Summary
미토 콘 드리 아 리보솜 그들의 세균 및 세포질에서 갈라 전문 있다. 여기 우리가 어떻게 mitoribosomes HEK 세포에서 그들의 기본 구획에서 얻어질 수 있다 보여줍니다. 방법은 정지 세포에서 미토 콘 드리 아의 절연 및 mitoribosomes의 결과 정화를 포함 한다.
Abstract
인간의 미토 콘 드리 아 리보솜 (mitoribosomes)는 미토 콘 드리 아 게놈에 의해 산화 인 산화 복합물의 13 필수 단백질 구성 요소를 변환 하는 전용된 세트를 소유한 다. 모든 단백질 합성 인간 mitoribosomes에 의해 완전 한 막 단백질 이기 때문에, 인간 mitoribosomes 번역 중 미토 콘 드리 아 내 막에 닿는. Cytosolic 리보솜에 비해는 mitoribosome 55S, 절반 rRNA 콘텐츠, 아니 5S rRNA 및 36 추가 단백질의 침전 계수가 있다. 따라서, 더 높은 단백질 대 RNA 비율이 비정형 구조 확인 인간의 mitoribosome 그것의 cytosolic 대응에서 실질적으로 별개.
생활에 mitoribosome의 중앙 중요성에도 불구 하 고 아무 프로토콜 인간 세포에서 그대로 복잡 한 정화를 사용할 수 없었습니다. 전통적으로, mitoribosomes 킬로그램을 요구 하는 미토 콘 드리 아-풍부한 동물의 조직에서 고립 되었다 시작 물자의. 우리는 나누어 HEK293 파생 된 인간 세포 영양이 풍부한 식 중간에 성장에서 미토 콘 드리 아 활성 미토 콘 드 리아 번역 했 고, 따라서, 재료의 구조 및 생 화 확 적인 연구의 적당 한 원천이 될 수 있는 권유 mitoribosome입니다. 그것의 구조를 조사, 우리는 HEK 세포에서 그대로 mitoribosomes의 대규모 정화에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 여기, 우리는 빠른 노동 집약 하 고 보다 효율적인 방법 대안을 전통적인 기계적 전단 기반 세포 세포의 용 해에 대 한 더 적은 질소 현상 방법 소개. 이 그대로 인간 mitoribosome 및 그것의 어셈블리 중간체의 구성을 드러내는 높은 해상도 구조 결정에 대 한 허용 하는 mitoribosome의 준비에서 결과. 여기, 우리가이 작품에 따라 제시 된 최적화 된 고만 ~ 1010 필요로 더 많은 비용 효율적인 방법을 HEK 세포 배양. 인간 mitoribosomal 번역 단지, 돌연변이, 품질 관리 어셈블리 및 mitoribosomal 소 단위 중간체를 정화 하는 메서드를 사용할 수 있습니다. 정화 확장할 수 있습니다 선형 10 배로 필요, 그리고 또한 다른 종류의 세포에 적용 하는 경우.
Introduction
미토 콘 드리 아 단백질 합성 과정 13 필수 mt-mRNAs 호흡 사슬의 촉매 코어를 전문된 막 연결 된 mitoribosome에 의해 번역을 기반으로 합니다. 변경 된 미토 콘 드리 아 유전자와 단백질 co-translationally 막으로 삽입을 위한 필요는 실질적으로 미토 콘 드리 아 리보솜1의 건축을 형성 했습니다. 최근 고해상도 구조 포유류 mitoribosome의 세균 대응2,3기 막히게 다른 전반적인 모습을 보였다. 특히, 적어도 36 특정 미토 콘 드리 아 단백질 추가 됩니다, ~ 1 MDa 여분의 분자 질량, mt rRNA 두 가지에 의해 감소 하 고 갈라 지는 것이 매우 기여. 구조상 재배열 일반적으로 보편적으로 되도록 보존4허용 이전 했다 거의 모든 중요 한 함수형 기능을 변경 합니다.
새로운 주 요소 mitoribosomal subunits의 각 하나에 의해 획득, 예를 들어 작은 소 단위는 '머리' 지역에는 본질적인 GTPase 단백질 mS29를 통합 했다. 다른 번역 시스템에서 발견 되지 않은 GTPase 활동 그리고 구조는 GTPase 소 단위 어셈블리2에 역할을 할 수도 있습니다을 나타냅니다. 중앙 융기의 핵심을 형성 5S rRNA는 모든 알려진된 ribosomal 큰 소 단위의 획기적인 것으로 포유류 mitoribosome에서 누락 이며 채택 했다 mt tRNA 발 필수 빌딩 블록으로 대신2. 금지와 동료 것으로 나타났다 돼지 mitoribosome mt-tRNA-페 발5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk, 및 동료 이러한 데이터에 철저히 구명 하 고는 손상 된 mt tRNA 발 안정성을 가진 환자에서 mitoribosomes 수용할 수 있는 원리에서 mt-tRNA-페6,7발견. 이러한 특정 요소와 어떤 경로 트랜스는 mitoribosomes 통합 하는 이유-이 독특한 어셈블리 남아 알 수 없는 요소는 필요.
