यहाँ हम लाइव इमेजिंग घाव मरम्मत और vivo मेंउच्च spatio-लौकिक समाधान पर जुड़े भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि Drosophila विकास के pupal चरण का उपयोग करने के लिए दीर्घकालिक इमेजिंग सक्षम और समय के साथ विशिष्ट कोशिका आबादी की ट्रैकिंग और कुशल RNAi-मध्यस्थता जीन निष्क्रियता के साथ संगत है ।
ऊतक क्षति के लिए तेजी से भड़काऊ प्रतिक्रिया के दौरान, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं को जल्दी चोट साइट के लिए भर्ती कर रहे हैं । घाव पर एक बार, जंमजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं ऐसे संक्रमण से लड़ने के रूप में आवश्यक कार्यों, की एक संख्या प्रदर्शन, गल मलबे समाशोधन, और मैट्रिक्स जमाव उत्तेजक । आदेश में पूरी तरह से विविध संकेतन घटनाओं है कि इस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित समझने के लिए, यह (और बातचीत है कि के बीच होने के जटिल व्यवहार का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है) vivo में एकाधिक सेल वंश, और वास्तविक समय में, उच्च के साथ spatio-लौकिक संकल्प । ऑप्टिकल translucency और Drosophila भ्रूण की आनुवंशिक पथ की एक अमूल्य मॉडल के रूप में Drosophila की स्थापना की है जीने की छवि और काटना के तंत्र सहित भड़काऊ कोशिका व्यवहार के बुनियादी पहलुओं, विकासात्मक फैलाव, अपोप्तोटिक लाशों और/या माइक्रोबियल रोगजनकों की मंजूरी, और घावों को भर्ती । हालांकि, अधिक हाल के काम अब दिखा दिया है कि Drosophila जीवन चक्र में एक बहुत बाद में मंच को रोजगार- Drosophila pupa-बेहतर RNAi दक्षता, अब इमेजिंग अवधि सहित अलग लाभ, की एक संख्या प्रदान करता है, और काफी अधिक प्रतिरक्षा सेल संख्या । यहाँ हम इमेजिंग घाव की मरम्मत और लाइव Drosophila प्यूपा में उच्च spatio-लौकिक संकल्प पर जुड़े भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. दोनों पुनः epithelialization और सूजन की गतिशीलता का पालन करने के लिए, हम दोनों उपकला और जंमजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए vivo फ्लोरोसेंट मार्करों में विशिष्ट की एक संख्या का उपयोग करें । हम भी विशिष्ट प्रतिरक्षा कक्ष सबसेट का पालन करने के लिए, उनके व्यवहार को ट्रैक करने के लिए, और से हल करने के लिए, चोट साइट, जैसे Kaede के रूप में फोटो-परिवर्तनीय fluorophores की प्रभावशीलता का प्रदर्शन ।
एक कुशल और प्रभावी भड़काऊ प्रतिक्रिया किसी भी जीव को संक्रमण, स्पष्ट मलबे से लड़ने के लिए निर्णायक है, और घायल ऊतकों की मरंमत का उद्घोष1। हालांकि इस प्रतिक्रिया सबसे ऊतक नुकसान का एक अपरिहार्य परिणाम है, सूजन सख्त विनियमन की आवश्यकता है क्योंकि एक अनुपयुक्त भड़काऊ प्रतिक्रिया विभिन्न मानव रोगों की एक किस्म से जोड़ा गया है (जीर्ण गैर चिकित्सा घावों सहित, अत्यधिक scarring, और कैंसर के लिए गड़बड़ी)1,2,3। इस नैदानिक प्रासंगिकता को देखते हुए, यह आणविक और सेलुलर तंत्र की एक और अधिक विस्तृत समझ प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है भड़काऊ प्रतिक्रिया ड्राइविंग क्रम में नए शकुन संकेतकों और रणनीति विकसित करने के लिए पुरानी भड़काऊ की एक सीमा का इलाज शर्तों, जो लंबे समय तक और अनावश्यक सूजन से ऊतकों की मरंमत की रक्षा कर सकते हैं ।
