Här presenterar vi ett protokoll för live-imaging såret reparation och den associera inflammatoriska reaktionen på plats och tid högupplösta i vivo. Denna metod använder Drosophila Pupp utvecklingsstadiet att möjliggöra långsiktiga imaging och spårning av viss cellpopulationer över tid och är kompatibel med effektiv RNAi-medierad genen inaktivering.
Under den snabba inflammatoriska reaktionen till vävnadsskada rekryteras snabbt celler av det medfödda immunsystemet att skadan webbplats. En gång på såret, innate immuna celler utför ett antal viktiga funktioner, som bekämpar infektion, clearing nekrotisk skräp och stimulera matrix nedfall. För att fullständigt förstå de olika signalering händelser som reglerar detta immunsvar, är det viktigt att iaktta de komplexa beteenden av (och samspel som sker mellan) flera cell härstamningar in vivo och i realtid, med höga plats och tid-temporal upplösning. Den optiska translucens och den genetiska tractability Drosophila embryon har etablerat Drosophila som en ovärderlig modell till live-bild och dissekera grundläggande aspekter av inflammatoriska celler beteende, inklusive mekanismer för utvecklingsmässiga spridning, clearance av apoptotiska kroppar eller mikrobiella patogener och rekrytering till sår. Senaste arbete har dock nu visat att anställa mycket senare i Drosophila livscykel – Drosophila puppa – erbjuder ett antal distinkta fördelar, inklusive förbättrad RNAi effektivitet, längre imaging perioder, och betydligt större immunceller nummer. Här beskriver vi ett protokoll för imaging såret reparation och den associera inflammatoriska reaktionen på det plats och tid högupplöst i levande Drosophila puppor. För att följa dynamiken i både återepitelisation och inflammation, använder vi ett antal specifika i vivo fluorescerande markörer för både epitel och innate immuna celler. Vi har även demonstrera effektiviteten av foto-Cabriolet fluorophores, såsom Kaede, för följande specifika immunceller delmängder, för att spåra deras beteende när de migrerar till, och lösa från, skadan webbplats.
En ändamålsenlig och effektiv inflammatorisk reaktion är avgörande för en organism att bekämpa infektioner, rensa skräp och dirigera reparation av skadade vävnader1. Även om detta svar är ett oundvikligt resultat av de flesta vävnadsskada, kräver inflammation strikt reglering eftersom en olämplig inflammatorisk reaktion har kopplats till en mängd olika mänskliga sjukdomar (inklusive kronisk icke-läkande sår, Överdriven ärrbildning och anlag för cancer)1,2,3. Tanke på detta kliniska relevans är det avgörande för att få en mer detaljerad förståelse av de molekylära och cellulära mekanismer som driver den inflammatoriska responsen för att utveckla nya prognostiska indikatorer och strategier för att behandla en rad kroniska inflammatoriska förhållanden, som skulle skydda reparera vävnader från långvarig och onödig inflammation.
Under de senaste åren har Drosophila blivit väletablerade och värdefulla modellsystem att dissekera de grundläggande funktionerna i den inflammatoriska reaktionen bevarad från insekter till mänskliga4,5. För närvarande erbjuder Drosophila långt större genetiska tractability än för närvarande är möjliga i andra experimentella modeller (t.ex. möss eller Sebrafisken) tillåter exakt plats och tid genmanipulation i vivo (att inaktivera eller över uttrycka någon gen av intresse inom specifika celltyper vid en definierad utvecklande tid-punkt) och användarvänlighet genome-wide skärmar6,7. Traditionellt har har de flesta live-imaging studier av läkning av sår och inflammation i Drosophila utförts på embryonala stadier, som embryon är orörliga (till skillnad från Drosophila larver eller vuxna) och optiskt genomskinlig vilket gör att oöverträffad hög upplösning i vivo imaging8. Detta har gjort det möjligt för forskare att visualisera snabb och robust rekrytering av Drosophila innate immuna celler (hemocytes) till sårområdet svar till den mekaniska eller laser-inducerad skadan till embryonala epitel9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. genom att kombinera dessa live-imaging studier med genmanipulation, studier i Drosophila embryon har upptäckt många viktiga immunceller proteiner som styr inflammatoriska celler beteende i vivo. Till exempel den CED-1 homolog Draper (en ITAM domän-innehållande protein) har identifierats som en viktig ‘skada receptor’ som medierar rekrytering Drosophila immuncellerna i en H2O2-koncentrationsberoende sätt till platser i skada15. Draper nivåer inom immunceller regleras i sin tur av kalcium-inducerad JNK signalering och förhöjda nedströms apoptotiska liket upptag12. Hemocyte motilitet ytterligare kräver komplexa cytoskeletal förändringar att samordna riktad migration mot såret och detta är beroende av aktiviteten hos cytoskeletal tillsynsmyndigheter såsom den aktin-bunta protein staden16 och familjen Rho små GTPases Rac och Rho9.
