I denne protokollen beskriver vi hvordan få Loewe additivity-baserte narkotika samhandling målinger for parvis og treveis rusmiddelkombinasjoner.
En synergistisk narkotika kombinasjon har en høyere effekt sammenlignet effekten av enkelte stoffer. Sjakkbrett analyser, der narkotika kombineres i mange doser, kan følsom måling av interaksjoner. Men disse analyser er kostbare og skalerer ikke godt for å måle samspillet mellom mange legemidler. Flere studier har rapportert narkotika samhandling mål med en diagonal utvalg av tradisjonelle sjakkbrett analysen. Denne alternative metoden sterkt reduserer kostnadene for stoffet samhandling eksperimenter og lar samhandling måling for kombinasjoner med mange legemidler. Her beskriver vi en protokoll for å måle de tre parvis interaksjonene og en tre-veis samspillet mellom tre antibiotika i duplikat, på fem dager, med bare tre 96-brønnen microplates og standard laboratorieutstyr. Vi presenterer representant resultater viser at tre-antibiotikaresistens kombinasjonen av Levofloxacin + Nalidixic Acid + Penicillin G er synergistisk. Våre protokollen skalerer for å måle interaksjoner blant mange legemidler og i andre biologiske sammenhenger, muliggjør effektiv skjermene multi-Drug synergier mot patogener og svulster.
Rusmiddelkombinasjoner kan ha overraskende høy eller lav effekt på en fenotypen gitt effekten av konstituerende narkotika, tilsvarer synergistisk eller antagonistiske legemiddelinteraksjoner, henholdsvis1,2,3. Bruk av synergistisk kombinasjoner kan doseopptrapping effekt økning og dosereduksjon for bivirkning lettelse. Kombinasjon behandlinger kan også gjelde flere tilbakeslag for mobilnettet maskineri, og dermed blokkerer potensielle evolusjonære escape mekanismer til motstand4. Derfor brukes kombinasjoner av tre eller flere rusmidler rutinemessig i patogen eller kreft behandling5.
Synergi og antagonisme defineres av en sammenligning mellom observerte effekten av en kombinasjon versus en forventet virkning personlige narkotika effekter. Blant modellene for interaksjoner, Loewe additivity er den strengeste og har en godt definert null modell ()figur 1)6og tiltenkt synergi/antagonisme samspillet er uavhengig av narkotika konsentrasjonen brukes 6 , 7. men Loewe modellen er eksperimentelt kostbar aften for en parvis samhandling test. Stoffet samhandling analyser tradisjonelt består av en 2D matrise av konsentrasjon rusmiddelkombinasjoner (en dambrett analysen) ()figur 2). Hvis 5 doser brukes for hvert legemiddel, så 25 er nødvendig, svarer til en halvdel av en microplate hvis eksperimenter er gjennomført i replikere. Kostnadene ved denne tilnærmingen forbyr synergi måling av Loewe additivity modell for flere rusmiddelkombinasjoner ()Figur 3). For eksempel for å teste en 10-veis interaksjon, krever tradisjonelle metoder mer enn 100 tusen microplates, sperring eksperimentelle måling av høye synergier av strenge, godt theorized og konsentrasjon-uavhengig Loewe additivity modellen 8.
Gjeldende kliniske behandlinger bruker bare en brøkdel av mulig rusmiddelkombinasjoner. For eksempel er standard behandling av aktive tuberkulose en kombinasjon av tre antibiotika. Det er ca 20 antibiotika som brukes i Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Det er 1140 3-veis kombinasjonene blant 20 narkotika, hver med potensial til å ha en sterk synergi mot Mtb. Som det er ingen kostnadseffektiv metode for å måle interaksjoner blant mange legemidler, forblir potensielt livreddende synergistisk kombinasjoner uprøvd.
Her beskriver vi en enkel protokoll for å måle parvis og treveis interaksjoner ved prøvetaking bare diagonalen på et sjakkbrett analysen ((Figur 4 ) og figur 5). Underliggende begrepet prøvetaking diagonalen på et sjakkbrett eksperiment ble theorized av Berenbaum i hans banebrytende arbeid i 19789. Denne tilnærmingen er ennå, nylig brukt narkotika synergi skjermer10,11,12. Vi presenterer våre Protokoll med Escherichia coli (E. coli) og vekst fenotypen. Men oppmerksom vi på at protokollen er uavhengig av biologiske arter og fenotypen av interesse, og dermed kan brukes på måling av høye narkotika synergi i andre biologiske sammenhenger.
Bruk av rusmiddelkombinasjoner mot patogener eller svulster er et attraktivt prospekt, spesielt under omstendigheter tørking antibiotika rørledningen. Men er dette potensialet hindret av minst to problemer. Den første vanskeligheten er astronomiske antall mulige kombinasjoner. Det er for eksempel 4950 parvis kombinasjonene av 100 antibiotika. Alle mulige kombinasjoner av 100 antibiotika (2100) er i samme størrelsesorden med antall bakterier på jorden (~ 1030). Hvordan tippe sterkt synergistisk lettilgjengelige disse mulighetene har vært gjenstand for mange beregningsorientert studier. Den andre vanskeligheten er måling av signifikante interaksjoner. Vurdere at en beregningsorientert plattform kan foreslå at en bestemt 10-stoff kombinasjon er sterkt synergistisk mot en bestemt patogen. Tradisjonelle metoder for å teste interaksjoner er for kostbart å bekrefte eller tilbakevise denne hypotesen, derfor studiet av synergi blant mange legemidler er utenfor grensene av vitenskapelige undersøkelser. Diagonale metoden, som først ble foreslått nesten 30 år siden og ble brukt i noen nyere synergi skjermer gir et sterkt grunnlag for det første problemet, ved at testing av samspillet mellom mange parene. Det løser det andre problemet ved en opplysende utvalg av tradisjonelle analyser og lar studiet av signifikante interaksjoner.