हाल के वर्षों में, Drosophila एक अच्छी तरह से स्थापित और मूल्यवान मॉडल प्रणाली भड़काऊ प्रतिक्रिया की बुनियादी सुविधाओं काटना मानव4,5के लिए कीड़ों से संरक्षित हो गया है । वर्तमान में, Drosophila (जैसे चूहों या zebrafish के रूप में) अन्य प्रयोगात्मक मॉडल में वर्तमान में संभव है की तुलना में अभी तक अधिक से अधिक आनुवंशिक पथ प्रदान करता है, vivo में सटीक spatio-लौकिक आनुवंशिक हेरफेर की अनुमति (निष्क्रिय करने के लिए या पर एक परिभाषित विकासात्मक समय बिंदु पर विशिष्ट कोशिका प्रकार के भीतर ब्याज की किसी भी जीन एक्सप्रेस) और जीनोम चौड़ा स्क्रीन6,7में आसानी । परंपरागत रूप से, Drosophila में घाव भरने और सूजन के सबसे रहते इमेजिंग अध्ययन भ्रूण चरणों में प्रदर्शन किया गया है, के रूप में ( Drosophila लार्वा या वयस्कों के विपरीत) और ऑप्टिकली पारदर्शी जो सक्षम बनाता है vivo इमेजिंग8 में अद्वितीय उच्च रिज़ॉल्यूशन । यह शोधकर्ताओं ने Drosophila जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की तेजी से और मजबूत भर्ती की कल्पना करने की अनुमति दी है (hemocytes) घाव साइट करने के लिए यांत्रिक या लेजर प्रेरित चोट के जवाब में भ्रूण उपकला9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. इन जीने-आनुवंशिक हेरफेर के साथ इमेजिंग अध्ययन के संयोजन से, Drosophila भ्रूण में अध्ययन कई महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा कोशिका प्रोटीन है कि vivo मेंभड़काऊ सेल व्यवहार नियंत्रण खुला है । उदाहरण के लिए, सीईडी-1 homolog ड्रेपर (एक आईटम डोमेन प्रोटीन युक्त) एक महत्वपूर्ण ‘ क्षति रिसेप्टर ‘ है कि एक एच2ओ2में प्रतिरक्षा कोशिकाओं Drosophila भर्ती मध्यस्थता के रूप में पहचान की गई है-निर्भर तरीके की साइटों के लिए नुकसान१५. प्रतिरक्षा कोशिकाओं के भीतर ड्रेपर स्तर कैल्शियम प्रेरित JNK संकेतन और अपोप्तोटिक लाश के नीचे की और ऊपर ऊंचा12द्वारा विनियमित बारी में हैं । Hemocyte गतिशीलता आगे के लिए घाव की दिशा में समंवय के लिए जटिल cytoskeletal परिवर्तन की आवश्यकता है और यह इस तरह के actin bundling प्रोटीन Fascin16 और Rho परिवार के रूप में cytoskeletal नियामकों की गतिविधि पर निर्भर है छोटे GTPases आरएसी और Rho9.
Drosophila एक holometabolous कीट है कि अतिरिक्त लार्वा और pupal embryogenesis के बाद चरणों के माध्यम से चला जाता है, वयस्कता17तक पहुंचने से पहले है । Drosophila pupa गैर इनवेसिव लाइव के लिए एक अतिरिक्त मॉडल के रूप में विकसित किया गया है गतिशील सेलुलर घटनाओं की एक किस्म की इमेजिंग, विकासात्मक सेल प्रवास सहित18, सेल डिवीजन19, सेल विकास20, और मांसपेशी संकुचन21. हाल ही में, यह एक उपंयास मॉडल है जिसमें घाव की मरंमत और vivo मेंसूजन की गतिशीलता22,23का अध्ययन करने के लिए के रूप में स्थापित किया गया है ।
बस भ्रूण चरणों में के रूप में, Drosophila प्यूपा अपने अपारदर्शी pupal मामलों18से सावधान विच्छेदन के बाद, मोबाइल और ऑप्टिकली पारदर्शी हैं । इस ऑप्टिकल पारदर्शिता का दोहन करके, एक सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के में vivo व्यवहार का पालन कर सकते हैं (hemocytes) Drosophila pupal ऊतकों के भीतर ऊतक क्षति के जवाब में, इस तरह के pupal विंग22के रूप में. विंग परिधि के आसपास जुड़े हुए हैं कि दो बड़े फ्लैट उपकला चादरें से मिलकर, pupal विंग एक सरल bilayered संरचना के रूप में मौजूद है; इन दो उपकला परतों के बीच extracellular अंतरिक्ष hemolymph (कीट रक्त) और बड़ी संख्या में gram hemocytes24से भर जाता है. बस के रूप में भ्रूण, यांत्रिक या लेजर पंख उपकला को प्रेरित चोट चोट साइट23के लिए hemocytes की