ミトコンドリアは、細菌や細胞質相手から乖離したリボソームを特化しました。HEK 細胞の彼らのネイティブのコンパートメントからの mitoribosomes の取得方法を紹介します。懸濁細胞からミトコンドリアの分離と mitoribosomes の結果として浄化メソッドが含まれます。
人間のミトコンドリアはミトコンドリアのゲノムによって符号化される酸化的リン酸化錯体の 13 重要な蛋白質成分を変換するリボゾーム (mitoribosomes) の専用セットを所有しています。人間 mitoribosomes により合成されたすべてのタンパク質は不可欠な膜蛋白質であるので、人間の mitoribosomes は、翻訳中にミトコンドリアの内膜に繋留します。ゾル性細胞質のリボソームにに比べ、mitoribosome 55 秒、半分の rRNA コンテンツ、ない 5 s rRNA および 36 のタンパク質の沈降係数があります。したがって、蛋白・ RNA の比率が高いと非定型構造を作る人間 mitoribosome のゾル性細胞質側から大幅に異なる。
生活に mitoribosome の中央重要性にもかかわらずプロトコルはありませんでしたひと細胞ラインからそのまま複合体を浄化します。伝統的に、mitoribosomes キログラムに必要なミトコンドリアの豊富な動物組織から分離した出発材料の。私たちは、栄養豊富な表現媒体で育つ HEK293 由来ひと細胞分裂におけるミトコンドリア、アクティブなミトコンドリア翻訳だろうし、したがって、構造および生化学的研究のための材料の適切な源になりうると判断mitoribosome。その構造を調べるためには、私たちは HEK 細胞からそのまま mitoribosomes の大規模な浄化のためのプロトコルを開発しました。ここより早くより伝統的な機械的せん断ベース方法セル換散のために労働集約的なより効率的な代替として窒素キャビテーション法を紹介します。これは、高解像度、そのまま人間の mitoribosome およびそのアセンブリの中間体の組成を明らかにその構造を決定するために許可されている mitoribosome の準備で起因しました。ここでは、我々 はこの仕事のフォロー アップと最大限に活用された現在し、のみ 10 〜10を要求するより費用効果的な方法は、HEK 細胞を培養しました。メソッドは、人間 mitoribosomal 翻訳複合体、変異体、品質コントロール アセンブリおよび mitoribosomal サブユニット中間体を浄化するために用いることができます。浄化できます線形スケール アップ 10 倍必要、また細胞の他のタイプに適用される場合。
ミトコンドリアのタンパク質合成の過程は、13 不可欠な mt-mRNAs から呼吸鎖の触媒中心を形成する特殊な膜に接続された mitoribosome によって変換されますに基づいています。変更されたミトコンドリアゲノムと co-translationally 膜に挿入する蛋白質の必要性は大幅にミトコンドリアのリボソーム1のアーキテクチャを形成しています。哺乳類の mitoribosome の最近の高分解能構造を示した細菌対応2,3に著しく異なる全体的な外観。特に、mt rRNA は二重削減、高分岐 〜 1 MDa 余分な分子固まり、貢献すること、少なくとも 36 ミトコンドリア特異的蛋白が追加されます。構造の再編成は、普遍的に保存4に一般に受け入れられた以前ほとんどすべての重要な機能を変更します。
Mitoribosomal サブユニットの 1 つずつ新しい主要な要素を取得されている、たとえば、小サブユニットはその ‘頭’ 地域に組み込みの GTPase 蛋白質 mS29 を組み込んでいます。GTPase 活性は他の翻訳システムで見つかっていないと構造は、gtp アーゼがサブユニット アセンブリ2の役割を必要があることを示します。中央の突起のコアを形成するすべての既知のリボソーム大サブユニットのランドマークと信じられていた 5S rRNA 哺乳類 mitoribosome に欠けているし、採用して mt tRNA ヴァル不可欠なビルディング ブロックとして代わりに2。禁止と同僚は、ブタの mitoribosome が mt tRNA Phe でことを示した、ない-ヴァル ・5。Chrzanowska Lightowlers、Minczuk と同僚これらのデータをフォロー アップに侵害された mt tRNA ヴァル安定患者から mitoribosomes 原則的に対応できる mt tRNA Phe6,7。なぜ、mitoribosomes は、これらの特定の要素とどのような経路、トランスに組み込まれている-の要因が必要これらのユニークなアセンブリは不明のまま。