전반적으로, 인간 mitoribosome, 새로운 단백질 구성 요소 및 구조 요소로 mt-tRNA의 독특한 협회의 높은 복합성으로-아직-알 수 없는 미토 콘 드리 아 전용 트랜스-요인의 개입을 의미. 그러나,이 시스템의 특징의 대부분은 전통적으로8조사 곤란 했던, 미토 콘 드리 아에 고유한 때문에 작은 분자 및 품질 관리 메커니즘에 대 한 알려져 있다. 전자 cryo-현미경 (cryo-EM)20고해상도 단일 입자 분석 개발 기회 지금 발생 종합적으로 기본 어셈블리, 행동 및 품질 관리는 인간의 분자 메커니즘 연구 mitoribosome입니다. 중간 인간 mitoribosome 어셈블리의 첫 번째 구조의 우리의 보고서 인식을 인간의 mitoribosome를 형성 하는 방법을 시각화 하 고 그 곳을 알아내는-그들은 새로운 trans-의 식별에 표시를 제공 합니다. 임시 어셈블리9요인.
이 초기 노력을 확장 하려면 자세히 인간 mitoribosome 정화에 대 한 빠른 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 첫 번째 부분에서 현 탁 액 셀에서 높은 순수 그대로 미토 콘 드리 아의 대규모 격리를 설명 합니다. 이 절차 9 h를 요구 하 고 쉽게 수정 고 다른 세포 유형 및 비늘에 적응. 이 프로토콜에서 중요 한 단계는 셀 깨를 질소 현상의 사용 이다. 프로토콜의 두 번째 부분 정화 mitoribosomes 개발 되었다. 이 절차 7 h 필요 하 고 충분 한 양의 생화학 및 구조 연구에 대 한 mitoribosomes 생성 합니다. 사용 하 여 순수한 미토 콘 드리 아의 시작 물자 높은-품질 최종 준비를 제공 하 고 다른 미토 콘 드 리아 고분자에 추정 될 수 있다.
Protocol
모든 포유류 세포의 문화 일 생물 안전 캐비닛 안에 수행 되어야 합니다. 셀과 살 균 장비 접촉 하는 경우 사용 합니다. 니트 릴 장갑 및 실험실 외 투를 착용 하 고 좋은 조직 문화 사례를 따라.
1. 세포 배양
- HEK293S 현 탁 액 셀에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 항생물질 무료 소 혈 청 (FBS), 5 μ g/mL blasticidin와 200 μ g/mL Azithromycin, 37 ° C, 5% CO2보충을 유지 합니다.
- 최대 9 x T175 플라스 크를 확장 합니다. 90 %confluency에서 세포를 수확 하 고 스핀 그들 다운 500 x g 5 분 Resuspend에서 Freestyl 5%와 보충에 수송과 세포 항생물질 무료 FBS. 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 고 1.5 x 106 셀/mL 발명된 떨고 플라스 크에 세포 농도 조정 합니다.
참고:이 일반적으로 1000 mL 발명된 플라스 크 300ml의 시작 볼륨에 대응 됩니다. - 셀 120 rpm (떨고 지름 50 m m)에서 37 ° C, 5% CO2 에서 떨고 인큐베이터에 품 어.
- 2 일 후 셀 고 셀 밀도 106 셀/mL x 3.0 이상 사용 하는 경우 셀을 분할 하려면 진행. 2 x 10 mL 신선한 매체에서 Resuspend 셀 2 x 150 mL 세포 배양 5 분에 대 한 500 g 2 x 250 mL 원뿔 병에 아래로 회전 시켜 셀을 분할 하 고 발명된 플라스 크의 최종 셀 밀도 대 한 적절 한 볼륨을 포함 하는 2 x 1, 000 mL로 전송 1.5 106 셀/mL, 예를 들어 시작에서 2 x 300 mL x 3.0 x 106 셀/mL의 조밀도 세포.
- 셀 120 rpm (떨고 지름 50 m m)에서 37 ° C, 5% CO2 에서 떨고 인큐베이터에 품 어.