एक तेजी से भर्ती से चलाता है । हालांकि, इस pupal चरण पहले भ्रूण चरणों पर इमेजिंग के लिए कुछ अलग लाभ प्रदान करता है । घायल प्यूपा अब तक समय अवधियों पर imaged किया जा सकता है (कम से 5 ज के लिए), अधिक ऊतक क्षेत्र प्रयोगात्मक गड़बड़ी के लिए उपलब्ध है (जैसे कई घावों की पीढ़ी के रूप में) और इस स्तर पर मौजूद hemocytes के काफी अधिक संख्या में हैं ( गणितीय विश्लेषण के दौरान बेहतर सांख्यिकीय शक्ति के लिए आगे की दूरी से अधिक सेल पथ प्रदान करना). इसके अलावा, RNAi की दक्षता-मध्यस्थता जीन निष्क्रियता काफी pupal चरणों में सुधार हुआ है, की अनुमति कई जीन ‘ हो खटखटाया-नीचे ‘ एक ऊतक या समय विशेष तरीके से अधिक परंपरागत भ्रूण के पूरे उत्परिवर्ती दृष्टिकोण की तुलना में ।
आदेश में घाव फिर से epithelialization और इस नए pupal मॉडल के भीतर भड़काऊ प्रतिक्रिया के साथ की गतिशीलता का पालन करने के लिए, दो अलग सेल आबादी लेबल किया जाना चाहिए: pupal उपकला और सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं (Drosophila hemocytes) । विभिंन मार्करों के एक नंबर (सामग्री की मेज) के लिए इन दो अलग सेल आबादी लेबल उपलब्ध हैं-मार्कर का चुनाव विशेष प्रक्रिया पर निर्भर करता है का अध्ययन किया जाएगा । pupal उपकला को चिह्नित करने के लिए, Drosophila लाइनों या तो एक बैरे व्यक्त GFP-टैग ई-cadherin (कि लेबल adherens जंक्शनों) नियमित रूप से सेल मार्जिन की स्थिति, या वैकल्पिक रूप से इंगित करने के लिए उपयोग किया जाता है, एक GFP-टैग Actin-Moesin के बंधन डोमेन (है कि Actin cytoskeleton लेबल) के लिए घाव धार सिकुड़ा Actin अंगूठी और प्रमुख बढ़त की दखलंदाजी कल्पना । के लिए Drosophila hemocytes, एक hemocyte-विशिष्ट एसआरपी Gal425 परमाणु आरएफपी की अभिव्यक्ति ड्राइव (परमाणु ट्रैकिंग के लिए), cytoplasmic GFP या GFP-टैग Moesin लेबल (कोशिका द्रव्य या actin cytoskeleton, क्रमशः लेबल के लिए) या एक photoconvertible fluorophore (जैसे Kaede) का उपयोग किया जाता है । वास्तव में, यह अक्सर संयोजन में एकाधिक प्रतिरक्षा सेल मार्कर का उपयोग करने के लिए लाभप्रद है, परमाणु आंदोलन और सेल आकृति विज्ञान के एक साथ विश्लेषण सक्षम करने के लिए (प्रतिनिधि परिणाम देखें) । हालांकि, के बाद से इस प्रोटोकॉल Drosophila प्यूपा का उपयोग शामिल है, आनुवंशिक मार्करों के केवल संयोजन है कि जब तक व्यवहार्य है मध्य pupal चरणों का उपयोग किया जा सकता है । इसके अलावा, भ्रूण घातक शेयरों उपयुक्त नहीं होगा । यह एक समस्या होने की संभावना नहीं है जब इमेजिंग नियंत्रण (या जंगली प्रकार) प्यूपा पर विचार करना महत्वपूर्ण है जब जीन के लिए नीचे खटखटाया जा रहा है या व्यक्त, घाव बंद करने या सूजन पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए । जल्दी जीन पछाड़ना (या एक्सप्रेस) की वजह से घातकता के मामले में, एक Gal80टीएस निर्माण के लिए Gal4 प्रेरित पछाड़ना बाद में विकास में प्रेरित किया जा सकता है (चर्चा देखें) ।