Drosophila är en holometabola insekter som går genom ytterligare larver och Pupp stadier efter embryogenes, innan att nå vuxen ålder17. Drosophila puppa har utvecklats som en ytterligare modell för icke-invasiv live-avbildning av en mängd olika dynamiska cellulära händelser, inklusive developmental cell migration18, celldelning19, cell tillväxt20och muskel kontraktion21. Mer nyligen, det har etablerat sig som en ny modell att studera dynamiken i såret reparation och inflammation i vivo22,23.
Precis som i embryonala stadier är Drosophila puppor orörlig och optiskt genomskinligt, efter noggrann dissektion från deras ogenomskinlig Pupp fall18. Genom att utnyttja detta optisk transparens, kan man följa beteendet i vivo med innate immuna celler (hemocytes) som svar på vävnadsskadan inom Drosophila Pupp vävnader, såsom Pupp wing22. Pupp vingen finns som en enkel dubbel struktur, som består av två stora platt epitelial ark som är anslutna runt flygeln periferin; extracellulära mellan dessa två epitelial skikt är fylld med hemolymph (insekt blod) och ett stort antal rörliga hemocytes24. Precis som embryon utlöser mekanisk eller laser-inducerad skada wing epitelet en snabb rekrytering av hemocytes till skada plats23. Nuläget Pupp erbjuder dock vissa distinkta fördelar för avbildning över tidigare embryonala stadier. Skadade puppor kan avbildas under mycket längre tidsperioder (för minst 5 h), mer vävnad området är tillgängligt för den experimentella störning (till exempel generationen av flera sår) och det finns betydligt större antal hemocytes närvarande vid detta skede ( att ge mer cell banor från längre avstånd för förbättrade statistiska styrkan under den matematiska analysen). Dessutom är RNAi-medierad genen inaktivering effektivitet avsevärt förbättras Pupp stegvis, så att många gener att vara ‘bankat-ned’ i en vävnad eller det tid-specifika sätt jämfört med den mer traditionella hela mutant metoden av embryon.
För att följa dynamiken i såret återepitelisation och den medföljande inflammatoriska svaren inom denna nya Pupp modell, två olika cellpopulationer måste märkas: Pupp epitelet och medfödda immuncellerna (Drosophila hemocytes). Det finns ett antal olika markörer (Tabell för material) att märka dessa två olika cellpopulationer – valet av markör beror på en given process studeras. För att markera den Pupp epitel, Drosophila rader som innehåller antingen utnyttjas en ubiquitously uttryckt GFP-märkta E-cadherin (som etiketter adherens föreningspunkter) rutinmässigt för att indikera ståndpunkter cellmarginalerna eller alternativt en GFP-märkta Aktin-bindande domänen för Moesin (som etiketter aktin cytoskelettet) att visualisera såret-kant kontraktila aktin ring och ledande utskjutande delar. Att märka de Drosophila hemocytes, en hemocyte-specifika srp-Gal425 till drive uttryck av nukleära RFP (för nukleära tracking), cytoplasmiska GFP eller GFP-märkta Moesin (för att märka cytoplasman eller aktin cytoskelettet, respektive) eller en photoconvertible fluorophore (såsom Kaede) används. I själva verket är det ofta fördelaktigt att använda flera immunceller markörer i kombination, för att aktivera samtidig analys av den kärntekniska rörelsen och cellmorfologi (se representativa resultat). Men eftersom detta protokoll innebär användning av Drosophila puppor, bara kombinationer av genetiska markörer som är livskraftig tills mitten av-Pupp stadier kan utnyttjas. Embryonala dödliga bestånd blir också inte lämplig. Detta är osannolikt att vara ett problem när imaging kontroll (eller vildtyp) puppor men är viktigt att beakta när gener rivas eller i ökad utsträckning, för att bedöma deras effekt på sårslutning eller inflammation. När det gäller tidig dödlighet orsakad av genen knockdown (eller överuttryck), en Gal80ts konstruktion kan användas för att framkalla de Gal4-driven knockdown senare i utvecklingen (se diskussion).