- 2 일 후 셀 고 셀 밀도 106 셀/mL x 3.0 이상 사용 하는 경우 셀을 분할 하려면 진행. 4 x 150 mL 세포 배양 5 분에 대 한 500 g 4 x 250 mL 원뿔 병에 아래로 회전 하 여 셀 셀 2 x 10 mL 신선한 매체에서 Resuspend 및 전송 2 x 2000 mL 발명된 플라스 크 1.5 x의 마지막 셀 밀도 대 한 적절 한 볼륨을 포함 하는 분할 106 셀/mL, 예 106 셀/mL x 3.0의 시작 셀 밀도에서 2 x 700 mL.
- 셀 120 rpm (떨고 지름 50 m m)에서 37 ° C, 5% CO2 에서 떨고 인큐베이터에 품 어.
- 2 일 후 셀 고 셀 밀도 106 셀/mL x 3.0 이상 사용 하는 경우 셀을 분할 하려면 진행. 2 x 700 mL을 붓는 의해 셀 분할 2800 mL x 2로 세포 배양 통풍 플라스 크 및 2 x 1 나의 볼륨에 도달 2 x 300 mL 신선한 매체와 토 핑
- 셀 120 rpm (떨고 지름 50 m m)에서 37 ° C, 5% CO2 에서 떨고 인큐베이터에 품 어.
- 24 시간 후 셀 고 셀 밀도 3.0-4.0 x 106 셀/mL 사이 있으면 셀을 수확.
2. 미토 콘 드리 아 절연
- 버퍼 필요
참고: 수량 2 L 세포에서 준비를 위해 제공 됩니다. 미토 콘 드리 아 절연 버퍼 (MIB), 자당/마 니 톨 버퍼 (SM4), 실험적인 버퍼 (MIBSM), 물의 resuspension 버퍼 (SEM)에 대 한 미리 다음 재고 솔루션을 준비 합니다.- 확인 0.5 L MIB 버퍼: 50 mM HEPES-코, pH 7.5, 10mm KCl, 1.5 m m MgCl2, 1 mM EDTA, 1mm EGTA, 1mm DTT, protease 억제제.
- 100 mL SM4 버퍼 확인: 280 mM 자당, 840 m m 마 니 톨, 50 mM HEPES-코, pH 7.5, 10mm KCl, 1.5 m m MgCl2, 1 mM EDTA, 1mm EGTA, 1 m M DTT, protease 억제제.
- 만들기 160 mL MIBSM 버퍼: 120 mL MIB 버퍼 + 40 mL SM4 버퍼.
- 4 ° c.에서 200 mL PBS 저장
- 5 mL SEM 버퍼 확인: 250 m m 자당, 20 mM HEPES-코, pH 7.5, 1 mM EDTA.
- 4 x 10 mL 20 mM HEPES 코, pH 7.5, 1 mM EDTA 및 60 %stepwise 자당 기온 변화도 대 한 재고 솔루션 / 32% /23 %와 15% 자당, 각각.
- 미토 콘 드리 아 절연
참고: 그것은 신속 하 게 작업 절차에 걸쳐 얼음에 모든 것을 유지 하는 것이 중요입니다. - 사용 하기 질소 공동 현상은 챔버 전에 쿨
- 7 분, 4 ° c.에 대 한 1000 x g에서 원심 분리 하 여 2 x 1 L 세포 (3-4 원심 분리기 튜브 당 109 셀 x) 수확
- 신중 하 게는 상쾌한 가만히 따르다와 수송과 셀 2 x 100 mL PBS에 신속 하 게 resuspend. 셀을 풀.
- 1200 x g 10 분, 4 ° c.에 resuspended 세포를 원심
- 신중 하 게는 상쾌한 가만히 따르다와 펠 릿 (~ 20 g)를 무게.
- 120 mL MIB 버퍼에 펠 릿을 resuspend.
- 10 분 동안 차가운 방에 부드럽게 교 반에 의해 팽창에 셀 수 있습니다.
- 얼음에 질소 공동 현상은 챔버를 놓고 질소 공동 현상은 실로 치명적된 셀을 전송 합니다. 45 mL SM4 버퍼 추가 (resuspended 셀, 약 140 mL, 저조한 70mm 자당 및 210 m m 마 니 톨의 최종 농도의 최종 볼륨의 1/3).
- 고정 질소 공동 현상은 챔버 및 질소로 채우기 압력 500 psi에 도달할 때까지. 도청 및 20 분 동안 얼음에 고립 된 계속 닫습니다.
- 천천히 질소 현상 약 실에 있는 압력을 놓고는 lysate 수집 (약 185 mL).
