Mitochondrien haben Ribosomen spezialisiert, die von bakteriellen und zytoplasmatischen Gegenstücke abwich. Hier zeigen wir, wie Mitoribosomes ihre native Fach in HEK Zellen entnommen werden können. Die Methode besteht darin, Isolierung von Mitochondrien aus Aussetzung Zellen und konsequente Reinigung der Mitoribosomes.
Die menschlichen Mitochondrien besitzen eine engagierte Gruppe von Ribosomen (Mitoribosomes), die 13 essentielles Protein-Komponenten der Oxidative Phosphorylierung komplexe von mitochondrialen Genoms kodiert zu übersetzen. Da alle Proteine synthetisiert durch menschliche Mitoribosomes integraler Membranproteine sind, sind menschliche Mitoribosomes angebunden, um die innere Mitochondrien-Membran während der Übersetzung. Im Vergleich zu der cytosolischen Ribosom hat die Mitoribosome eine Sedimentation Koeffizient der 55-jährigen, die Hälfte der rRNA-Inhalt, keine 5 s rRNA und 36 weitere Proteine. Stellen Sie daher eine höhere Protein-RNA-Verhältnis und eine atypische Struktur der menschlichen Mitoribosome wesentlich verschieden von der cytosolischen Gegenstück.
Trotz der zentralen Bedeutung der Mitoribosome zum Leben wurden keine Protokolle zur Verfügung, den intakten Komplex aus humanen Zelllinien zu reinigen. Traditionell wurden Mitoribosomes aus reich an Mitochondrien tierischen Geweben, die Kilogramm erforderlich isoliert des Ausgangsmaterials. Wir begründete, dass Mitochondrien in der Teilung HEK293 abgeleitete menschlicher Zellen in nährstoffreichen Ausdruck Medium angebaut eine aktive mitochondrische Übersetzung hätte, und daher eine geeignete Quelle von Material für die strukturellen und biochemische Studien der wäre die Mitoribosome. Um seine Struktur zu untersuchen, haben wir ein Protokoll für die großflächige Reinigung der intakten Mitoribosomes von HEK Zellen entwickelt. Hier stellen wir Ihnen Stickstoff Kavitation Methode als eine schnellere, weniger arbeitsintensiv und effizientere Alternative zu traditionellen mechanische Scherung-basierte Methoden zur Zelle Lysis. Dies führte zu Vorbereitungen für die Mitoribosome, die für die Strukturaufklärung, hohe Auflösung, enthüllt die Zusammensetzung des intakten menschlichen Mitoribosome und seine Montage Zwischenprodukte zulässig. Hier wir follow-up zu dieser Arbeit und präsentieren ein optimiertes und weitere kostengünstige Methode erfordert nur ~ 1010 HEK Zellen kultiviert. Die Methode kann eingesetzt werden, um menschliche Mitoribosomal übersetzen komplexe, Mutanten, Qualitätskontrolle Baugruppen und Mitoribosomal Untereinheiten Zwischenprodukte zu reinigen. Die Reinigung kann linear verzehnfacht skaliert werden wenn nötig, und auch auf andere Arten von Zellen angewendet.
Der Prozess der mitochondrialen Proteinsynthese basiert auf 13 wesentliche Mt-mRNAs, die durch eine spezielle Membran befestigt Mitoribosome um die katalytische Kern der Atmungskette übersetzt werden. Die veränderten mitochondrische Genome und der Bedarf an Proteinen, co-translationally in der Membran einzufügen haben die Architektur des mitochondrialen Ribosomen1wesentlich geprägt. Den letzten hochauflösende Strukturen von Säugetieren Mitoribosome zeigten eine auffallend anders Gesamterscheinung der bakteriellen Gegenstück2,3. Insbesondere werden mindestens 36 Mitochondrien-spezifische Proteine hinzugefügt, einen Beitrag ~ 1 MDa zusätzliche molekulare Masse, während Mt-rRNA ist durch zweifache reduziert und sehr auseinander. Die strukturelle Umstellungen ändern fast alle kritischen Funktionen, die zuvor in der Regel akzeptiert wurden um universell4konserviert.