हमारे हाल के अध्ययनों में, pupal चरण में चल रहा है हमें पर्याप्त प्रतिरक्षा कोशिका पथ डेटा इकट्ठा करने के लिए परिष्कृत गणितीय मॉडलिंग, जो बारी में हमें घाव के उपंयास विवरण deduce करने की अनुमति दी है का उपयोग भड़काऊ व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए सक्षम है भड़काऊ आकर्षित23संकेत । उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण से पता चला कि घाव chemoattractant धीरे सूजन ऊतक के माध्यम से फैलता है २०० माइक्रोन2लैंडलाइंस, एक दर तक धीमी से पहले सुझाव दिया छोटे उम्मीदवार अणुओं जैसे एटीपी या एच2ओ2 के रूप में करने के लिए सूचित कर रहे हैं 26,27,28,29फैलाना; इन छोटे “नुकसान” अणुओं के बजाय स्वतंत्र संकेतों के रूप में कार्य करने की संभावना है । इसके अलावा, जंमजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के दीर्घकालिक व्यवहार का पालन के रूप में वे एक प्रारंभिक घाव से दूर समाधान और एक दूसरे को उजागर कर रहे है (पहले के बाद विभिंन timepoints पर बना), हम एक ‘ अस्थाई ‘ ‘ संवेदनशील अवधि के दौरान खुला है जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं बाद की चोटों के लिए अंधे हैं23. pupal मॉडल की दीर्घकालिक इमेजिंग क्षमता का दोहन करके, एक साथ है Drosophila आनुवंशिक पथ के साथ, एक विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के व्यवहार का पालन कर सकते है (जैसे ही उन प्रतिरक्षा कोशिकाओं को घाव साइट पर भर्ती के रूप में) बाद अपमान के लिए उत्तर, photoconvertible fluorophore30 जो विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिका23वंश के भीतर व्यक्त किया जा सकता का उपयोग कर ।
यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए घाव की मरंमत की गतिशीलता कल्पना और उच्च spatio-लौकिक Drosophila प्यूपा का उपयोग कर संकल्प पर जुड़े भड़काऊ प्रतिक्रिया । हम प्रारंभिक प्यूपा तैयारी के लिए आवश्यक चरणों को कवर करने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान (विच्छेदन और बढ़ते) और बाद में लेजर मध्यस्थता घायल और समय-चूक इमेजिंग. हम भी vivo मेंविशिष्ट प्रतिरक्षा सेल सबसेट के लेबलिंग की अनुमति के लिए फोटो-परिवर्तनीय fluorophores के उपयोग का वर्णन । लंबी अवधि में, हम कल्पना है कि इस नए Drosophila pupal मॉडल जटिल संकेतन गतिशीलता ऊतक क्षति के लिए भड़काऊ प्रतिक्रिया अंतर्निहित विच्छेदन के लिए रोमांचक संभावनाएं खुल जाएगा । और अधिक परिष्कृत सांख्यिकीय विश्लेषण एक प्रतिक्रिया है कि अंयथा प्रयोग दुर्गम, whilst सुधार RNAi क्षमता के भीतर जीनोम चौड़ा स्क्रीनिंग के आवेदन को उधार दे सकता है की सुविधाओं को उजागर कर सकता है लागू करने से vivo में प्रतिरक्षा कोशिकाओं को प्रतिरक्षा सेल व्यवहार को विनियमित उपंयास खिलाड़ियों की पहचान ।
ऊतक क्षति के लिए तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया एक जटिल और अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है कि घायल ऊतकों की मरंमत का उद्घोष करने के लिए आवश्यक है, जिसमें गल चुके मलबे की निकासी और संक्रमण के खिलाफ लड़ाई शामिल है । को पूरी तरह से समझते है और इस प्रतिक्रिया के बुनियादी पहलुओं को जानने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि अध्ययन 3 पर vivo में प्रदर्शन कर रहे है आयामी रहने के नमूने के लिए सटीक व्यवहार और विभिंन सेल वंशावली शामिल की बातचीत के लिए पीछा किया जा सही समय के साथ । इन सेल गतिशीलता के वास्तविक समय विश्लेषण की अनुमति देता है एक अधिक विस्तृत लक्षण उत्परिवर्ती phenotypes की तुलना में स्थिर एकल समय-अंक से क्लासिक immunohistochemistry तकनीकों का उपयोग कर निर्धारित नमूनों । परंपरागत रूप से, सबसे अधिक रहते इमेजिंग आनुवंशिक रूप से परितंत्रीय Drosophila मॉडल का उपयोग कर अध्ययन अपने ऑप्टिकल translucency और बाद में विकास के चरणों की तुलना में गतिहीनता के कारण fruitfly विकास के भ्रूण चरण का इस्तेमाल किया