- 원심 lysed 소재 셀 파편과 15 분, 4 ° c.에 대 한 800 x g에서 핵을 제거 하
- 수집 상쾌한 비 커에는 투박한 무명을 통해 그것을 붓는 의해 얼음에 보관. 펠 릿을 버리지 마십시오.
- 90 mL MIBSM 버퍼에 펠 릿을 resuspend (1/2 이전 볼륨). 테 플 론/유리 Dounce 균질 화기를 사용 하 여 homogenize 하 고 15 분, 4 ° c.에 대 한 800 x g에서 원심 분리를 반복
- 수집 상쾌한 비 커에는 투박한 무명을 통해 그것을 붓는 의해 얼음에 보관. 이 상쾌한 2.2.11 단계에서 상쾌한와 함께 결합.
- 1000 x g 15 분, 4 ° c.에 결합된 supernatants 원심
- 수집 상쾌한 비 커에는 투박한 무명을 통해 그것을 붓는 의해 얼음에 보관.
- 펠 릿을 삭제 하 고 15 분, 4 ° c.에 대 한 10000 x g에서 원유 미토 콘 드리 아를 포함 하는 상쾌한 원심
참고: 펠 릿 일반적으로 이루어져 있을 것 이다 두 부분: 느슨하게 하 고 꽉. - 신중 하 게 단단한 부분을 방해 하지 않고 느슨한 펠 릿 세척 한다. 10 mL MIBSM 버퍼에 단단한 펠 릿을 resuspend.
- 단백질 농도 분석 결과 상업적인 단백질 분석 실험 키트 또는 유사한 메서드를 사용 하 여 수행 합니다. 2 L 문화 시작에서 일반적인 농도 수율은 ~ 2 mg/mL.
- 200 단위의 RNase 무료 DNase를 추가 하 고 균등 하 게 genomic DNA의 제거를 위한 DNase를 섞어 20 분에 대 한 차가운 방에 롤러 회전을 떠나.
- 10000 x g 15 분, 4 ° C에서 centrifuge 고 2 mL SEM 버퍼에 펠 릿을 resuspend. 부드럽게 작은 테 플 론/유리 Dounce 균질 화기를 사용 하 여 모든 나머지 집계 resuspend 균질. 이상의 5 위아래 패스 파손을 피하기를 수행 합니다. 얼음에 계속.
- 신중 하 게 60% 자당 재고 버퍼의 1.5 mL 튜브의 하단에 pipetting으로 14 ml에서 자당 기온 변화도 SW40 튜브를 준비 합니다. 신중 하 게 그것을 방해 하지 않고 60% 밴드 위에 32% 자당 재고 버퍼의 4.5 mL를 추가 합니다. 23% 자당 재고 버퍼의 1.5 mL와 함께 다시 15% 자당 재고 버퍼의 1.5 mL를 반복 합니다.
- 자당 기온 변화도 위에 전체 미토 콘 드리 아 정지 (약 3 mL)을 로드 합니다.
- 원심 139에서 SW40 회전자, 065 x g 60 분.
- 조심 스럽게 갈색 밴드 전송 피 펫, 일반적으로 2-3 mL를 사용 하 여 32%와 60% 자당의 인터페이스에 수집 합니다.
- 액체 질소와-80 ° c.에 게 스냅-동결 순화 된 미토 콘 드리 아
3. Mitoribosome 준비
- 버퍼 필요
참고: 세포의 용 해 버퍼, 자당 쿠션/그라디언트 및 물의 resuspension 버퍼에 대 한 미리 다음 재고 솔루션을 준비 합니다.- 10 mL 세포의 용 해 버퍼 확인: 25mm HEPES-코, pH 7.5, 150 m m KCl, 50 mM MgOAc, 2% 폴 리 에틸렌 글리콜 octylphenyl 에테르, 2mm DTT, protease 억제제.
- 10 mL 자당 쿠션 버퍼 확인: 1 M 자당 (34 %w / v), 20 mM HEPES-코, pH 7.5, 100 m KCl, 20 mM MgOAc, 1% 폴 리 에틸렌 글리콜 octylphenyl 에테르, 2mm DTT m.
- 5 mL 물의 resuspension 버퍼 확인: 20 mM HEPES-코, pH 7.5, 100 m m KCl, 20 m m MgOAc, 2mm DTT
- TLS 55 폴 리 카보 네이트 튜브에 15%-30% 선형 자당 기온 변화도 물의 resuspension 버퍼를 확인 합니다.