Wichtigsten Neuerungen wurden jeweils die Mitoribosomal Untereinheiten erworben, z. B. der kleinen Untereinheit hat eine intrinsische GTPase Protein mS29 in seiner ‘Kopf’-Region integriert. GTPase-Aktivität nicht in anderen Übersetzungssysteme gefunden wurde, und die Struktur zeigt an, dass die GTPase bei Untereinheit Baugruppe2eine Rolle spielen könnte. Die 5 s rRNA, die geglaubt wurde, um ein Wahrzeichen von allen bekannten ribosomale großen Untereinheiten, bilden den Kern der zentralen Protuberanz, hat fehlt in den Säugetieren Mitoribosome und Mt-tRNA-Val als integraler Baustein stattdessen2. Verbot und Kollegen zeigten, dass die Schweine Mitoribosome Mt-tRNA-Phe hat und nicht – Val5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk, knüpfte an diese Daten und Kollegen festgestellt, dass Mitoribosomes von Patienten mit infizierten Mt-tRNA-Val Stabilität im Prinzip Mt-tRNA-Phe6,7aufnehmen kann. Warum die Mitoribosomes diese spezifische Elemente und welche Wege und Transeingeflossen-Faktoren sind erforderlich, für diese einzigartige Assemblys unbekannt bleiben.
Alles in allem die hohe Komplexität des menschlichen Mitoribosome, neue Proteinkomponenten und die einzigartige Verbindung von Mt-tRNA als Strukturelement implizieren die Einbeziehung der noch unbekannten Mitochondrien-spezifische Trans –Faktoren. Jedoch weil viele der Merkmale dieses Systems einzigartig, Mitochondrien, die traditionell schwierig sind,8zu untersuchen, ist wenig über die molekularen und Qualitätskontrolle-Mechanismus bekannt. Mit der Entwicklung von hochauflösenden Einzelkorn Analyse von Elektron Cryo-Mikroskopie (Cryo-EM)20ergeben sich Möglichkeiten jetzt umfassend untersuchen die molekularen Mechanismen der Versammlung, Aktion und Qualitätskontrolle des menschlichen Mitoribosome. Unser Bericht der ersten Struktur der menschlichen Mitoribosome Versammlung Mittelstufe bietet die Anerkennung, dass es möglich ist, visualisieren, wie die menschliche Mitoribosome gebildet wird und zeigt, dass die Cryo-EM maßgeblich bei der Identifizierung von neuen Trans– amtierende Montage Faktoren9.
Um auf diese Initialaufwand zu erweitern, beschreiben wir ein schnelles Protokoll für menschliche Mitoribosome Reinigung im Detail. Im ersten Teil des Protokolls wird eine groß angelegte Isolation von hochreinen intakte Mitochondrien aus Aussetzung Zellen beschrieben. Dieses Verfahren kann erfordert 9 h und leicht modifiziert und angepasst an verschiedene Zelltypen und Skalen. Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll wird die Verwendung von Stickstoff Kavitation die Zellen aufzubrechen. Der zweite Teil des Protokolls wurde entwickelt, um Mitoribosomes zu reinigen. Dieses Verfahren erfordert 7 h und eine ausreichende Menge an Mitoribosomes für Biochemische und strukturelle Studien ergibt. Verwendung von reinen Mitochondrien als Ausgangsmaterial qualitativ hochwertige Letzte Vorbereitungen bietet und zu anderen mitochondrialen Makromolekülen extrapoliert werden kann.