Vi Merk viktigere at våre protokollen bruker en lineær dosering for narkotika samhandling mål, for å gi følsomheten for å oppdage selv svake interaksjoner. Etablere høyre konsentrasjon området for lineær dosering er en utfordrende oppgave. Ved første utfører en seriell fortynning, gjør vi en avgjørelse om søk plass for lineær dosering. Men protokollen kan endres for å bruke 2-fold eller høyere føljetong fortynninger for narkotika samhandling testing. Slik modifikasjon ville forkorte eksperiment tiden og la testing av flere interaksjoner; det ville imidlertid ha følsomheten å oppdage bare sterkt synergistisk eller antagonistiske interaksjoner.
Protokollen vi beskrev viser måling av parvis eller treveis interaksjoner. En viktig del av protokollen er at enkelt agenter er på samme plate som kombinasjon, minimere skjevhet på grunn av platen variasjoner. Derfor kan protokollen justeres for å måle interaksjoner opp til 7-veis kombinasjoner av trivielle modifikasjoner. Kombinasjoner av flere enn 7 narkotika vil kreve flere 96-brønnen microplate og ekstra hensyn må tas å sikre riktige dataintegrasjon, som Inter plate gjentak.
En kjent begrensning av metoden diagonal er begrensning at hvert legemiddel i analysen må hemme fenotypen av interesse. Derfor er diagonale metoden ikke nyttig for å forstå samspillet mellom aktive agenter og inert adjuvans. Slike ‘potentiating’ samhandlinger kan studeres under alternative modeller som lykke eller høyeste enkelt Agent.
En viktig faktor for analyse av signifikante interaksjoner er null modell valget for “forventet IC50.” To stoffene er kombinert, kan kombinasjons effekt bare sammenlignes enkelt medikament-effekter. Tre medikamenter er kombinert, kan kombinasjons effekten sammenlignes til enkelteffekter eller parvis effekter. For eksempel hvis alle parvis kombinasjoner av tre narkotika synergistisk, kan så det forventes at disse stoffene vises en treveis synergi. En tre-veis samhandling er avvik fra forventet fra parvis samspill er blitt nylig kalt “emergent samspill”16,17. For enkelhet beskriver våre protokollen måling av treveis kombinasjons “netto samhandling,” som definerer null modellen som enkelt narkotika effekter. Imidlertid kan dataene som hentes fra protokollen også brukes til å beregne emergent samspillet treveis kombinasjonen. I vår analyse definert vi den forventede IC50 treveis kombinasjonen som gjennomsnittet av enkelt stoffet IC50s. Den forventede IC50 kan også defineres som et gjennomsnitt av IC50s parvis kombinasjoner (~1.1-1.2). Når den observerte IC50 deles på denne alternative forventet IC50, gir de innhentet FIC emergent FIC for treveis kombinasjonen, som beskrevet tidligere12. Denne vurderingen avslører at LEV + Beholderforgreningen + PNG er mer synergistiske enn hva som ville forventes fra parvis samspillet mellom tre narkotika, viser at LEV + Beholderforgreningen + PNG har emergent synergi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av NIGMS Grant P50GM107618. Forfatterne takker Zohar B. Weinstein for innsiktsfulle kommentarer og forslag på manuskriptet.
1.5 mL Semi Micro Cuvette | VWR | 97000-586 | |
1.5 mL Eppendorf Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 4036-3204 | |
1000 µL Tips | Geneseesci | 24830 | |
14 mL Breathable Cell Culture Tube | VWR | 60819-761 | |
20 µL Tips | Geneseesci | 24804 | |
200 µL Tips | Geneseesci | 24815 | |
37 °C Incubator | Panasonic | MIR-262-PA | |
37 °C Shaker Incubator | Thermo Scientific | SHKE8000 | |
5 mL Cell Culture Serological Pipette | VWR | 53300-421 | |
96-well Microplates | VWR | 15705-066 | |
Breathable Sealing Film | USA Scientific | 2920-0010 | |
DMSO | Sigma | 41647 | |
Escherichia coli | ATCC | 700926 | |
Glycerol | Sigma | G9012 | |
LB Broth Powder | RPI | L24065 | |
Levofloxacin | Sigma | 28266 | |
Micropipette | GILSON | PIPETMAN Classic | |
Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | |
Multichannel micropipette | VistaLab | 1060 | |
Nalidixic acid | Sigma | N8878 | |
Penicillin G | Sigma | P3032 | |
Pipette Pump | Drummond | 4-000-501 | |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-658 | |
Spectrophotometer | BIO-RAD | 1702525 | |
Vortex Mixer | Fisher Scientific | 10-320-807 |