I vår nyligen genomförda studier, har flyttar till Pupp scenen möjliggjort att vi samla tillräckliga immunceller bana data för att analysera inflammatoriska beteende med hjälp av sofistikerad matematisk modellering, vilket i sin tur har gjort det möjligt för oss att härleda nya detaljer av såret inflammatoriska lockmedel signaler23. Till exempel visade denna metod att de sår korrektiv sprider sig långsamt genom den inflammera vävnaden på 200 μm2/min, en takt som är betydligt långsammare än tidigare föreslagit små kandidat molekyler såsom ATP eller H2O2 rapporteras till diffus26,27,28,29; dessa små ”skada” molekyler riskerar istället att fungera som tillåtande signaler. Dessutom genom att följa den långsiktiga beteenden av innate immuna celler som de lösa från ett inledande sår och utsätts för en sekund (gjorda vid olika tidpunkter efter först), har vi funnit en tillfällig ‘desensibilisering’ period under vilken immunceller är blinda för efterföljande skador23. Genom att utnyttja den långsiktiga imaging potentialen i Pupp-modellen, tillsammans med Drosophilas genetiska tractability, kan man följa beteendet hos vissa immunceller populationer (t.ex. endast de immuna celler rekryteras till sårområdet) i svar till efterföljande förolämpningar, använder de photoconvertible fluorophore30 som kan uttryckas enbart inom de immunceller härstamning23.
Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera dynamiken i såret reparation och den associera inflammatoriska reaktionen på plats och tid högupplösta använder levande Drosophila puppor. Vi tillhandahåller en detaljerad metod för att täcka de steg som krävs för inledande puppor beredning (dissektion och montering) och den efterföljande laser-medierad såra och time-lapse bildtagning. Vi beskriver också användning av foto-Cabriolet fluorophores att tillåta märkning av specifika immunceller delmängder i vivo. På lång sikt föreställer vi att denna nya Drosophila Pupp modell öppnar spännande möjligheter för dissekera komplexa signalering dynamiken bakom den inflammatoriska responsen till vävnadsskada. Genom att tillämpa mer sofistikerade statistiska analyser kan man avslöja funktioner svaret som annars skulle förbli experimentellt oåtkomliga, medan förbättrad RNAi effektiviteten kunde lämpar sig för tillämpningen av genome-wide screening inom immunceller i vivo att identifiera nya spelare reglera immunceller beteende.
Den akuta inflammatoriska reaktionen till vävnadsskada är en komplex och mycket dynamisk process som är nödvändig för att dirigera reparation av skadade vävnader, inklusive clearance av nekrotisk skräp och kampen mot infektion. För att fullt ut förstå och riva upp grundläggande aspekter av detta svar, är det viktigt att studier är utförda i vivo på 3-dimensionella levande prover för den exakta beteenden och samspelet mellan de olika cell härstamningar inblandade att följas exakt över tid. Realtidsanalys av dessa cell dynamics tillåter en mer detaljerad karakterisering av muterade fenotyper än statisk enda tidpunkter från fasta prover med klassiska immunohistokemi tekniker. Traditionellt har har de flesta live-imaging studier med hjälp av genetiskt eftertraktansvärda Drosophila -modellen använt det embryonala utvecklingsstadiet fruitfly tack vare dess optiska translucens och orörlighet jämfört med senare utvecklingsstadier4 , 5. mer nyligen vår grupp och andra har emellertid utvecklat Drosophila puppa som romanen modell att utföra hög upplösning och långsiktiga imaging av såret reparation och inflammation samtidigt in vivo8,22 ,23. Denna nya strategi erbjuder en spännande långsiktig potential för reda ut grundläggande aspekter av inflammatoriska celler beteendet och kan anpassas ytterligare för att undersöka andra cell-linjer (såsom Drosophila adipocyter dynamiska beteende 38) efter vävnadsskada.