In Bezug auf die Quelle des Ausgangsmaterials, obwohl die relativ leichte Verfügbarkeit von tierischem Gewebe, die als bekannt sind eine reiche Quelle von Mitochondrien, trifft es eine populäre Wahl für Mitoribosomes3,5,12, 13, sie können nicht genetisch veränderte und leicht im Labor reproduziert. Daher gibt es eine klare praktische Notwendigkeit für die Entwicklung von Protokollen mit homogen kultivierten humanen Zelllinien. Der wesentliche Unterschied zwischen den Protokollen Umgang mit Gewebe und kultivierten Zellen ist der Modus der Lyse und Homogenisierung. Für kultivierten Zellen als eine Monolage angebaut ist eine typische Methode Teflon/Glas Dounce Homogenisierung14. Die ursprüngliche Vorbereitung-Protokolle während effiziente wurden für kleine Schuppen15entwickelt. Eine direkte Skalierung mit einem Homogenisator mit einer Kapazität von 500 mL ist möglich11, jedoch erfordert es ~ 2 h der Handarbeit, 80 % Lyse zu erreichen. Dies führte mindestens drei Fragen: Aggregation der Organellen durch lange Wartezeiten, nicht-homogene Lyse durch schweres Material sinken auf den Boden eines großen Schiffes, Heizen der Probe aufgrund der Notwendigkeit von mehreren Strichen. Daher nutzt eine bevorzugte Methode der Lyse Stickstoff Kavitation, basiert auf Dekompression aus einer unter Druck stehenden Schiff16,17. Bei dieser Methode werden Zellen zuerst schwoll in den kalten Raum um die Zellen zu erweichen und machen sie anfälliger für Lyse. Wie sie in den Stickstoff Kavitation Gerät platziert werden ist ein Puffer mit Saccharose und Mannit hinzugefügt, um einen osmotischen Druck zu halten, der hilft, Mitochondrien intakt zu halten. Stickstoff Kavitation Gerät wird dann mit einem großen Volumen von Sauerstoff-freien Stickstoff, die in den Zellen löst sich unter Druck gesetzt. Da der Druck veröffentlichten stickstoffluftblasen aus Lösung Bersten der Zellmembranen ist. Diese Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber mechanischen homogenisierende Methoden, bei denen Scherspannungen und Reibung wie folgt: 1) keine externen körperlicher Belastung auf die Zellen wird vermieden; (2) eine adiabatische Expansion, die die Probe kühlt garantiert keine Hitzeschäden Organellen; (3) Zellbestandteile sind der inerte Stickstoff vor Oxidation geschützt; (4) keine pH-Wert-Änderung des Mediums Aussetzung; (5) das Verfahren ist einheitlich und reproduzierbar, da die gleichen störenden Kräfte in jeder Zelle und im gesamten Beispiel angewendet werden; (6) das Verfahren ist schnell und kann innerhalb von 20-30 Minuten abgeschlossen werden.
Isolation von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Geweben ist in der Literatur ausführlich beschrieben worden, und es basiert auf einem sanften Zellaufschluss, gefolgt von einer Reihe von differenziellen Centrifugations. Die meisten der aktuell verwendeten Protokolle folgen der ursprünglichen Verfahren entwickelt, in der Mitte des vorigen Jahrhunderts18. Während die grundlegenden biochemischen Ansätze korrekt sind, gibt es einige Missverständnisse, die in der Literatur hervorgehoben und unentdeckt blieb. Um das Protokoll für Mitoribosomes zu optimieren, wir systematisch untersucht die gemeldeten allgemeinen Grundsätze und feststellen, dass: 1) Einbeziehung der Mg2 + und+ K im Puffer ist nicht entscheidend. Es ist argumentiert worden, dass die KCl hilft zu verhindern, dass zytoplasmatischen Proteine bilden ein Gel19, jedoch eine ausreichende Verdünnung wie beschrieben in unserem Protokoll vorgesehen dieses Phänomen tritt nicht auf. Darüber hinaus eignet sich Ausschluss der Mg2 + , Verunreinigungen von cytoplasmatischen Ribosomen20zu reduzieren; (2) Es gibt keine Notwendigkeit, maximal mögliche Volumenverhältnis von Zellen zu Mittel-und die freigesetzten Organellen von der Hypo-osmotischen Umwelt zu schützen. Die osmotische in unserem Protokoll wird ausreichend unterstützt von Saccharose-haltige Puffer und die Verdünnung der Zellen mit Mitochondrien Isolierung Puffer (Schritt 2.II.5) ist entscheidend für die effiziente Trennung von Organellen in einer groß angelegten Zubereitung.