- Mitoribosome 정화
- 얼음에 냉동된 미토 콘 드리 아 녹
- 세포의 용 해 버퍼의 2 개를 추가,예를 들어 3 mL 미토 콘 드리 아를 6 mL 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 즉시 혼합.
- 세포를 지원 하는 세포를 완료 하는 얼음에 5-10 분 동안 품 어 작은 테 플 론/유리 dounce 균질 화기와 균질.
- Lysed 자료 (약 9 mL) 30000 x g 20 분, 불용 성 물질을 제거 하 4 ° C에서 원심. 펠 릿에서 신중 하 게 상쾌한 가만히 따르다와 펠 릿을 삭제.
- 30000 x g에서 원심 분리는 상쾌한의 되도록 4 ° C에서 20 분 동안 반복 합니다. 펠 릿에서 신중 하 게 상쾌한 가만히 따르다와 펠 릿을 삭제.
- TLA 120.2 튜브 (매우 명확한) 자당 쿠션 준비: 튜브 당 0.4 mL 자당 쿠션. Lysed 소재의 mL 당 1 개의 관을 준비 합니다.
- 자당 쿠션 lysed 미토 콘 드리 아 레이어: 튜브, lysate는 결과 당 약 1 mL: 매니아도의 쿠션 비율.
- 원심 231에서 샘플, 4 ° c.에 TLA120.2로 터에서 45 분 550 x g
- 삭제는 상쾌한 고 잔여 자당을 제거 하는 물의 resuspension 버퍼의 100 µ l로 순차적으로 튜브를 헹 굴.
- 총 100 µ l 물의 resuspension 버퍼에 산 탄을 resuspend.
- 30에 대 한 느린 속도에 소용돌이 나머지 집계 해산 microtube 원심 분리기에서 4 ° c.에서 10 분 17,949 x g에서 원심을 s
- 신중 하 게는 상쾌한을 수집 하 고는 원심 분리를 반복.
- A260에서 mitoribosome 흡수를 측정 합니다.
참고: 전형적인 수확량은 7 A260, A260와: 1.3 A280 비율. - 단일 선형 자당 그라데이션 튜브에 전체 샘플을 로드 합니다. 213에서 TLS 55 회전자, 4 ° c.에 120 분 626 x g에서 원심
- 그라데이션 충분치 A260 에서 광학 밀도 결정 하 고, 함께 핵 산 피크에 해당 하는 분수 수영장.
참고: 일반적인 A260: 피크의 A280 비율 > 1.6. - 필요한 경우, 선택의 방법을 사용 하 여 버퍼를 교환 합니다. 변환 1 A260 을 사용 하 여 최종 농도 계산 = 0.1 mg/mL.
- 스냅 고정 물의 resuspension 버퍼에-80 ° c.에 게 순화 mitoribosome 샘플
Representative Results
나누어 하 고 높은 가능한 세포 활성 mitoribosomes의 정화에 대 한 필수적인 출발점입니다. 이 프로토콜은 모든 HEK293 현 탁 액 셀에 적용 됩니다. 우리는 사내 셀 라인 T501, 항생물질을 유도할 수 있는 통제 전송 표현 안정적으로 사용 하는. 부모 셀 라인은 HEK293S-GnTI- 셀 (자료 테이블)10. 세포 성장 및 1.5 x 10에는 최소한의 밀도 유지 한다 자유형 293 식 매체에 확장 하는 동안6 셀/mL, 최대한 셀 밀도 반면 매 2 일의 2 배 속도 보장 하기 위해 5 ~ 106 셀 배 초과 하지 않아야 합니다 / mL. 3 x 106 셀/mL 이상 세포 밀도 도달 시 셀은 수송과 고 1.5 x 106 셀/mL의 최소 셀 밀도 달성 하기 위해 확장 된 볼륨에 신선 하 고 따뜻한 미디어에 resuspended. 이 분할은 수행 반복 절차에 대 한 원하는 셀 질량 달성 될 때까지 2-3 일 마다. 마지막 셀 밀도 3-4.5 mL/106 셀, x의 범위에서 다를 수 있습니다 및 적어도 2 L 미토 콘 드리 아의 격리에 대 한 시작 지점으로 필요 합니다. 세포 생존 능력을 일반적으로 유지 한다 > 90%, 그리고 수확 하는 최종 문화 > 95%. 항생제로 대규모 세포 배양의 치료를 권장 하지 않습니다.