Det finns ett antal kritiska faktorer under förberedelse och avbildning av sårade Drosophila puppor som avgör kvaliteten på de imaging resultaten som beskrivs ovan. Förmodligen är det svåraste steget av protokollet beskrivs den noggrann dissektion och exakt positionering av the puppor före såra och imaging. Puppor på denna utvecklingsfas är ytterst sårbara och även mindre oavsiktliga skador på puppor under beredning faser kommer avsevärt försämra experimentet; alla puppor som kan ha en oavsiktlig skada måste kasseras från experiment eftersom denna skada kunde aktivera sin egen inflammatorisk reaktion, vilket kan leda till mer utbredd (eller ens systemisk) effekter på inflammatoriska celler beteende någon annanstans i puppa. På grund av den pågående utvecklingen av de puppor som utnyttjas i dessa experiment (som genomgår betydande vävnad omflyttningar för att förbereda vävnader för vuxenlivet), ibland puppor kommer att flytta under imaging. Pupp rullande är, emellertid, mer sannolikt att uppstå om puppor inte har monterats korrekt med plattaste ytan av vingen (eller annan vävnad att avbildas) i direkt kontakt med täckglas; användning av heptan lim för att stabilisera puppor på täckglaset bör minimera denna oönskade rörelse. Därför måste också vara mycket försiktig att undvika lossnar puppor från sina noggrant justerad positioner när du flyttar proverna mellan Mikroskop; idealiskt, skadade lasern kopplas till samma mikroskopet ska användas för efterföljande time-lapse bildbehandling och foto-konvertering.
Förutom kunnande av Pupp dissektion och montering steg, kommer att exakta genotypen av the Drosophila puppor används ha en betydande inverkan på kvaliteten på de imaging data som genereras. Till exempel avgör antal kopior av Gal4 förare och UAS konstruktioner (t.ex. UAS-GFP eller UAS-Kaede) inom en enskild Pupp genotyp signal-brus-förhållandet under efterföljande imaging. Som en allmän regel konstruera fler kopior av en Gal4 eller UAS närvarande, desto större den totala nivån av fluorescerande protein (t.ex. god Jordbrukarsed eller Kaede) i vävnaden. Den optimala nivån av fluorescerande protein kommer dock en noggrann avvägning mellan upplyftande vävnad fluorescens tillräckligt för att tillåta hög kvalitet imaging (möjliggör användning av lägre laser befogenheter, minskning av fotoblekning och imaging över längre tid perioder) men utan att orsaka fluorophore-inducerad cellulär toxicitet. det optimala antalet Gal4 och UAS konstruktioner i varje experiment kommer att variera beroende på särskilda drivrutiner och fluorophores som används. Försiktighet bör iakttas att höja puppor vid 25 ° C (eller ovan, upp till 29 ° C) eftersom Gal4-UAS är temperaturkänsliga och kommer att vara ineffektiva på lägre temperaturer31. För att uppnå ytterligare nivåer av kontroll över vävnaden eller tid-specificitet Gal4 –driven uttryck, kan den Gal4-UAS system repressor Gal80 också omfattas av den Pupp genotyp39. Gal80 kan antingen användas för att förtrycka Gal4 aktivitet inom en viss vävnad (med en vävnadsspecifika Gal80) eller vid en viss tidpunkt (med en temperatur känslig Gal80). Gal4-UAS systemet kan ytterligare kombineras med andra oberoende binära system (såsom LexA –lexAop och QF –QUAS system) för att generera Drosophila som har flera konstruktioner (t.ex. fluorophores, RNAi linjer eller andra genetiska konstruktioner) uttryckte samtidigt i en rad olika vävnader39.