है4 , 5. हालांकि, अधिक हाल ही में हमारे समूह और दूसरों को एक उपंयास मॉडल के रूप में Drosophila pupa विकसित किया है उच्च संकल्प और घाव की मरंमत और सूजन के दीर्घकालिक इमेजिंग प्रदर्शन के साथ ही vivo में8,22 ,23. इस उभरते दृष्टिकोण भड़काऊ कोशिका व्यवहार के बुनियादी पहलुओं को जानने के लिए एक रोमांचक दीर्घकालिक क्षमता प्रदान करता है और आगे अंय कोशिका वंश के गतिशील व्यवहार की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (जैसे Drosophila adipocytes ३८) के बाद ऊतक चोट ।
वहां तैयारी और घायल Drosophila प्यूपा कि इमेजिंग परिणामों की गुणवत्ता का निर्धारण करेगा ऊपर वर्णित इमेजिंग के दौरान महत्वपूर्ण कारकों में से एक नंबर रहे हैं । यकीनन वर्णित प्रोटोकॉल के सबसे कठिन कदम सावधान विच्छेदन और प्यूपा की सटीक स्थिति से पहले घायल और इमेजिंग है । इस विकास के चरण में प्यूपा अत्यंत नाजुक है और भी तैयारी चरणों के दौरान प्यूपा को मामूली आकस्मिक क्षति काफी प्रयोग ख़राब होगा; किसी भी प्यूपा है कि लगातार अनैच्छिक नुकसान हो सकता है प्रयोग से खारिज किया जाना चाहिए के बाद से इस नुकसान अपनी भड़काऊ प्रतिक्रिया है, जो और अधिक व्यापक प्रसार करने के लिए नेतृत्व हो सकता है (या यहां तक कि प्रणालीगत) में कहीं भी भड़काऊ सेल व्यवहार पर प्रभाव pupa । इन प्रयोगों में उपयोग प्यूपा के चल रहे विकास के कारण (जो वयस्कता के लिए ऊतकों को तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण ऊतक पुनर्व्यवस्थाओं के दौर से गुजर रहे हैं), कभी-कभार प्यूपा इमेजिंग के दौरान कदम होगा । Pupal रोलिंग है, तथापि, और अधिक होने की संभावना है अगर प्यूपा सही ढंग से flattest की सतह के साथ माउंट नहीं किया गया है विंग (या अन्य ऊतक imaged किया जा करने के लिए) coverglass के साथ सीधे संपर्क में; आवरण कांच पर प्यूपा को स्थिर करने के लिए हेप् गोंद का प्रयोग इस अवांछनीय आंदोलन को कम करना चाहिए । इस कारण से, महान देखभाल भी उनके ध्यान से संरेखित पदों से प्यूपा जब सूक्ष्मदर्शी के बीच नमूने ले जाने से बचने के लिए लिया जाना चाहिए; आदर्श रूप में, घाव लेजर एक ही माइक्रोस्कोप करने के लिए संलग्न किया जाएगा बाद में समय चूक इमेजिंग और फोटो रूपांतरण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
pupal विच्छेदन और बढ़ते कदम की प्रवीणता के अलावा, Drosophila प्यूपा का सटीक जीनोटाइप इस्तेमाल किया इमेजिंग डेटा की गुणवत्ता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव होगा उत्पंन । उदाहरण के लिए, एक व्यक्ति यूएएस Kaede के भीतर Gal4 ड्राइवर और यूएएस constructs (उदा. यूएएस-GFP या pupal-जीनोटाइप) की प्रतियां की संख्या अनुवर्ती इमेजिंग के दौरान सिग्नल-टू-शोर अनुपात निर्धारित करेगी । एक सामांय नियम के रूप में, एक Gal4 या यूएएस के अधिक प्रतियां मौजूद निर्माण, अधिक से अधिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन का कुल स्तर (जैसे GFP या Kaede) ऊतक के भीतर । फ्लोरोसेंट प्रोटीन का इष्टतम स्तर होगा, तथापि, उंनयन ऊतक प्रतिदीप्ति पर्याप्त उच्च गुणवत्ता इमेजिंग की अनुमति के बीच एक सावधान संतुलन (कम लेजर शक्तियों के उपयोग को सक्षम करने, विस्तारित समय में photobleaching और इमेजिंग में कमी पीरियड्स) लेकिन fluorophore प्रेरित सेलुलर विषाक्तता के कारण के बिना; प्रत्येक प्रयोग में Gal4 और यूएएस का इष्टतम संख्या विशेष ड्राइवरों और fluorophores इस्तेमाल किया जा रहा के अनुसार भिन्न हो