차동 centrifugations의 시리즈, 후 단계 2.2.20 후 미토 콘 드리 아 서 스 펜 션의 볼륨은 일반적으로 3-5 mL의 범위에서. Mitochondria 다음 다른 세포에서 자당 기온 변화도 (그림 1)에 구분 됩니다. Stepwise 자당 그라디언트는 그라디언트 볼륨과 함께 미토 콘 드리 아 현 탁 액의 볼륨 최대한 볼륨을 원심 분리 관을 채울 준비가 되어 있습니다. 60%에 갈색 밴드를 수집 특별 한 케어가 필요 하다는 여기 / 32% 주변 버퍼에서 최소한의 오염으로 인터페이스. 가용 화 미토 콘 드리 아의 다음 단계에서 지속적인 단백질: 세제 비율을 유지 하기 위해 중요 하다. 이 단계에서 미토 콘 드리 아 단백질 농도 평가 하는 것이 좋습니다 그리고 15-20 mg 총 미토 콘 드리 아 단백질의 전형적인 수확량 10 ~10 교양 HEK 세포에서 예정 이다.
성공적인 미토 콘 드리 아 격리, 그들은 폴 리 에틸렌 글리콜 octylphenyl 에테르의 추가 의해 lysed는 고 mitoribosomes 자당 쿠션 (그림 2)를 통해 구분 됩니다. 소수 성 액체로 물질에서 mitoribosomes를 분리, 펠 릿, 세제를 포함 하지 않는 버퍼에 resuspended는 그리고 원심 분리에 의해 소수 단지는 일지도. 이 절차를 반복 하 고 mitoribosomes의 정화 정도 A260여 계량 /A280 비율, 1.3 ~ 될 것으로 예상 된다. 전형적인 수확량은 2 L 문화 시작에서 7 A260 . 이 mitoribosomal 분수 추가 큰 성 미토 콘 드리 아 단지를, pyruvate 효소 등 조미료 효소에도 포함 되어 있습니다. 수용 성 미토 콘 드리 아 단지에서 mitoribosomes를 분리 하는 상쾌한 자당 밀도 그라데이션에 적용 됩니다. 분수는 mitoribosome를 포함 하는 일반적으로 아래쪽에 위치한 튜브의 세 번째. 자당 기온 변화도의 분류는 자동된 피스톤과 또는 수동으로 50 µ L 분수는 피 펫으로 신중 하 게 복용 하거나 21 G 바늘 튜브 하단을 펀칭 하 고 방울을 수집 하 여 수행할 수 있습니다.
두 개의 주요 mitoribosomal 인구에서에서 식별 됩니다: monosome 55S 및 큰 소 단위 39S, 그림된에서 그림 3 과 그림 4. 큰 소 단위 분수의 존재 셀 매우 활성 나누어 주11에서 수확은 나왔다. Monosome 및 큰 소 단위 봉우리 사이의 비율을 변경할 수 있습니다. 바닥에 가까이 위치 하는 추가 피크 세포질 리보솜 80 년대 오염으로 준비에 나타날 수 있습니다. 참고 작은 자당 기온 변화도 스윙을 사용 하 여 회전자 TLS 55 양동이 0.4-1의광학 조밀도에 mitoribosomes의 ~ 1 mL의 급속 한 정화에 대 한 허용 하시기 바랍니다260. Monosome 및 큰 소 단위 봉우리의 분리, 분류에 따라 약간 다를 수 있습니다 하지만 일반적으로 두 봉우리의 일부 중복. 따라서,를 수집, 어떤 분수 풀 수 고려 한다 monosome, 또는 또는 큰 소 단위, 샘플에서의 가장 높은 비율을 지키기 위하여 하 고. 고해상도 cryo-EM 연구, 대 한 두 개의 mitoribosomal 인구 구분 (추가 철에 작업) 때문에 절대적으로 필요 하지 않습니다. 그러나, 더 나은 분리 필요한 경우 그것은 큰 튜브 및 해당 실행 시간을 사용 하 고 좋습니다.
그림 1 : 자당 기온 변화도에 미토 콘 드리 아의 정화. 2 L 문화 시작에서 subcellular 세포 했다 분류 한 차동 centrifugations의 시리즈를 통해 프로토콜에 설명 된 대로 그리고 미토 콘 드리 아 불연속 자당 기온 변화도에 분리 되었다. 순화 된 미토 콘 드리 아 32% / 60% 인터페이스에서 낮은 대역에서 찾을 수 있습니다.