Användningen av denna nya Drosophila Pupp modell erbjuder ett antal fördelar jämfört med den mer traditionella embryo-metoden. Jämfört med den kortsiktiga imaging (upp till 3 h) tillgängliga i etapp 15 embryon (scenen på som mest embryonala såra studier utförs), puppor kan avbildas under betydligt längre tid (i princip förrän i vuxen ålder efter 96 Tim Pupp utveckling ). Dessutom mycket större antalet hemocytes (Drosophila innate immuna celler) är närvarande inom Pupp vävnader (och tillgänglig för imaging) jämfört med det mer begränsade antalet närvarande inom embryot och detta har gjort det möjligt för oss att samla in betydligt mer Imaging data på hemocyte beteende med samma totala antal exemplar. Avgörande, gjort detta, i sin tur det möjligt att applicera mer sofistikerad matematisk modellering för att analysera hemocytes beteende och extrahera roman funktionerna i såret tilldragande och inflammatorisk reaktion som annars skulle förblivit experimentellt otillgängliga23. En annan fördel med Pupp modellen är att RNAi-medierad gen knockdown är betydligt effektivare än i tidigare embryonala stadier, möjliggör förbättrad analys av vävnad eller tid-specifika genen inaktivering med binära system såsom Gal4-UAS system 39. effektiviteten av RNAi i detta skede öppnas således potential att utföra storskaliga (eller ens opartisk genome-wide) RNAi-skärmar för att söka efter nya spelare involverade i antingen såret reparation eller inflammatoriska celler beteende.
Men Drosophila puppor klart inte kan användas att studera de fenotyper som följd av genetiska mutationer som är embryonala dödliga; funktionella och live-imaging studier av gener som är viktiga för embryonal utveckling måste därför fortfarande utföras i embryon, om inte RNAi-medierad gen knockdown i en tid eller vävnadsspecifika sätt tillåter utveckling att ske genom att Pupp stadier. Embryot är också modellen av val att studera och leva-bild vissa funktioner av immunceller beteende, inklusive utvecklingsmässiga utspridningen av immunceller från deras ursprung, kontakt-hämning av förflyttning och fagocytos av apoptotiska lik genereras under utvecklande vävnad skulptera5,8 , som ännu inte har iakttagits i Pupp-modeller. Även om studier i Drosophila larver och vuxna har lämnat en viktig inblick i mekanismerna bakom såret reparation och inflammation40,41,42,43, 44 live-imaging studier i dessa skeden har visat sig svårt på grund av proverna inneboende mobila. Medan larver kan vara sövda för att korta perioder av live-imaging, på grund av den tillfälliga karaktären hos anestesi, endast korta ögonblicksbilder av levande såret reparera eller inflammatoriska reaktionen kan vara visualiserade45. En färsk studie har nu utvecklat ett förbättrat protokoll som tillåter långsiktiga avbildning av larval sårläkning46, även förberedelse och imaging fortfarande är betydligt mer utmanande än i embryon eller puppor. På lång sikt föreställer vi att genom att utnyttja den lämpligaste utvecklingsstadier för att hantera varje specifik fråga, studier i alla fyra av dessa olika Drosophila stadier – från embryon genom larver och Pupp perioder till vuxen ålder (var och en med sina egna unika fördelar och begränsningar) – kommer att ge kompletterande insikter i den molekylära och cellulära mekanism körning såret reparation och inflammation.
I framtiden, detta protokoll för såra och långsiktiga avbildning av Drosophila puppor lätt kan anpassas att studera en rad inflammation-relaterade fenomen och har långtgående potential för avslöjande roman funktioner av inflammatoriska sår svar. Kombinationen av långsiktiga imaging, tillsammans med tillämpningen av photoconvertible fluorophores (till exempel Kaede), är av stort värde för att förstå dynamiken i medfödda immunceller beteende och särskilt långt mindre förstås resolution fas av den inflammatoriska reaktionen i såret. Av specifikt märkning antingen individuell eller subpopulationer av immunceller (t ex rekryterade till ett sår) kommer det vara möjligt att analysera hur exponering för en miljömässig cue (t.ex. en liket eller skada) påverkar cellens immun efterföljande svar till en senare Cue. Drosophila hemocytes provocerande beteende kan ändras genom tidigare erfarenheter – till exempel de är trimmade för att bemöta vävnadsskada av tidigare fagocytos av apoptotiska lik under utveckling12 men det återstår att se huruvida andra miljömässiga cues framkalla liknande priming händelser. Även om studier av Pupp sår hittills har fokuserat på de medfödda inflammatoriskt svaren, Pupp wing modellen också ger ett utmärkt tillfälle att både live-bild och dissekera mekanismerna bakom epitelial sår reparation. Dessutom kan denna Pupp bildgivande metod också anpassas för att undersöka andra cell härstamningar svar på vävnad skador38, antingen i Pupp vingen själv eller andra lättillgängliga Pupp vävnader (t.ex. ögonen, ben eller bröstkorg) dynamiska beteende. Slutligen, genom att kombinera den genetiska tractability av Drosophila tillsammans med användarvänlighet långsiktiga Pupp imaging, romanen epitelial reparation eller inflammatoriska tillsynsmyndigheter kunde bli upptäckt genom tillämpning av opartisk genome-wide knock-down tillvägagångssätt.