जाएगा । देखभाल के लिए 25 डिग्री सेल्सियस (या ऊपर, 29 डिग्री सेल्सियस) पर प्यूपा बढ़ाने के लिए लिया जाना चाहिए क्योंकि Gal4-यूएएस प्रणाली तापमान संवेदनशील है और कम तापमान31पर अप्रभावी हो जाएगा । Gal4संचालित अभिव्यक्ति की ऊतक या समय-विशिष्टता पर नियंत्रण के अतिरिक्त स्तर को प्राप्त करने के लिए, Gal4-यूएएस प्रणाली दमन Gal80 भी pupal जीनोटाइप३९के भीतर शामिल किया जा सकता है । Gal80 या तो एक विशेष ऊतक के भीतर Gal4 गतिविधि दमन (एक ऊतक-विशिष्ट Gal80 का उपयोग कर) या एक विशेष समय (एक तापमान संवेदनशील Gal80 का उपयोग कर) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Gal4-यूएएस प्रणाली को और अन्य स्वतंत्र बाइनरी प्रणालियों के साथ संयुक्त किया जा सकता है (जैसे कि LexA-lexAop और QF-QUAS सिस्टम्स) उत्पन्न करने के लिए Drosophila जो अनेक construction (उदा. fluorophores, RNAi लाइंस या अन्य आनुवंशिक निर्माण)३९विभिन्न ऊतकों की एक सीमा में एक साथ व्यक्त किया.
इस नए Drosophila pupal मॉडल का उपयोग अधिक पारंपरिक भ्रूण दृष्टिकोण पर लाभ के एक नंबर प्रदान करता है । अल्पकालिक इमेजिंग की तुलना में (3 ज तक) चरण में उपलब्ध 15 भ्रूण (मंच है जिस पर सबसे अधिक भ्रूण घायल अध्ययन प्रदर्शन कर रहे हैं), प्यूपा समय की काफी लंबी अवधि में imaged किया जा सकता है (pupal विकास के ९६ एच के बाद वयस्कता तक प्रिंसिपल में ). इसके अलावा, hemocytes की अभी तक अधिक से अधिक संख्या (Drosophila जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं) pupal ऊतकों के भीतर मौजूद है (और इमेजिंग के लिए उपलब्ध है) भ्रूण के भीतर मौजूद अधिक सीमित संख्या की तुलना में और यह हमें काफी अधिक इकट्ठा करने की अनुमति दी है hemocyte व्यवहार पर इमेजिंग डेटा नमूनों की एक ही कुल संख्या का उपयोग कर । महत्वपूर्ण, यह, बारी में, हमें सक्षम किया गया है और अधिक परिष्कृत गणितीय मॉडलिंग hemocytes व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए और घाव attractants और भड़काऊ प्रतिक्रिया है कि अंयथा बना रहे है प्रयोग के उपंयास सुविधाओं को निकालने के लिए दुर्गम२३. pupal मॉडल का एक अंय लाभ यह है कि RNAi-मध्यस्थता जीन पछाड़ना काफी पहले भ्रूण चरणों की तुलना में अधिक कुशल है, की अनुमति ऊतक या समय की बेहतर विश्लेषण-विशिष्ट जीन इस तरह के Gal4-यूएएस प्रणाली के रूप में बाइनरी सिस्टम का उपयोग कर निष्क्रियता ३९. इस स्तर पर RNAi की दक्षता इस प्रकार है कि या तो घाव की मरंमत या भड़काऊ कोशिका व्यवहार में शामिल उपंयास खिलाड़ियों के लिए खोज करने के लिए बड़े पैमाने पर (या भी निष्पक्ष जीनोम चौड़ा) RNAi स्क्रीन प्रदर्शन करने की क्षमता को खोलता है ।
तथापि, Drosophila प्यूपा स्पष्ट रूप से phenotypes आनुवंशिक उत्परिवर्तनों जो भ्रूण घातक होते है जिसके परिणामस्वरूप का अध्ययन नहीं किया जा सकता; कार्यात्मक और जीने-जीन है कि भ्रूण के विकास के लिए आवश्यक है की इमेजिंग अध्ययन इसलिए अभी भी भ्रूण में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, जब तक RNAi-मध्यस्थता जीन पछाड़ना एक समय या ऊतक विशिष्ट तरीके से विकास परमिट के माध्यम से pupal चरणों के लिए होते हैं । भ्रूण भी अपने मूल, संपर्क-गतिवान और अपोप्तोटिक लाशों के phagocytosis के निषेध से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विकासात्मक फैलाव सहित प्रतिरक्षा कोशिका व्यवहार की कुछ सुविधाओं का अध्ययन और जीने के लिए पसंद का मॉडल रहता है विकासात्मक