全体的にみて、人間の mitoribosome、新しい蛋白質のコンポーネント、および mt tRNA の構造要素としてのユニークな関係の量として未知ミトコンドリア固有トランス –因子の関与を意味します。ただし、このシステムの機能の多くはミトコンドリア、8を調査することは困難されている伝統的、一意なので少し分子と品質制御メカニズムについて知られています。電子顕微鏡 (Cryoem)20による高分解能単粒子解析の発展に伴い、機会が今アセンブリ、アクション、および人間の品質管理の基礎となる分子機構の総合的な研究に生じるmitoribosome。中間の人間 mitoribosome アセンブリの最初の構造の私達のレポートそれは人間の mitoribosome の形成方法を視覚化することが可能、-70S が新しいトランス– の同定に尽力を示していますという認識を提供します。演技アセンブリの要因9を。
この初期の努力を拡大するには、詳細に人間 mitoribosome 浄化用高速プロトコルについて述べる.プロトコルの最初の部分では、懸濁細胞から純度の高い無傷ミトコンドリアの大規模な分離を説明します。この手順は 9 h が必要ですと簡単の変更および異なる種類の細胞とスケールに適応することができます。このプロトコルの重要なステップは、セルを割る時に窒素のキャビテーションの使用です。プロトコルの 2 番目の部分は、mitoribosomes を浄化するために開発されました。この手順は、7 h を必要とし、生化学的および構造的研究 mitoribosomes の十分な量が得られます。純粋なミトコンドリアの使用原料高品質の最終的な準備を提供しています、他のミトコンドリアの高分子に外挿することができます。
ミトコンドリアの豊富な源であることが知られている動物の組織の比較的容易な供給 mitoribosomes3,5,12、人気のある選択肢となりますが、開始材料は、のソースをについてください。 13, 遺伝的変更および実験室で簡単に再現できません。それ故に、均一に培養されたひと細胞ラインを含むプロトコルを開発するため明らかに実用的な必要性があります。主な違いプロトコル間組織と培養細胞への対処は散と均質化のモード。初代培養細胞単層として成長した、典型的なメソッドはテフロン/ガラス dounce 均質化14です。元の準備のプロトコル間効率的な小さなスケール15開発されました。500 mL の容量を持つホモジナイザーを用いたを直接スケーリングが可能な11、ただし、80% の換散を達成するために肉体労働の ~ 2 h が必要です。これは、少なくとも 3 つの問題を導入: 長い待ち時間による細胞内小器官、大型の容器の底に沈む重い材料による非均質な換散の集計複数のストロークの必要性のためのサンプルの加熱します。したがって、換散の望ましい方法は、減圧加圧容器16,17からに基づいている窒素キャビテーションを利用しています。この方法では、細胞は細胞を柔らかくし、溶解を起こしやすくために冷蔵室で膨らんだ最初。窒素キャビテーション デバイスに置かれるショ糖とマンニトールを含むバッファーがミトコンドリアをそのまま保つを助ける浸透圧を維持するために追加されます。窒素キャビテーション デバイスは、大量の細胞に溶解する酸素フリーの窒素と加圧されます。圧力は、細胞膜の破裂の結果解決からリリースされた窒素気泡です。このメソッドは、次のようにせん断応力と摩擦を含む機械の均質化方法にいくつかの利点を提供しています: 1) セルに任意の外部の物理的なストレスを避けなさい。2) サンプルを冷却する断熱膨張により細胞内小器官; への熱損傷はありません。3) 細胞成分が不活性窒素ガスによって酸化から保護されます。4) は pH 変動しない中断する培地の5) プロセスは均一で再現可能なサンプルとして全体と各セル内に同じ破壊的な力が適用されるので6) プロセスは、高速で 20-30 分以内に完了することができます。
培養細胞や組織からミトコンドリアの分離は広範囲、文献に記載されている、差動遠心シリーズに続く穏やかなセル中断に基づいています。現在使用されているプロトコルのほとんど前の世紀18途中で開発元の手順に従います。基本的な生化学的アプローチが間違っている文献で強調表示され、検出されないままでいくつかの誤解があります。我々 は体系的に報告された一般原則を検討し、結論 mitoribosomes のプロトコルを最適化する: 1) Mg2 +の包含とバッファーの K+は重要ではありません。KCl により細胞質蛋白質のゲル19、しかしの形成を防ぐためには、この現象は発生しません私たちのプロトコルに従って十分な希釈を提供それが主張されています。さらに、Mg2 +の除外は細胞質のリボソーム20; によって汚染を減らすために役に立つ2) 低浸透圧環境からリリースされた細胞小器官を保護するために媒体にセルの最大可能な容積比を維持する必要はありません。ショ糖を含むバッファー、およびミトコンドリア分離バッファーを持つセルの希釈によって私達のプロトコルで浸透圧のサポートを十分に提供 (2.II.5 ステップ) 大規模な準備のために器官の効率的な分離のため非常に重要です。
