线粒体有专门的核糖体, 与他们的细菌和细胞质的对应物分叉。在这里, 我们展示如何 mitoribosomes 可以获得从他们的本地舱在 HEK 细胞。该方法包括分离悬浮细胞中的线粒体, 并由此纯化 mitoribosomes。
人类线粒体拥有一组专门的核糖体 (mitoribosomes), 它能转化线粒体基因组编码的氧化磷酸化络合物中的13种基本蛋白成分。由于人类 mitoribosomes 合成的所有蛋白质都是整体膜蛋白, 人类 mitoribosomes 在翻译过程中被拴在线粒体内膜上。与胞浆核糖体相比, mitoribosome 有55S 的沉淀系数, rRNA 含量的一半, 没有 5S rRNA 和36额外的蛋白质。因此, 较高的蛋白质-RNA 比值和非典型结构使人类的 mitoribosome 与胞浆对应物显著地不同。
尽管 mitoribosome 对生命至关重要, 但没有任何协议可以从人类细胞系净化完整的复合物。传统上, mitoribosomes 是从富含线粒体的动物组织中分离出来的, 需要公斤的起始物质。我们推测, 线粒体在分裂 HEK293-derived 人细胞生长在富含营养的表达媒介将有一个活跃的线粒体翻译, 因此, 可能是一个适当的材料来源的结构和生物化学研究mitoribosome。为了研究其结构, 我们开发了一种从 HEK 细胞中纯化完整 mitoribosomes 的协议。本文介绍了氮气空化方法作为一种快速、少劳动密集型、更有效的替代传统的基于机械剪切的细胞裂解方法。这导致了 mitoribosome 的准备, 使其结构决心高分辨率, 揭示了完整的人类 mitoribosome 及其组装中间体的组成。在这里, 我们跟进这项工作, 并提出了一个优化和更具成本效益的方法, 只需要 1010培养的 HEK 细胞。该方法可用于纯化人 mitoribosomal 翻译配合物、突变体、质量控制组件和 mitoribosomal 亚基中间体。如果需要, 纯化可以线性缩放, 也可应用于其他类型的细胞。
线粒体蛋白合成的过程是以13种必需的基因为基础的, 这是由专门的膜附着 mitoribosome 转化成呼吸链的催化核心。改变的线粒体基因组和蛋白质插入 translationally 到膜中的需要极大地塑造了线粒体核糖体1的结构。最近的高分辨率的哺乳动物 mitoribosome 结构显示出一个惊人的不同的整体外观, 细菌对应2,3。特别是, 至少增加了36线粒体特异蛋白, 贡献了 ~ 1 MDa 额外的分子质量, 而 mt-rRNA 减少了双重和高度分化。结构重排改变几乎所有的关键功能特征, 以前普遍认为是普遍保守的4。
新的主要元素已经获得了每一个 mitoribosomal 亚基, 例如, 小亚基已纳入一个内在的 GTPase 蛋白 mS29 到其 ‘ 头部 ‘ 区域。在其他翻译系统中找不到 GTPase 活动, 结构表明 GTPase 可能在亚单位汇编2中发挥作用。5S rRNA 被认为是所有已知核糖体大亚基的地标, 形成中心突起的核心, 在哺乳动物 mitoribosome 中失踪, 并采用 mt-tRNA-瓦尔作为一个整体构造块代替2。潘基文和同事们表明, 猪 mitoribosome 有 tRNA, 而不是–Val5。Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk 和同事跟进这些数据, 发现 mitoribosomes 从受损的 mt tRNA-瓦尔稳定的患者原则上可以容纳 mt-tRNA-6,7。为什么 mitoribosomes 包含了这些特定的元素, 这些独特的组件需要哪些途径和跨因素仍然是未知的。
总体而言, 人类 mitoribosome 的高度复杂性, 新的蛋白质成分, 以及 tRNA 作为结构元素的独特联想, 意味着未知的线粒体特定的跨因子的参与。然而, 由于这个系统的许多特点是独特的线粒体, 这是传统上很难调查8, 很少是已知的分子和质量控制机制。随着电子低温显微镜 (低温-EM)20高分辨率单粒子分析的发展, 现在有机会全面研究人体的装配、作用和质量控制的分子机制。mitoribosome。我们的第一个结构的人类 mitoribosome 装配中间体的报告提供了认识, 可以想象如何形成人类 mitoribosome, 并表明, 低温 EM 是有助于确定新的跨代理装配因素9。
为了扩大这一初步的努力, 我们描述了一个快速的协议, 人类 mitoribosome 净化详细。在该协议的第一部分, 描述了从悬浮细胞中分离出高度纯完整的线粒体。这个过程需要9小时, 可以很容易地修改和适应不同的细胞类型和尺度。这个协议的一个重要步骤是利用氮气空化来打破细胞的打开。该议定书的第二部分是为了净化 mitoribosomes 而开发的。这一程序需要7小时, 并为生物化学和结构研究提供足够数量的 mitoribosomes。使用纯线粒体作为起始材料提供高质量的最终准备, 并可以推断其他线粒体大分子。
关于起始材料的来源, 虽然已知为丰富的线粒体来源的动物组织相对容易获得, 但这使得它成为 mitoribosomes3、5、12的流行选择, 13、不能轻易在实验室进行基因改造和复制。因此, 有明确的实际需要, 制定涉及均匀培养的人类细胞系的协议。处理组织和培养细胞的协议的主要区别是裂解和均匀化的模式。作为单层培养细胞, 典型的方法是聚四氟乙烯/玻璃 dounce 均匀化14。最初的准备协议, 而有效的是为小规模15开发。直接放大使用500毫升容量的均质机是可能的11, 但是, 它需要2小时的人工劳动, 以达到80% 裂解。这至少引入了三个问题: 由于长时间等待时间的细胞器聚集, 由于重物质下沉到大容器的底部而导致的非均质裂解, 由于需要多冲程, 样品加热。因此, 最好的裂解方法是利用氮气空化, 这是基于加压容器16,17减压。在这种方法中, 细胞首先膨胀在寒冷的房间, 以软化细胞, 使他们更容易溶解。由于它们被放置在氮气空化装置中, 添加了含有蔗糖和甘露醇的缓冲液, 以保持渗透压力, 从而有助于保持线粒体的完好。氮气空化装置然后加压以大容量无氧氮气, 溶化入细胞。由于压力释放出溶液中的氮气气泡, 导致细胞膜破裂。该方法具有与剪切应力和摩擦力有关的机械均质方法的优点: 1) 避免了细胞内的任何外部物理应力;2) 冷却试样的绝热膨胀, 确保对细胞器无热损伤;3) 细胞成分受惰性氮气的氧化保护;4) 悬浮介质无 pH 改变;5) 该过程是一致的, 可重复的, 因为同样的破坏性力量在每个细胞和整个样本中应用;6) 工艺快速, 可在20-30 分钟内完成。
