الميتوكوندريا المتخصصة ريبوسوم التي تختلف عن نظيراتها البكتيرية وحشوية. هنا نعرض كيف يمكن الحصول على ميتوريبوسوميس من تلك المقصورة الأصلية في الخلايا HEK. الأسلوب الذي ينطوي على عزل الميتوكوندريا من تعليق الخلايا وما يترتب عليها من تنقية ميتوريبوسوميس.
الميتوكوندريا البشرية تمتلك مجموعة مخصصة من ريبوسوم (ميتوريبوسوميس) أن ترجمة مكونات البروتين الضروري 13 من المجمعات الفسفرة المشفرة بواسطة الجينوم المتقدرية. منذ جميع البروتينات تصنيعه من قبل ميتوريبوسوميس البشرية بروتينات الغشاء لا يتجزأ، المربوطة ميتوريبوسوميس البشرية للغشاء الداخلي المتقدرية أثناء الترجمة. بالمقارنة مع الريبوسوم سيتوسوليك ميتوريبوسومي لديه معامل ترسب 55S ونصف محتوى الرنا الريباسي، لا الرنا الريباسي 5S والبروتينات الإضافية 36. ولذلك، أعلى نسبة البروتين للجيش الملكي النيبالي وبنية شاذة تجعل ميتوريبوسومي البشرية متميزة إلى حد كبير من نظيرتها في سيتوسوليك.
وعلى الرغم من الأهمية المركزية ميتوريبوسومي للحياة، لا يوجد أية بروتوكولات متاحة لتنقية المجمع سليمة من خطوط الخلايا البشرية. تقليديا، كانت ميتوريبوسوميس المعزولة من الأنسجة الحيوانية الغنية الميتوكوندريا التي تتطلب كيلوغراما من ابتداء من المواد. نحن مسبب أن الميتوكوندريا في تقسيم الخلايا البشرية المستمدة من HEK293 التي نمت في المتوسط التعبير الغنية بالمغذيات سيكون بترجمة المتقدرية نشطة، ولذلك يمكن أن يكون مصدر مناسب من المواد لدراسات هيكلية والبيوكيميائية ميتوريبوسومي. للتحقيق في هيكلها، قمنا بتطوير بروتوكول لتنقية ميتوريبوسوميس سليمة من خلايا HEK على نطاق واسع. وهنا، نقدم أسلوب التجويف النيتروجين كأسرع وأقل البديلة ذات العمالة الكثيفة وأكثر كفاءة بالطرق الميكانيكية التقليدية المستندة إلى القص لتحلل الخلية. وادي هذا إلى الأعمال التحضيرية ميتوريبوسومي التي سمحت لتصميمها الهيكلي بدقة عالية، والكشف عن تكوين ميتوريبوسومي الإنسان سليمة والوسيطة في الجمعية. هنا، علينا متابعة هذا العمل ويقدم محسنة وأكثر طريقة فعالة من حيث التكلفة التي تتطلب فقط 10 ~10 استزراع الخلايا HEK. الطريقة التي يمكن أن تستخدم لتنقية ميتوريبوسومال البشرية ترجمة المجمعات وطفرات وجمعيات مراقبة الجودة ووسيطة مفارز ميتوريبوسومال. التنقية يمكن أن يكون خطيا الارتقاء بعشرة إضعاف إذا لزم الأمر، وتنطبق أيضا على أنواع أخرى من الخلايا.
تستند عملية تخليق البروتين المتقدرية 13 طن متري-مرناس الأساسية التي يتم ترجمتها بواسطة ميتوريبوسومي المرفقة بغشاء متخصصة تشكل جوهر السلسلة التنفسية الحفاز. الجينوم المتقدرية غيرت والحاجة للبروتينات لإدراج كوترانسلاتيونالي في الغشاء شكلت إلى حد كبير هيكل ريبوسوم المتقدرية1. أظهرت مؤخرا هياكل ميتوريبوسومي الثدييات ذات الدقة العالية مظهر العام مختلفة لافت للنظر إلى نظيره البكتيرية2،3. خاصة، إضافة على الأقل 36 الخاصة الميتوكوندريا البروتينات، المساهمة ~ 1 جمعية نجمة داود الحمراء الكتلة الجزيئية إضافية، في حين خفضت من شقين الرنا الريباسي طن متري واختلفت بدرجة عالية. تغيير ترتيبات هيكلية جديدة تقريبا كافة الميزات الفنية الحاسمة سابقا المقبولة عموما أن يكون عالمياً حفظت4.