ऊतक5,8 जो अभी तक pupal मॉडल में नहीं देखा गया है मूर्ति के दौरान उत्पंन । हालांकि Drosophila लार्वा और वयस्कों में अध्ययन अंतर्निहित घाव की मरंमत और सूजन४०,४१,४२,४३तंत्र में एक महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है, ४४ लाइव-इमेजिंग अध्ययन इन चरणों में नमूनों की अंतर्निहित मोबाइल प्रकृति के कारण मुश्किल साबित कर दिया है । Whilst लार्वा लाइव-इमेजिंग की संक्षिप्त अवधि की अनुमति देने के लिए anesthetized जा सकता है, संज्ञाहरण के अस्थायी प्रकृति के कारण, लाइव घाव की मरम्मत या भड़काऊ प्रतिक्रिया के केवल छोटे स्नैपशॉट४५visualized किया जा सकता है । एक ताजा अध्ययन अब एक सुधार प्रोटोकॉल है कि परमिट अब लार्वा घाव भरने४६की अवधि इमेजिंग, हालांकि तैयारी और इमेजिंग अभी भी काफी अधिक भ्रूण या प्यूपा की तुलना में चुनौतीपूर्ण रहने का विकास किया है । लंबी अवधि में, हम कल्पना है कि सबसे उपयुक्त विकास के चरण का उपयोग करके प्रत्येक विशिष्ट प्रश्न का पता, इन विभिंन Drosophila चरणों के सभी चार में अध्ययन-लार्वा और pupal अवधि के माध्यम से वयस्कता के लिए भ्रूण से (प्रत्येक के साथ अपने स्वयं के अनूठे फायदे और सीमाएं)-आणविक और सेलुलर तंत्र ड्राइविंग घाव की मरंमत और सूजन में पूरक अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा ।
भविष्य में, Drosophila प्यूपा के घायल और दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए इस प्रोटोकॉल को आसानी से सूजन से संबंधित घटना की एक सीमा का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और भड़काऊ घाव प्रतिक्रिया के उपंयास सुविधाओं को उजागर करने के लिए दूरगामी क्षमता है । दीर्घकालिक इमेजिंग के संयोजन, एक साथ photoconvertible fluorophores के आवेदन के साथ (जैसे Kaede के रूप में), सहज प्रतिरक्षा कोशिका व्यवहार की गतिशीलता को समझने के लिए महान मूल्य के हैं और विशेष रूप से, अभी तक कम समझ के संकल्प चरण घाव भड़काऊ प्रतिक्रिया । विशेष रूप से या तो व्यक्तिगत या प्रतिरक्षा कोशिकाओं के उपजनसंख्या लेबल द्वारा (जैसे एक घाव में भर्ती लोगों के रूप में) यह कैसे एक पर्यावरण क्यू के लिए जोखिम का विश्लेषण संभव हो जाएगा (जैसे एक लाश या चोट के रूप में) प्रतिरक्षा है सेल बाद में प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है एक बाद क्यू. Drosophila hemocytes के भड़काऊ व्यवहार पिछले अनुभवों से बदला जा सकता है-उदाहरण के लिए, वे12 विकास के दौरान अपोप्तोटिक लाशों के पूर्व phagocytosis द्वारा ऊतक चोट का जवाब करने के लिए प्रधानमंत्री हैं, लेकिन यह देखा जा करने के लिए रहता है क्या अंय पर्यावरणीय cues समान भड़काने की घटनाओं को प्रेरित करते हैं । हालांकि pupal घावों के अध्ययन अब तक सहज भड़काऊ प्रतिक्रिया पर ध्यान केंद्रित किया है, pupal विंग मॉडल भी दोनों रहते छवि और काटना उपकला घाव की मरंमत अंतर्निहित तंत्र के लिए एक आदर्श अवसर प्रदान करता है । इसके अलावा, इस pupal इमेजिंग विधि भी ऊतक नुकसान३८के जवाब में अंय कोशिका वंश के गतिशील व्यवहार की जांच अनुकूलित किया जा सकता है, या तो pupal विंग में ही या अंय आसानी से सुलभ pupal ऊतकों (जैसे आंखें, पैर या छाती के रूप में) । अंत में, दीर्घकालिक pupal इमेजिंग, उपंयास उपकला मरंमत या भड़काऊ नियामकों की आसानी के साथ एक साथ Drosophila की आनुवंशिक पथ के संयोजन के द्वारा निष्पक्ष जीनोम के आवेदन के माध्यम से खुला हो सकता है चौड़ा दस्तक नीचे दृष्टिकोण.