그림 2 : 자당 쿠션에 mitoribosomes의 정화. 2 L 시작 문화에서 원유 mitoribosomes 1 M 자당 쿠션 통해 sedimented 있습니다. 펠 릿은 세제 무료 버퍼에 resuspended 그리고 mitoribosomes 명백 하 게 2 개의 centrifugations에 의해 프로토콜에 설명 된 대로. 흡수도 준비와 일반적인 A260의 품질을 평가 하기 위해기록/A280 비율 ~1.3 (오른쪽 패널)의 증명 mitoribosome 풍부한 분수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 자당 기온 변화도에 mitoribosomes의 정화를 잘. 2 L 문화 시작에서 흡 광도 추적입니다. 분수 위에서 그라데이션의 바닥에 번호가 지정 됩니다. 두 개의 주요 mitoribosomal 인구 식별 됩니다: 큰 소 단위 (1 피크와) monosome 55S (피크 2). 인구 사이의 비율을 변경할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 전자 현미경 사진, 2D 클래스 및 3D 재건. 왼쪽된 패널: 샘플에서 monosome 2 1.23 A의 보정 확대 현미경 사진 / 픽셀. 중간 패널: 대표적인 후 처리 데이터 (2D 클래스) 그대로 monosomes를 공개. 오른쪽 패널: 3 차원 재구성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
하지만 미토 콘 드리 아의 풍부한 원천이 될 것으로 알려진 동물의 조직의 비교적 쉬운 가용성은 그것에 게 mitoribosomes3,5,12,에 대 한 인기 있는 선택 시작 물자의 소스에 대해서 13, 유전자 수정 및 여 실험실에서 쉽게 복제 수 없습니다. 따라서, 균질로 경작 된 인간 세포 라인을 포함 하는 프로토콜 개발에 대 한 명확한 실용적인 필요가 하다. 주요 차이점 프로토콜 간의 조직 및 배양된 세포 세포의 용 해 및 균질의 모드입니다. 배양된 세포를 단층으로 성장에 대 한 일반적인 메서드는 테 플 론/유리 dounce 균질14입니다. 원래 준비 프로토콜 동안 효율적인 작은 비늘15개발 되었다. 그러나 500 mL의 수 용량을 가진 균질 화기를 채용을 직접 확장 가능한11,, 그것은 ~ 2 h 80% 세포를 달성 하기 위해 육체 노동의 필요 합니다. 이 3 개 이상 문제 도입: 긴 대기 시간으로 인해 세포, 큰 그릇의 바닥에 침 몰 하는 무거운 소재 인 비 균질 세포의 여러 획의 필요성 때문에 샘플의 난방. 따라서, 세포의 바람직 방법에서 가압된 용기16,17감압에 따라 질소 현상을 활용 합니다. 이 방법에서는, 세포는 세포를 부드럽게 하 고 그들을 세포에 더 취약 하 게 추운 방에 먼저 부 어. 그들은 질소 현상 장치에 배치 됩니다 자당과 마 니 톨을 포함 하는 버퍼 미토 콘 드리 아를 그대로 유지 하는 데 도움이 됩니다 삼투성 압력을 유지 하기 위해 추가 됩니다. 질소 공동 현상은 장치 다음 셀에 녹이 고는 산소가 없는 질소의 큰 볼륨으로 압력. 압력은 세포 막의 파열 결과로 솔루션에서 나온된 질소 거품. 이 방법은 다음과 같이 전단 응력과 마찰과 관련 된 기계적 균질 화 방법에 비해 몇 가지 장점이: 1) 셀에 외부 물리적 스트레스를 피할 수 있다; 2) 단 열 확장 하는 샘플을 냉각, 열 손상 세포; 3) 셀 구성 요소; 불활성 질소 가스에 의해 산화에서 보호 된다 4) pH 변경 중단 매체; 5) 과정은 균일 하 고 재현성 같은 파괴적인 세력 각 셀 내 고 샘플;에 걸쳐 적용 되기 때문에 6) 과정 빨리이 고 20-30 분 이내 완료 될 수 있다.
경작된 한 세포와 조직에서 미토 콘 드리 아의 절연 문학에서 광대 하 게, 설명 하고있다 그리고 그것은 부드러운 세포 파쇄 차동 centrifugations의 시리즈 뒤에 기반. 현재 사용된 중인 프로토콜의 대부분18세기 한가운데에 개발 된 원래 절차를 따릅니다. 기본적인 생 화 확 적인 접근은 정확한, 문학에서 강조 하 고 들 키 지 않고 남아 있는 몇 가지 오해가 있습니다. Mitoribosomes에 대 한 프로토콜을 최적화 하려면 우리가 체계적으로 조사 보고 된 일반 원칙 및 결론: 1)의 Mg2 + 포함 및 K+ 버퍼에 중요 하지 않습니다. 그러나 그것은 세포질 단백질 젤19,, 형성에서 방지 하기 위해 KCl 도움이 우리의 프로토콜에 설명 된 대로 충분 한 희석이이 현상이 발생 하지 않습니다 제공 주장 하고있다. 배제 Mg2 + 세포질 리보솜20; 오염 감소에 유용 또한, 2) 포 삼 투 환경에서 나온된 세포를 보호 하기 위해 중간 셀의 최대 가능한 볼륨 비율을 유지 필요가 없습니다입니다. 우리의 프로토콜에 삼 투 지원 충분히 자당 포함 된 버퍼와 미토 콘 드리 아 절연 버퍼에 포함 된 셀의 희석에 의해 제공 됩니다 (단계 2.II.5)은 대규모 준비에 세포의 효율적인 분리에 대 한 중요.