Der pH-Wert der Mitochondrien Isolierung Puffer liegt in der Nähe physiologischen Werte, d. h. 7.5, das ist auch der optimale pH-Wert für die folgenden Mitoribosome Vorbereitung. Bindemittel EDTA und EGTA werden hinzugefügt, um die Isolierung Medien kontaminierende Ionen Chelat und sie chelatkomplex freien Magnesium und Calcium, beziehungsweise. Es wurde diskutiert, dass die Einbeziehung von EDTA kann zur Beschädigung der inneren mitochondrialen Membran14führen, daher beschränkt sich die Konzentration auf 1 mM als Vorsichtsmaßnahme. Wir haben keinen Unterschied nicht beobachtet, bei 5 mM EDTA in der letzte Reinigungsstufe von Saccharose dichtegradient Verwendung.
Das Protokoll beschrieben verwendet hierin HEK293S abgeleitete menschliche Zellen für die Reinigung der Mitoribosome. Die Qualität der Zubereitung kann die gewonnene Probe biochemisch und strukturell zu atomarer Auflösung untersucht werden. Dies erlaubt es, die Methode auf menschlichen Mitoribosomal übersetzen komplexe, Qualitätskontrolle Baugruppen und Mitoribosomal Untereinheiten Zwischenprodukte anzuwenden. Darüber hinaus da Krebszellen OXPHOS-Kapazität und erhöhten mitochondrialen Protein Übersetzung im Vergleich mit benachbarten Stromazellen Gewebe21verstärkt haben, sind Mitoribosomes etablierten Drogeziele für Krebs22. Daher müssen unter Verwendung dieses Protokolls für die spezielle Reinigung der Mitoribosomes in Anwesenheit von Inhibitoren medizinische Anwendungen. Darüber hinaus sind Mitoribosomal Mutationen, mitochondriale Erbkrankheiten23verbunden worden. Da diese Mutationen direkte Auswirkungen auf die Struktur haben, ist der hier vorgestellte Ansatz für ihre strukturelle Charakterisierung nützlich. Das Protokoll kann experimentell erweitert und auf eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragen anzugehen, das grundlegende Verständnis der Übersetzung in den menschlichen Mitochondrien und ihre medizinische Bedeutung angewendet werden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der schwedischen Stiftung unterstützt für strategische Forschung (Future Leaders Grant FFL15:0325), Ragnar Söderberg Foundation (Fellowship in Medizin M44/16), schwedischen Forschungsrat (Starting Grant NT × 2015-04107), FEBS Long-Term Fellowship (SA) , H2020-MSCA-ITN-2016 Projekt 721757 (VS).
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate | Thermo Scientific | 31966-021 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 16000-044 | |
Blasticidin S HCl | Thermo Scientific | R210-01 | |
Zeocin selection reagent | Thermo Scientific | R25001 | 100 mg/ml |
Freestyle 293 Expression medium | Thermo Scientific | 12338026 | |
T175 tissue culture flask with vented cap | Sarstedt | 83.3912.002 | |
Shaker flasks with vented cap | Thermo Scientific | 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800 | |
250 ml conical bottle tubes, sterile | Corning | 430776 | |
Eve automated cell counter | NanoEnTek | E1000 | |
Nitrogen cavitation cell disruption vessel | Parr Instruments | 4635, 4639 | safety volume: 40ml, 600ml respectively |
Dnase (RNA-free) | HT Biotechnology | N401a | |
Teflon/glass dounce homogenizers | Cambridge Glassblowing Limited | Size designed upon request | |
SW40 tubes for mitochondria gradient | Beckman | 344060 | Polypropylene, thin wall |
Transfer pipettes | Sarstedt | 86.1171 | |
TLA 120.2 tubes for cushion | Beckman | 343778 | Polycarbonate, thick wall |
TLS-55 tubes for gradient | Beckman | 347356 | Ultra-clear |
Gradient Station IP | BioComp | 153-002 |