The authors have nothing to disclose.
हम उपयोगी चर्चा के लिए मार्टिन, Nobes, रिचर्डसन और लकड़ी प्रयोगशालाओं के सदस्यों को धंयवाद देना चाहूंगा । हम भी Wolfson (ब्रिस्टल, ब्रिटेन के विश्वविद्यालय), ब्लूमिंगटन स्टॉक सेंटर (इंडियाना विश्वविद्यालय, यूएसए) और वियना Drosophila संसाधन केंद्र ( Drosophila स्टॉक्स के लिए) और Flybase (अप करने के लिए तारीख के लिए Drosophila धंयवाद जीन एनोटेशन) । इस काम के लिए एक MRC परियोजना अनुदान द्वारा p.m. और W.W. (MR/J002577/1), W.W. के लिए एक वेलकम ट्रस्ट वरिष्ठ फैलोशिप और एक वेलकम ट्रस्ट अन्वेषक पुरस्कार द्वारा समर्थन किया गया था ।
Drosophila stocks | |||
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII) |
Kyoto Stock Center, DGRC | #109007 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;;Ubi-p63E-shg.GFP (III) |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #58742 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
ubiquitous GFP-tagged Moesin P{sGMCA}3.1 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #59023 | The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T. |
hemocyte specific serpent-Gal4 driver ;srp-Gal4; |
Generated by Katja Bruckner | Generated by Katja Bruckner | Expression of ScerGAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004). |
UAS-nuclearRFP w1118;;P{UAS-RedStinger}6 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #8545 or #8547 | UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal |
UAS-cytoplasmicGFP ;;P{UAS-GFP.S65T} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | Multiple stocks available (e.g. #1522) | Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness. |
UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #26161 | Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV. |
GFP-tagged spaghetti squash w1118;;P{sqh-GFP.RLC} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #57145 | The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:AvicGFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ingredients for fly food media | Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.) | ||
maize | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
soya flour | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
malt extract | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
molasses | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
Difco agar | BD Biosciences, Fisher Scientific | DF0142-15-2 | For preparation of fly food |
Propionic acid | Sigma | 402907 | For preparation of fly food |
Nipagen | Sigma | 79721 | For preparation of fly food |
Dried baker's yeast | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | For preparation of fly food |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sample preparation and mounting | |||
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | For preparation of heptane glue |
Fine sable paintbrush | Daler-Rowney (or equivalent) | #0 or 1 | |
Forceps | Fisher Scientific (or Fine Science Tools) | NC9404145 | Dumont #5 |
Glass bottomed dishes for imaging | MatTek | P35G-0-10-C | We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment. |
Heptane | Sigma | 51730-5ML | For preparation of heptane glue |
Double sided sticky tape (e.g. Scotch) | Agar Scientific | AGG263 | For preparation of heptane glue |
50ml tube (for heptane glue) | Falcon tubes from Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparation of heptane glue |
Glass microscope slides | Agar Scientific | AGL4244 | For dissection of Drosophila pupae |
Dissecting stereo microscope with brightfield | Leica (or equivalent) | M50 | For dissection of Drosophila pupae |
Microscissors | John Weiss International | 103123 | Miniature Research Scissors (straight) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Laser ablation and imaging | |||
Nitogen ablation laser | Spectra-Physics (or Andor equivalent) | Model VSL-337ND-S | For wounding, this should be attached to a widefield imaging system |
Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM) | Leica (or equivalent) | TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent) | Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal) |
Environmental chamber | Life Imaging Services (or equivalent) | "Microscope Temperature Control System" | Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Image Analysis Software | |||
FRAP software module | Leica (or equivalent) | CLSM FRAP software module | For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede |
ImageJ (image analysis software) | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012. |
ImageJ plugin "Manual Tracking" | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.net/Manual_Tracking | |
ImageJ plugin "TrackMate" | ImageJ, NIH | https://imagej.net/TrackMate | Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081 |
Volocity (high performance 3D imaging software) | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | For image analysis |
IMARIS (image analysis software) | Bitplane | IMARIS for Cell Biologists | For image analysis |