미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 pH는 생리 적 가치, 즉 7.5, 가까이 또한 다음 mitoribosome 준비에 대 한 최적의 pH. 바인딩 에이전트 EDTA 및 EGTA 오염 이온을 킬레이트를 격리 미디어에 추가 되 고 그들은 킬레이트 무료 마그네슘과 칼슘, 각각. 그것은 EDTA의 포함14안 미토 콘 드리 아 막 손상으로 이어질 수 있습니다, 따라서 농도 조치로 1 mM로 제한 됩니다 논의 되었습니다. 우리 하지 자당 농도 기온 변화도의 마지막 정화 단계에서 5 mM EDTA를 사용 하 여 때 어떤 차이 관찰 했습니다.
설명 하는 프로토콜은 여기는 mitoribosome의 정화에 대 한 HEK293S 파생 된 인간 세포를 사용 합니다. 준비의 품질 원자 해상도 화학적 및 구조적 조사를 얻은 샘플 수 있습니다. 한 인간 mitoribosomal 번역 단지, 품질 관리 어셈블리 및 mitoribosomal 소 단위 중간체 메서드를 적용할 수 있습니다. 또한, 암 세포는 OXPHOS 용량 및 인접 한 실질 조직21에 비해 상승 된 미토 콘 드리 아 단백질 번역 증폭가지고, 이후 mitoribosomes 암22설립된 약 대상입니다. 따라서, mitoribosomes의 특정 정화에 대 한 억제제의 존재에이 프로토콜을 사용 하 여 의료 응용 프로그램을 해야 합니다. 또한, mitoribosomal 돌연변이 미토 콘 드리 아 질병 유전23에 연결 되었습니다. 이 돌연변이 구조에 직접적인 영향 때문에, 여기에 제시 된 접근 그들의 구조적 특성에 대 한 유용할 것 이다. 프로토콜을 실험적으로 확장 하 고 다양 한 인간의 미토 콘 드리 아에서 번역의 근본적인 이해와 의료 중요성을 태 클 하는 과학적 질문에 적용 될 수 있습니다.
Disclosures
없음
Acknowledgments
이 작품은 전략 연구 (미래 지도자 그랜트 FFL15:0325), 라 그 나 Söderberg 재단 (친목 의학 M44/16), 스웨덴 연구 위원회 (시작 그랜트 NT × 2015 04107), FEBS 장기 친교 (SA)에 대 한 스웨덴 재단에 의해 지원 H2020-MSCA-ITN-2016 프로젝트 721757 (대).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate | Thermo Scientific | 31966-021 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 16000-044 | |
| Blasticidin S HCl | Thermo Scientific | R210-01 | |
| Zeocin selection reagent | Thermo Scientific | R25001 | 100 mg/ml |
| Freestyle 293 Expression medium | Thermo Scientific | 12338026 | |
| T175 tissue culture flask with vented cap | Sarstedt | 83.3912.002 | |
| Shaker flasks with vented cap | Thermo Scientific | 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800 | |
| 250 ml conical bottle tubes, sterile | Corning | 430776 | |
| Eve automated cell counter | NanoEnTek | E1000 | |
| Nitrogen cavitation cell disruption vessel | Parr Instruments | 4635, 4639 | safety volume: 40ml, 600ml respectively |
| Dnase (RNA-free) | HT Biotechnology | N401a | |
| Teflon/glass dounce homogenizers | Cambridge Glassblowing Limited | Size designed upon request | |
| SW40 tubes for mitochondria gradient | Beckman | 344060 | Polypropylene, thin wall |
| Transfer pipettes | Sarstedt | 86.1171 | |
| TLA 120.2 tubes for cushion | Beckman | 343778 | Polycarbonate, thick wall |
| TLS-55 tubes for gradient | Beckman | 347356 | Ultra-clear |
| Gradient Station IP | BioComp | 153-002 |
References
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