العناصر الرئيسية الجديدة قد اكتسبت بكل واحد من الوحدات الفرعية ميتوريبوسومال، على سبيل المثال، أدمجت وحدة فرعية صغيرة mS29 بروتين GTPase جوهرية في منطقتها ‘رأس’. لم يتم اكتشاف نشاط GTPase في أنظمة الترجمة الأخرى، والهيكل يشير إلى أن جتباسي قد يكون دور في فرعية للجمعية2. مفقود في ميتوريبوسومي الثدييات الرنا الريباسي 5S الذي يعتقد أنه معلما من جميع مفارز كبيرة ريبوسومال المعروفة، تشكل جوهر الناشزة المركزية، وقد اعتمدت طن متري-الحمض الريبي النووي النقال-Val كلبنة لا يتجزأ بدلاً من2. الحظر والزملاء وأظهرت أن ميتوريبوسومي الخنزير طن متري-الحمض الريبي النووي النقال-الفنيل ألانين ولا – فال5. تشرزانووسكا-لايتووليرس، مينكزوك، والزملاء بمتابعة هذه البيانات ووجدت أن ميتوريبوسوميس من المرضى مع الشبهة طن متري-الحمض الريبي النووي النقال-Val الاستقرار يمكن أن تستوعب في المبدأ6طن متري-الحمض الريبي النووي النقال-Phe،7. لماذا أدرجت ميتوريبوسوميس هذه العناصر المحددة والمسارات و عبر-عوامل مطلوبة من أجل هذه التجميعات فريدة لا تزال غير معروفة.
إجمالاً، يعني تعقيد عالية ميتوريبوسومي البشرية ومكونات البروتين جديدة، ورابطة فريدة من نوعها للحمض الريبي النووي النقال طن متري كعنصر هيكلي مشاركة الميتوكوندريا على حدة كحتى الآن-المجهول عبر-العوامل. ومع ذلك، نظراً لأن العديد من ميزات هذا النظام فريدة من نوعها إلى الميتوكوندريا، التي كانت تقليديا صعبة التحقيق8، يعرف الكثير عن الآلية الجزيئية ومراقبة الجودة. مع وضع تحليل الجسيمات مفردة ذات الدقة العالية بالإلكترون cryo-مجهرية (cryo-م)20، تنشأ الفرص الآن لدراسة شاملة الآليات الجزيئية الكامنة وراء الجمعية، والعمل ومراقبة الجودة للإنسان ميتوريبوسومي. يقدم تقريرنا لهيكل الجمعية العامة ميتوريبوسومي البشرية الوسيطة الأولى الاعتراف بأنه من الممكن تصور كيف يتم تشكيل ميتوريبوسومي البشرية ويظهر أن البرد-م دور أساسي في تحديد هوية جديدة عبر– العوامل الجمعية بالإنابة9.
لتوسيع نطاق هذا الجهد الأولى، يصف لنا بروتوكول سريع لتنقية ميتوريبوسومي البشرية بالتفصيل. ويرد في الجزء الأول من البروتوكول، عزلة على نطاق واسع من الميتوكوندريا سليمة نقية جداً من الخلايا تعليق. هذا الإجراء يتطلب ح 9 ويمكن تعديلها بسهولة وتكييفها لأنواع مختلفة من الخلايا والنطاقات. خطوة هامة في هذا البروتوكول هو استخدام النتروجين التجويف كسر فتح الخلايا. تم وضع الجزء الثاني من البروتوكول لتنقية ميتوريبوسوميس. هذا الإجراء يتطلب ح 7 وينتج كمية كافية من ميتوريبوسوميس للدراسات الكيميائية الحيوية والهيكلية. استخدام الميتوكوندريا نقية كانطلاق مادة يقدم الاستعدادات النهائية عالية الجودة ويمكن استقراء للجزيئات الأخرى المتقدرية.