The authors have nothing to disclose.
Vi skulle vilja tacka ledamöterna av Martin, Nobes, Richardson och trä labs för bra diskussion. Vi tackar också Wolfson Bioimaging anläggningen (universitetet i Bristol, UK), Bloomington lager centrum (Indiana University, USA) och Vienna Drosophila Resource Centre (för Drosophila bestånd) och Flybase (för aktuell Drosophila gen annotation). Detta arbete stöds av en MRC projektbidrag till P.M. och WW (herr/J002577/1), en Wellcome Trust Senior Fellowship till WW och en Wellcome Trust Investigator Award till P.M..
Drosophila stocks | |||
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII) |
Kyoto Stock Center, DGRC | #109007 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;;Ubi-p63E-shg.GFP (III) |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #58742 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
ubiquitous GFP-tagged Moesin P{sGMCA}3.1 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #59023 | The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T. |
hemocyte specific serpent-Gal4 driver ;srp-Gal4; |
Generated by Katja Bruckner | Generated by Katja Bruckner | Expression of ScerGAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004). |
UAS-nuclearRFP w1118;;P{UAS-RedStinger}6 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #8545 or #8547 | UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal |
UAS-cytoplasmicGFP ;;P{UAS-GFP.S65T} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | Multiple stocks available (e.g. #1522) | Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness. |
UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #26161 | Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV. |
GFP-tagged spaghetti squash w1118;;P{sqh-GFP.RLC} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #57145 | The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:AvicGFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ingredients for fly food media | Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.) | ||
maize | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
soya flour | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
malt extract | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
molasses | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
Difco agar | BD Biosciences, Fisher Scientific | DF0142-15-2 | For preparation of fly food |
Propionic acid | Sigma | 402907 | For preparation of fly food |
Nipagen | Sigma | 79721 | For preparation of fly food |
Dried baker's yeast | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | For preparation of fly food |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sample preparation and mounting | |||
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | For preparation of heptane glue |
Fine sable paintbrush | Daler-Rowney (or equivalent) | #0 or 1 | |
Forceps | Fisher Scientific (or Fine Science Tools) | NC9404145 | Dumont #5 |
Glass bottomed dishes for imaging | MatTek | P35G-0-10-C | We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment. |
Heptane | Sigma | 51730-5ML | For preparation of heptane glue |
Double sided sticky tape (e.g. Scotch) | Agar Scientific | AGG263 | For preparation of heptane glue |
50ml tube (for heptane glue) | Falcon tubes from Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparation of heptane glue |
Glass microscope slides | Agar Scientific | AGL4244 | For dissection of Drosophila pupae |
Dissecting stereo microscope with brightfield | Leica (or equivalent) | M50 | For dissection of Drosophila pupae |
Microscissors | John Weiss International | 103123 | Miniature Research Scissors (straight) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Laser ablation and imaging | |||
Nitogen ablation laser | Spectra-Physics (or Andor equivalent) | Model VSL-337ND-S | For wounding, this should be attached to a widefield imaging system |
Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM) | Leica (or equivalent) | TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent) | Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal) |
Environmental chamber | Life Imaging Services (or equivalent) | "Microscope Temperature Control System" | Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Image Analysis Software | |||
FRAP software module | Leica (or equivalent) | CLSM FRAP software module | For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede |
ImageJ (image analysis software) | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012. |
ImageJ plugin "Manual Tracking" | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.net/Manual_Tracking | |
ImageJ plugin "TrackMate" | ImageJ, NIH | https://imagej.net/TrackMate | Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081 |
Volocity (high performance 3D imaging software) | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | For image analysis |
IMARIS (image analysis software) | Bitplane | IMARIS for Cell Biologists | For image analysis |