプローチのコストは、多剤の組み合わせ(図 3)ロエベ加法モデルによる相乗効果測定を禁止しています。たとえば、10 方向の相互作用をテストするため従来の方法が厳しい、よく理論および濃度に依存しないロエベ加法モデルによる高次相乗効果の計測実験がなければ、以上 10 万マイクロ プレートに必要8。
現在治療は利用可能な薬剤の組み合わせのほんの一部です。たとえば、活動性の結核の標準治療は 3 つの抗生物質の組み合わせです。マイコバクテリウムの結核(Mtb) の治療に使用されて約 20 抗生物質があります。1140 3 ウェイ組み合わせ中で 20 の薬、それぞれMtbに対して強い相乗効果を持っている可能性があります。多くの薬物の間で薬物相互作用を測定するコスト効果の高い方法がずっとない、潜在的に命を救う相乗的組み合わせまま未検証です。
ここでは、チェッカー ボードの試金(図 4の対角線だけをサンプリングすることによってペアと 3 ウェイの薬物相互作用を測定するための単純なプロトコルについて述べると図 5)。チェッカー ボードの実験の対角線をサンプリングの基本的な概念はだった 1978年9の彼の精液の仕事の Berenbaum によって理論化。まだ、このアプローチは最近薬剤の相乗効果画面10、11,12に適用されています。私たちプロトコルを提案するエシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌) と成長表現型。しかし、我々 は、プロトコルが生物種および関心の表現型は独立した、したがって、他の生物学的文脈で上位薬相乗効果の測定に適用される可能性があります注意してください。
病原体や腫瘍に対する薬剤の組合せの使用は、特に乾燥抗生物質パイプラインの状況の下で、魅力的な見通しです。ただし、この可能性は、少なくとも 2 つの困難によって妨げられています。最初の難関は、可能な組み合わせの天文学的数字です。たとえば、100 抗生物質のうち 4950 の可能なペアの組み合わせがあります。100 の抗生物質間のすべての組み合わせ (2100) 地球のバクテリアの数は、同程度の大きさに (10 ~30)。これらの可能性の間で強く相乗的な組み合わせを予測する方法について多くの研究の対象とされています。2 番目の難易度上位の薬物相互作用の測定であります。計算プラットフォームが特定 10 薬の組み合わせは特定の病原体に対して強く相乗効果を提案するかもしれないことを検討してください。薬物相互作用をテストする従来の方法は確認またはこの仮説に反論するのにはコストがかかりすぎる、したがって多くの薬剤間の相乗効果の研究は、科学的な調査の境界の外されています。斜めに、ほぼ 30 年前初めて提案されたいくつかの最近の相乗効果画面で使用されたメソッドは、多くのペア間の相互作用のテストにより最初の問題のための強力な基盤を提供します。伝統的な試金の有益なサンプリングで 2 番目の問題を解決でき、上位の薬物相互作用の研究。
我々 のプロトコルを使用する薬物相互作用測定のための線形投与も弱い相互作用を検出する感度を提供するを重要なことに注意してください。線形投与の右側の濃度範囲を確立するやりがいのある仕事です。シリアル希薄を実行する最初と、線形投与のための探索空間の知識のある決定を行います。ただし、倍を使用するプロトコルを変更ことができます。 またはの高いシリアル希薄薬物相互作用試験。このような変更は実験時間を短縮し、; より多くの相互作用をテストできるようにただし、のみ強く相乗的あるいは敵対的相互作用を検出する感度があります。
我々 が説明されたプロトコルは、ペアまたは 3 ウェイの相互作用の測定を示しています。プロトコルの重要な側面は、単一のエージェントがプレートの変動によるバイアスを最小限に抑えるための組み合わせとして同じプレート上にあります。したがって、プロトコルは、些細な変更で 7 方法の組み合わせまでの相互作用を測定する調整できます。以上 7 薬の組み合わせが 2 つ以上の 96 ウェル マイクロ プレートを必要し、追加の考慮事項は、プレート間の複製などの適切なデータ統合のために取られなければなりません。
対角線論法の顕著な制限は、各薬物アッセイの必要があります興味の表現型を阻害する制限です。したがって、対角線論法は活性剤及び不活性アジュバント間の相互作用を理解するために便利ではありません。’増強’ そのような相互作用は、至福または最高の単一のエージェント モデルなど代替モデルの下で学ぶことができます。
高次薬物相互作用の分析のための重要な考慮事項は、「予想 IC50」null モデル選択2 つの薬を組み合わせる場合併用の効果は単一の薬剤効果にのみ比較できます。3 つの薬剤を組み合わせる場合は、単一のエフェクトや対効果を併用の効果を比較できます。たとえば、3 つの薬のすべてのペアの組み合わせは相乗効果、する場合それが期待するこれらの薬が 3 ウェイの相乗効果を示します。「創発的相互作用」16,17、ペアの相互作用から期待されるものから三者相互作用の偏差によって最近と呼ばれていますいます。わかりやすくするため、我々 のプロトコルは、3 ウェイの組み合わせの net 相互作用”の”単一の薬剤効果として null モデルを定義する測定について説明します。ただし、プロトコルから得られたデータは、3 ウェイの組み合わせの創発的相互作用を計算する使用も可能性があります。我々 の分析で IC50s の単一の薬剤の平均としての 3 ウェイの組み合わせ予想される IC50 を定義します。また、予想される IC50 は、ペアの組み合わせ (~1.1-1.2) の IC50s の平均として定義できます。この代替の予想される IC50 によって観測された IC50 を分割すると、得られた FIC は前述12として、3 ウェイの組み合わせで緊急 FIC を提供します。この考察は、レフ + NAL + PNG は、レフ + NAL + PNG が創発的相乗効果であることを示す 3 つの薬剤の間で一対の相互作用から期待されるものよりもより相乗、明らかにします。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、日の出グラント P50GM107618 によって賄われていた。著者は、洞察力に富んだコメントや原稿の提案ありがとうゾハー B. ワインスタイン。
1.5 mL Semi Micro Cuvette | VWR | 97000-586 | |
1.5 mL Eppendorf Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 4036-3204 | |
1000 µL Tips | Geneseesci | 24830 | |
14 mL Breathable Cell Culture Tube | VWR | 60819-761 | |
20 µL Tips | Geneseesci | 24804 | |
200 µL Tips | Geneseesci | 24815 | |
37 °C Incubator | Panasonic | MIR-262-PA | |
37 °C Shaker Incubator | Thermo Scientific | SHKE8000 | |
5 mL Cell Culture Serological Pipette | VWR | 53300-421 | |
96-well Microplates | VWR | 15705-066 | |
Breathable Sealing Film | USA Scientific | 2920-0010 | |
DMSO | Sigma | 41647 | |
Escherichia coli | ATCC | 700926 | |
Glycerol | Sigma | G9012 | |
LB Broth Powder | RPI | L24065 | |
Levofloxacin | Sigma | 28266 | |
Micropipette | GILSON | PIPETMAN Classic | |
Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | |
Multichannel micropipette | VistaLab | 1060 | |
Nalidixic acid | Sigma | N8878 | |
Penicillin G | Sigma | P3032 | |
Pipette Pump | Drummond | 4-000-501 | |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-658 | |
Spectrophotometer | BIO-RAD | 1702525 | |
Vortex Mixer | Fisher Scientific | 10-320-807 |