ミトコンドリア分離バッファーの pH に近い生理値、すなわち7.5 では、次の mitoribosome 準備のため最適な pH でもあります。彼らはそれぞれ自由なマグネシウムとカルシウムをキレートし、結合剤 EDTA とグリコールエーテルジアミン四酢酸は分離メディア汚染イオンをキレート化するために追加されます。EDTA の包含は14内ミトコンドリア膜の損傷につながることができます、したがって濃度は念のため 1 mM に限定されますが、議論されています。我々 はショ糖密度勾配の最終的な精製ステップで 5 mM EDTA を使用する場合はない任意の違いを観察しました。
説明されたプロトコルはここ、mitoribosome の精製 HEK293S 由来ひと細胞を使用します。準備の質では、得られたサンプル原子分解能を生化学的および構造的に調査することができます。これは人間の mitoribosomal 複合体、品質コントロール アセンブリ、および mitoribosomal サブユニット中間体に変換する方法を適用することができます。また、OXPHOS 容量と間質組織、隣接する21と比較して高いミトコンドリアのタンパク質翻訳にがん細胞が増幅されるので mitoribosomes がん22確立した薬のターゲットであります。したがって、阻害剤の存在下での mitoribosomes 特定の浄化のためこのプロトコルを使用してには、医療への応用があります。また、mitoribosomal の突然変異は遺伝性ミトコンドリア疾患23にリンクされています。これらの突然変異は、構造に直接影響を持っている、ので、ここで紹介した方法はその構造特性のため便利になります。プロトコルを実験的展開、さまざまな科学的な質問の人間のミトコンドリアにおける翻訳の基礎的な理解とその医療の重要性への取り組みに適用できます。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、戦略研究 (将来指導者助成金 FFL15:0325)、ラグナル協会財団 (交わり医学 M44/16)、スウェーデン研究評議会 (開始許可 NT × 2015 04107)、FEBS 長期フェローシップ (SA) のスウェーデンの財団によって支えられました。、H2020 MSCA-ITN 2016 プロジェクト 721757 (対)。
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate | Thermo Scientific | 31966-021 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 16000-044 | |
Blasticidin S HCl | Thermo Scientific | R210-01 | |
Zeocin selection reagent | Thermo Scientific | R25001 | 100 mg/ml |
Freestyle 293 Expression medium | Thermo Scientific | 12338026 | |
T175 tissue culture flask with vented cap | Sarstedt | 83.3912.002 | |
Shaker flasks with vented cap | Thermo Scientific | 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800 | |
250 ml conical bottle tubes, sterile | Corning | 430776 | |
Eve automated cell counter | NanoEnTek | E1000 | |
Nitrogen cavitation cell disruption vessel | Parr Instruments | 4635, 4639 | safety volume: 40ml, 600ml respectively |
Dnase (RNA-free) | HT Biotechnology | N401a | |
Teflon/glass dounce homogenizers | Cambridge Glassblowing Limited | Size designed upon request | |
SW40 tubes for mitochondria gradient | Beckman | 344060 | Polypropylene, thin wall |
Transfer pipettes | Sarstedt | 86.1171 | |
TLA 120.2 tubes for cushion | Beckman | 343778 | Polycarbonate, thick wall |
TLS-55 tubes for gradient | Beckman | 347356 | Ultra-clear |
Gradient Station IP | BioComp | 153-002 |