وفيما يتعلق بمصدر ابتداء من المواد، على الرغم من توافر سهلة نسبيا من الأنسجة الحيوانية التي هي معروفة لتكون مصدرا غنيا من الميتوكوندريا، يجعلها خياراً شعبيا ل، ميتوريبوسوميس،من35،12 13، لا يمكن تعديلها والمستنسخة في المختبر بسهولة وراثيا. ومن ثم، هناك حاجة عملية واضحة لتطوير البروتوكولات التي تشمل خطوط الخلايا البشرية البلوتينيوم المستزرعة. والفرق الرئيسي بين البروتوكولات هو التعامل مع الأنسجة والخلايا المستزرعة طريقة تحلل والتجانس. للخلايا المستزرعة نمت كأحادي الطبقة، هو أسلوب نموذجي تفلون/الزجاج دونس التجانس14. تم وضع البروتوكولات الإعداد الأصلي بينما تتسم بالكفاءة لجداول صغيرة15. المباشر الارتقاء بتوظيف الخالطون بسعة 500 مل ممكن11، بيد أنه يتطلب ح ~ 2 من العمل اليدوي لتحقيق تحلل 80%. هذا وعرض القضايا على الأقل ثلاثة: تجميع العضيات بسبب أوقات الانتظار الطويلة، وتحلل غير متجانسة بسبب المواد الثقيلة غرق إلى الجزء السفلي من سفينة كبيرة، تدفئة العينة نظراً لضرورة ضربات متعددة. ولذلك، يستخدم أسلوب أفضل لتحلل التجويف النيتروجين، الذي يستند إلى الضغط من،من16سفينة مضغوط17. في هذا الأسلوب، يتم أولاً تضخم الخلايا في الغرفة الباردة من أجل تليين الخلايا وتجعلها أكثر عرضه لتحلل. كما أنها توضع في الجهاز التجويف النيتروجين يتم إضافة المخزن مؤقت الذي يحتوي على السكروز والمانيتول حفاظا ضغط الاسموزي التي سوف تساعد في الحفاظ على سلامة الميتوكوندريا. ثم يتم الضغط الجهاز التجويف النيتروجين مع كمية كبيرة من النيتروجين خالية من الأكسجين، الذي يذوب في الخلايا. ما الضغط فقاعات النيتروجين المفرج عنهم من الحل أسفر عن تمزيق أغشية الخلايا. هذا الأسلوب يوفر العديد من المزايا الميكانيكية أساليب التماثل التي تنطوي على تشدد على القص والاحتكاك على النحو التالي: 1) هو تجنب أي الإجهاد البدني الخارجي على الخلايا؛ 2) توسع كظومه أن يبرد العينة، يضمن أي أضرار الحرارة العضيات؛ 3) المكونات خلية محمية من الأكسدة بغاز النيتروجين خامل؛ 4) تغيير درجة الحموضة أي تعليق المتوسطة؛ 5) عملية موحدة واستنساخه لأنه يتم تطبيق نفس القوى التخريبية داخل كل خلية وفي جميع أنحاء العينة؛ 6) هذه العملية بسرعة ويمكن أن تنجز في غضون 20-30 دقيقة.
وصف عزلة الميتوكوندريا من استزراع الخلايا والأنسجة في الأدب على نطاق واسع، وهو يستند إلى اضطراب خلية لطيف متبوعاً بسلسلة من سينتريفوجيشنز التفاضلية. معظم البروتوكولات المستخدمة حاليا اتبع الإجراءات الأصلية التي وضعت في منتصف القرن السابق18. في حين أن النهج البيوكيميائية الأساسية الصحيحة، وهناك العديد من المفاهيم الخاطئة التي سلط عليها الضوء في الأدب، وظلت غير مكتشفة. لتحسين بروتوكول ميتوريبوسوميس، نحن التحقيق في المبادئ العامة التي تم الإبلاغ عنها بشكل منتظم ونستنتج أن: 1) إدراج Mg2 + وك+ في المخزن المؤقت غير حاسمة. وقد قيل أن يساعد بوكل للحيلولة دون تشكيل جل19، غير أن البروتينات هيولى المقدمة إضعاف كافية على النحو المبين في البروتوكول، ولدينا لا تحدث هذه الظاهرة. وعلاوة على ذلك، استبعاد Mg2 + مفيدة لتقليل التلوث من ريبوسوم هيولى20؛ 2) ليس هناك حاجة إبقاء نسبة أقصى حجم ممكن من الخلايا إلى المتوسط لحماية العضيات المفرج عنهم من بيئة هيبو ناضح. بما فيه الكفاية وتقدم الدعم ناضح لدينا بروتوكول المخازن المؤقتة التي تحتوي على السكروز، وتمييع الخلايا مع المخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا (الخطوة 2.II.5) أمر حاسم لفصل العضيات في تحضير على نطاق واسع كفاءة.
الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا قريبة من القيم الفسيولوجية، أي 7.5، وهو أيضا الرقم الهيدروجيني الأمثل لإعداد ميتوريبوسومي التالية. عوامل الربط يدتا وعطا تضاف إلى وسائل الإعلام العزلة يخلب أيونات تلويث، وأنهم يخلب الحرة المغنيسيوم والكالسيوم، على التوالي. قد سبق أن إدراج يدتا يمكن أن يؤدي إلى أضرار غشاء الميتوكوندريا الداخلية14، ولذلك يقتصر التركيز على 1 مم كإجراء وقائي. وقد لاحظنا لا أي فرق عند استخدام 5 مم يدتا في الخطوة النهائية تنقية من السكروز الكثافة المتدرجة.
هنا يستخدم بروتوكول وصف الخلايا البشرية المستمدة من HEK293S لتنقية ميتوريبوسومي. يسمح نوعية الإعداد العينة التي تم الحصول عليها التحقيق المتحلل وهيكليا للقرار الذري. هذا يسمح لأحد بتطبيق الأسلوب على ميتوريبوسومال البشرية ترجمة المجمعات ومجالس مراقبة الجودة، ووسيطة مفارز ميتوريبوسومال. وعلاوة على ذلك، حيث قد تتضخم الخلايا السرطانية قدرة أوكسفوس وترجمة البروتين المتقدرية مرتفعة بالمقارنة مع النسيج المجاور stromal21، ميتوريبوسوميس أهداف المخدرات المنشأة للسرطان22. ولذلك، سوف يكون استخدام هذا البروتوكول لتنقية محددة من ميتوريبوسوميس في وجود مثبطات التطبيقات الطبية. أيضا، قد ربطت الطفرات ميتوريبوسومال بأمراض وراثية المتقدرية23. نظراً لهذه الطفرات لها آثار مباشرة على الهيكل، النهج الذي قدم هنا ستكون مفيدة لتكييفها الهيكلي. يمكن توسيع نطاق البروتوكول تجريبيا وتطبيقها على مجموعة متنوعة من المسائل العلمية معالجة فهم أساسي للترجمة في الميتوكوندريا البشرية وأهميتها الطبية.
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل كان تدعمها “المؤسسة السويدية” للبحوث الاستراتيجية (FFL15:0325 منحة قادة المستقبل)، ومؤسسة سودربيرغ راغنار (زمالة في الطب M44/16)، ومجلس البحوث السويدية (× NT “المنحة ابتداء من” عام 2015-04107)، الزمالة الطويلة الأجل فيبس (SA) ، H2020-مسكاً-أي تي-2016 مشروع 721757 (ص).
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate | Thermo Scientific | 31966-021 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 16000-044 | |
Blasticidin S HCl | Thermo Scientific | R210-01 | |
Zeocin selection reagent | Thermo Scientific | R25001 | 100 mg/ml |
Freestyle 293 Expression medium | Thermo Scientific | 12338026 | |
T175 tissue culture flask with vented cap | Sarstedt | 83.3912.002 | |
Shaker flasks with vented cap | Thermo Scientific | 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800 | |
250 ml conical bottle tubes, sterile | Corning | 430776 | |
Eve automated cell counter | NanoEnTek | E1000 | |
Nitrogen cavitation cell disruption vessel | Parr Instruments | 4635, 4639 | safety volume: 40ml, 600ml respectively |
Dnase (RNA-free) | HT Biotechnology | N401a | |
Teflon/glass dounce homogenizers | Cambridge Glassblowing Limited | Size designed upon request | |
SW40 tubes for mitochondria gradient | Beckman | 344060 | Polypropylene, thin wall |
Transfer pipettes | Sarstedt | 86.1171 | |
TLA 120.2 tubes for cushion | Beckman | 343778 | Polycarbonate, thick wall |
TLS-55 tubes for gradient | Beckman | 347356 | Ultra-clear |
Gradient Station IP | BioComp | 153-002 |