在文献中广泛描述了细胞和组织中线粒体的分离, 它是以温和的细胞分裂为基础, 其次是一系列的差异 centrifugations。目前使用的大多数协议都遵循在上世纪18中期开发的原始程序。虽然基本的生物化学方法是正确的, 有几个误解, 在文献中强调, 并保持未被发现。为了优化 mitoribosomes 协议, 我们系统地研究了报告的一般原理, 并得出结论: 1) 在缓冲器中加入 Mg2 +和 K 是不重要的.有人认为, 氯化钾有助于防止细胞质蛋白形成凝胶19, 但是, 提供了足够的稀释, 如我们的议定书所述, 这种现象不会发生。此外, 排除镁2 +是有用的减少污染物的细胞质核糖体20;2) 没有必要将细胞的最大体积比保持在培养基上, 以保护被释放的器不受低渗透环境的侵害。我们的协议中的渗透支持是充足的由含蔗糖的缓冲, 并稀释细胞与线粒体隔离缓冲 (步骤 2. 5) 是一个重要的是有效分离器在大规模的准备。
线粒体分离缓冲液 pH 值接近生理价值,即7.5, 这也是以下 mitoribosome 准备的最佳 ph 值。结合剂 EDTA 和 EGTA 被添加到隔离介质中, 以螯合污染离子, 并分别螯合游离镁和钙。讨论了 EDTA 的加入可能导致内线粒体膜的损伤14, 因此浓度限制为1毫米作为预防措施。在蔗糖密度梯度的最终纯化步骤中, 我们没有观察到5毫米 EDTA 的差异。
本文所述的协议使用 HEK293S-derived 人类细胞纯化 mitoribosome。该制剂的质量使所获得的样品能够生化和结构地进行原子分辨率的研究。这使得人们可以将该方法应用于人类 mitoribosomal 翻译复合体、质量控制组件和 mitoribosomal 亚基中间体。此外, 由于癌细胞已扩增 OXPHOS 容量和高线粒体蛋白的翻译与相邻的基质组织21, mitoribosomes 是建立癌症的药物靶点22。因此, 在抑制剂存在的情况下, 使用本协议对 mitoribosomes 进行特定的纯化将有医学应用。此外, mitoribosomal 突变已与遗传性线粒体疾病23。由于这些突变对结构有直接的影响, 这里提出的方法将有助于它们的结构表征。该协议可以被实验性地扩展, 并应用于各种科学问题, 解决人类线粒体中翻译的基本理解及其医学意义。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到瑞典战略研究基金会 (未来领导人赠款 FFL15:0325)、拉格纳 Söderberg 基金会 (医学 M44/16)、瑞典研究理事会 (启动赠款 NT×2015-04107)、FEBS 长期研究金 (SA) 的支持。, H2020-MSCA-ITN-2016 项目 721757 (VS)。
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate | Thermo Scientific | 31966-021 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 16000-044 | |
Blasticidin S HCl | Thermo Scientific | R210-01 | |
Zeocin selection reagent | Thermo Scientific | R25001 | 100 mg/ml |
Freestyle 293 Expression medium | Thermo Scientific | 12338026 | |
T175 tissue culture flask with vented cap | Sarstedt | 83.3912.002 | |
Shaker flasks with vented cap | Thermo Scientific | 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800 | |
250 ml conical bottle tubes, sterile | Corning | 430776 | |
Eve automated cell counter | NanoEnTek | E1000 | |
Nitrogen cavitation cell disruption vessel | Parr Instruments | 4635, 4639 | safety volume: 40ml, 600ml respectively |
Dnase (RNA-free) | HT Biotechnology | N401a | |
Teflon/glass dounce homogenizers | Cambridge Glassblowing Limited | Size designed upon request | |
SW40 tubes for mitochondria gradient | Beckman | 344060 | Polypropylene, thin wall |
Transfer pipettes | Sarstedt | 86.1171 | |
TLA 120.2 tubes for cushion | Beckman | 343778 | Polycarbonate, thick wall |
TLS-55 tubes for gradient | Beckman | 347356 | Ultra-clear |
Gradient Station IP | BioComp | 153-002 |